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1、10申请公布号CN104206416A43申请公布日20141217CN104206416A21申请号201410387400222申请日20140807A01N59/02200601A01P1/00200601A61L2/10200601A01N59/00200601A01N37/1620060171申请人浙江大学地址310027浙江省杭州市西湖区浙大路38号72发明人吴根福胡斌高海春74专利代理机构杭州天勤知识产权代理有限公司33224代理人胡红娟54发明名称硫化氢或其可溶性盐在协同增强消毒灭菌效果中的应用57摘要本发明公开了硫化氢或其可溶性盐在协同增强消毒灭菌效果中的应用，本发明通过用硫。
2、化氢熏蒸或浸泡待消毒的物品或器具，使物品或器具表面细菌的抗氧化类酶失活，避免抗氧化类酶对氧化剂的分解作用，再通过氧化剂的氧化胁迫使细菌死亡，此方法大大提高了微生物细胞的死亡率，增强了消毒灭菌的效果，缩短了消毒灭菌的时间。51INTCL权利要求书1页说明书6页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图4页10申请公布号CN104206416ACN104206416A1/1页21硫化氢或其可溶性盐在协同增强消毒灭菌效果中的应用。2如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述可溶性盐为硫化物或硫氢化物，所述硫化物或硫氢化物溶于水生成硫化氢。3一种消毒灭菌方法，其。
3、特征在于，用硫化氢气体熏蒸或硫化氢溶液浸泡待消毒的物品或器具一段时间后再进行消毒。4如权利要求3所述的消毒灭菌方法，其特征在于，所述消毒为采用消毒剂消毒或辐射消毒。5如权利要求4所述的消毒灭菌方法，其特征在于，所述消毒剂为氧化型消毒剂。6如权利要求5所述的消毒灭菌方法，其特征在于，所述消毒剂为过氧化氢、臭氧、二氧化氯、过氧乙酸或漂白粉中的一种或多种。7如权利要求6所述的消毒灭菌方法，其特征在于，所述消毒剂为过氧化氢。8如权利要求4所述的消毒灭菌方法，其特征在于，所述辐射消毒为紫外线消毒。9如权利要求3所述的消毒灭菌方法，其特征在于，所述熏蒸或浸泡的时间为不少于1分钟。10如权利要求3所述的消毒。
4、灭菌方法，其特征在于，所述硫化氢气体熏蒸或硫化氢溶液浸泡的硫化氢终浓度为014G/M3。权利要求书CN104206416A1/6页3硫化氢或其可溶性盐在协同增强消毒灭菌效果中的应用技术领域0001本发明涉及一种消毒剂，尤其涉及硫化氢或其可溶性盐在协同增强消毒灭菌效果中的应用。背景技术0002消毒和灭菌是微生物工作中最常用的技术之一。在医疗器械、药物、食品的生产和应用过程中，常要对实验环境、相关物品或整个车间进行消毒和灭菌。消毒灭菌的方法有多种，相当一部分是基于氧化胁迫促使微生物细胞死亡。如过氧化氢、高锰酸钾等氧化剂的杀菌，氯气及次氯酸钙漂白粉等卤素化合物的消毒，甚至紫外消毒及伽玛辐射杀菌也与氧。
5、化胁迫使微生物细胞死亡有关。0003氧化胁迫之所以能使微生物细胞死亡，是由于氧化胁迫下能产生活性氧ROS。活性氧包括多种组分，其中反应活性最高的是羟自由基HO，由于细菌细胞内有许多含铁蛋白，这些蛋白在受到氧化攻击后会释放FE2，继而与H2O2反应生成HO。虽然HO寿命很短，但其化学反应活性极高，可以和细胞内几乎所有大分子物质如蛋白质、DNA、RNA和脂质进行反应，将这些生物大分子氧化，造成细胞的损伤和死亡。0004为了对抗来自于外界或者自身代谢产生的各类活性氧，细菌进化出了多种应对途径。其中最重要的是细胞可产生一系列能分解H2O2的过氧化氢酶。胞内H2O2的清除主要是由过氧化氢酶和过氧化物酶来。
6、完成。在大肠杆菌ECOLI等许多细菌中，AHPCF是主要的过氧化氢清除酶。AHPC对H2O2具有很高的亲和力，即使有氧条件下产生H2O2的速率高达15M/S，AHPCF也可以将大多数H2O2分解，使细胞内的H2O2稳定在20NM之内。但是若当细菌所处的环境H2O2浓度超过20M时，由于H2O2可轻易穿过细胞膜，致使细胞内的H2O2量超过了AHPC的承受范围，使AHPC中的半胱氨酸残基氧化为亚磺酸而失活。另外，AHPCF清除H2O2需要消耗大量的NADH，会使细胞的能量负荷过大。为此，细胞进化出另外一类过氧化氢酶。0005当H2O2的量超出一定水平就使细胞处于氧化态，这种氧化态可被某些蛋白的半胱。
7、氨酸残基感知，如ECOLI中的氧化胁迫应答蛋白OXYREC就可以感应纳摩尔级的H2O2。ECOLI中受OXYREC调控的与氧化应答相关的基因主要有过氧化氢酶KATG，烷基过氧化氢还原酶AHPCF，谷氧还蛋白GRXA，谷胱甘肽还原酶GORA，铁平衡的阻遏蛋白FUR以及DNA保护基因DPS和RNA调控基因OXYS。KATG是受H2O2诱导后所表达的最主要的H2O2清除酶，它是一种双功能酶，既有过氧化氢酶的活性又有过氧化物酶的活性。KATG与H2O2结合的KM值较高，即使是毫摩尔级别的H2O2也不会使得其达到饱和；另外由于它不像AHPC那样需要其它还原系统的辅助，因而不会受制于细胞内NADH的缺乏。。
8、由于细胞内AHPCF和KATG的存在，使得微生物对外界的氧化应激状态具有较强的抵抗能力。有时在较高的氧化压力下仍不能被杀灭。所以仅依靠单一的氧化型杀菌剂进行消毒杀菌是无法提高杀菌效果的，寻找一种组合的杀菌试剂提高氧化型杀菌剂的杀菌效果，将成为提高杀菌剂杀菌效果的有效手段。说明书CN104206416A2/6页40006公布号为CN102698309A的专利公开了一种无菌室的快速、高效及环保的灭菌方法，该方法是将要灭菌的空间清理干净，将配置好的二氧化氯溶液经2030分钟活化后，对工作的空间进行喷雾处理，再让雾滴从空间高处自然降落，喷雾处理后立即封闭处理空间1H到3H，然后进入空间正常使用。发明内。
9、容0007本发明发现硫化氢能够抑制过氧化氢酶的活力，与过氧化氢协同能够抑制细菌生物膜的形成，对细菌生长有明显抑制作用。0008基于以上发现，本发明提供了硫化氢或其可溶性盐在协同增强消毒灭菌效果中的应用。0009所述可溶性盐是指水溶性的硫化物或硫氢化物，所述硫化物或硫氢化物在溶于水后能够生成硫化氢。0010所述增强消毒灭菌效果是指硫化氢或其可溶性盐与其它消毒方式共同作用于待消毒物品或器具，以减少物品或器具表面的细菌残留。硫化氢或其可溶性盐与其它消毒方式，可以同时施加，也可以先后施加，最好是先用硫化氢或其可溶性盐处理，然后再采用其它进行消毒。0011本发明还提供了一种消毒方法，用硫化气体熏蒸或硫化。
10、氢溶液浸泡待消毒的物品或器具一段时间后再进行消毒。0012所述消毒是指采用消毒剂消毒或辐射消毒。0013所述消毒剂可以是氧化型消毒剂，如过氧化氢、臭氧、二氧化氯、过氧乙酸、漂白粉，优选为过氧化氢。0014所述辐射消毒可以是紫外线消毒、微波消毒或射线消毒。0015所述消毒剂消毒或辐射消毒均是采用现有的常规方法。0016所述熏蒸或浸泡的时间为不少于1分钟。0017所述硫化氢气体熏蒸或硫化氢溶液浸泡的硫化氢终浓度为014G/M3。0018本发明通过将硫化氢熏蒸或浸泡待消毒的物品或器具，使物品或器具表面细菌的抗氧化类酶失活，避免抗氧化类酶对氧化剂的分解作用，再通过氧化剂的氧化胁迫使细菌死亡，此方法大大。
11、提高了微生物细胞的死亡率，增强了消毒灭菌的效果，也缩短了消毒灭菌的时间。附图说明0019图1为实施例1不同浓度硫化氢与过氧化氢组合对奥奈德希瓦氏菌的生长抑制曲线。00201对照加等量无菌水；201MMH2S；3025MMH2O2；4125MH2S025MMH2O2；525MH2S025MMH2O2；650MH2S025MMH2O2。0021图2实施例2为不同浓度硫化氢与过氧化氢组合对铜绿假单胞菌协同杀菌的效果图。002210MNA2S025MMH2O2；210MNA2S025MMH2O2；320MNA2S025MMH2O2；450MNA2S025MMH2O2；5100MNA2S025MMH2O。
12、2。说明书CN104206416A3/6页50023图3为实施例3不同浓度硫化氢与不同过氧化氢组合对奥奈德希瓦氏菌协同杀菌的效果图。0024深黑柱从左到右01MMH2S0；0125MM；025MM；05MM和1MMH2O2。0025浅黑柱从左到右0；0125MM；0025MM；005MM和01MMH2S025MMH2O2。0026图4为实施例4硫化氢与过氧化氢对枯草芽孢杆菌生长的协同影响曲线，A摇瓶培养；B静止培养。0027图5为实施例5硫化氢与过氧化氢对大肠杆菌生长的协同影响曲线，A摇瓶培养；B静止培养。0028图6为实施例6不同浓度硫化氢对奥奈德希瓦氏菌过氧化氢酶相对活力的影响柱形图。00。
13、29图7为实施例6不同浓度硫化氢对小牛肝脏过氧化氢酶相对活力的影响曲线。0030图8为实施例7中24孔板添加NA2S和H2O2后抑制生物膜形成的照片。0031图9为实施例7不同浓度硫化氢与过氧化氢组合对细菌生物膜形成的协同影响曲线。具体实施方式0032实施例1硫化氢与过氧化氢对奥奈德希瓦氏菌生长的协同抑制作用0033奥奈德希瓦氏菌SONEIDENSIS在LB培养基酵母提取物05，蛋白胨1，NACL05，PH72中30200RPM培养过夜，将01ML培养物接入37MLLB培养基中，再加01MLNAHS溶液和01MLH2O2对照用水代替，使总体积为4ML。实验平行设置6组，每组3个重复。除一组空白。
14、对照加02ML无菌水和2组单一对照分别为01MMH2S和025MMH2O2外，3组协同实验H2S和H2O2的终浓度分别为125MH2S025MMH2O2、25MH2S025MMH2O2和50MH2S025MMH2O2。加样后统一在30，200RPM下培养，每小时测定培养物在600NM的吸光度OD600，结果平均值如图1所示。0034可以看出，单独添加H2S和H2O2抑菌效果很差，但H2S和H2O2同时存在抑菌效果明显增强，而且随着H2S浓度的提高，抑菌效果也随之增强，当H2S浓度增加到50M时，基本抑制了奥奈德希瓦氏菌的生长。0035实施例2硫化氢与过氧化氢对铜绿假单胞菌的协同杀菌作用0036。
15、铜绿假单胞菌37200RPM培养至OD60002，吸100L，加至880L无菌生理盐水中，再加10LNA2S溶液和10LH2O2，使总体积为1ML，实验平行设置5组，每组3个重复。5组实验的硫化氢终浓度分别为0、00125MM、0025MM、005MM和01MM，加入NA2S溶液并摇匀后，马上加入H2O2，并使其终浓度都为025MM。摇匀后，30恒温箱中处理30分钟，冰上冷却，马上进行梯度稀释，并将102，103，104，105，106的稀释液各5L点到LB平板上，在30恒温箱中培养20小时，具体结果如图2所示。0037可以看出，单独使用H2O2，杀菌效果欠佳，但随着H2S浓度的提高，硫化氢与。
16、过氧化氢对铜绿假单胞菌的协同杀菌效果越来越强，当H2S浓度达到100M，几乎完全杀灭了铜绿假单胞菌。0038实施例3硫化氢与过氧化氢对奥奈德希瓦氏菌的协同杀菌作用0039奥奈德希瓦氏菌30200RPM培养至OD600035，吸100L，加至880L无菌生说明书CN104206416A4/6页6理盐水中，再加10LNAHS溶液和10LH2O2，使总体积为1ML，实验平行设置10组，每组3个重复。其中5组的硫化氢终浓度分别为0、00125MM、0025MM、005MM和01MM，H2O2的终浓度都为025MM。另外5组的硫化氢浓度固定为01MM终浓度，H2O2终浓度分别设置为0、0125MM、02。
17、5MM、05MM和1MM，摇匀后，在30恒温箱中处理30分钟，冰上冷却，马上进行梯度稀释并吸104，105，106的稀释液各01ML涂布在LB平板上，30恒温箱中培养24小时后计数单菌落，并计算细菌的存活力，具体结果如图3所示。0040可以看出，单独使用H2O2，杀菌效果不佳，但随着H2S浓度的提高，硫化氢与过氧化氢对奥奈德希瓦氏菌的杀菌效果越来越强。0041实施例4硫化氢和过氧化氢对枯草芽孢杆菌的生长抑制作用0042枯草芽孢杆菌BACILLUSSUBTILIS在LB培养基中37200RPM培养过夜，01ML培养物接种至37MLLB培养基中，再加10LNAHS溶液和10LH2O2，使总体积为4。
18、ML，实验平行设置4组，每组3个重复。空白对照加20LH2O，单因子对照各加10LH2O，实验中H2S和H2O2的终浓度分别为005MM和1MM。混匀后在37下静止或摇瓶200RPM培养，每小时测定生长量OD600，具体结果平均值如图4所示。0043由图4可知，枯草芽孢杆菌对过氧化氢不太敏感，而对硫化氢较敏感，对这类抗氧化能力较强的菌株，先用硫化氢处理，可增加其对氧化剂的敏感性。0044实施例5硫化氢和过氧化氢对大肠杆菌的生长抑制作用0045大肠杆菌ECOLI在LB培养基中37200RPM培养过夜，01ML培养物接种至37MLLB中，再加10LNAHS溶液和10LH2O2，使总体积为4ML，实。
19、验平行设置4组，每组3个重复。空白对照加20LH2O，单因子对照各加10LH2O，实验中H2S和H2O2的终浓度分别为005MM和1MM。混匀后在37下静止或摇瓶200RPM培养，每小时测定生长量OD600，具体结果平均值如图5所示。0046由图5可知，单独使用H2S或H2O2对大肠杆菌的抑菌效果较差，说明大肠杆菌对H2S和H2O2都不敏感，两者混合使用时对大肠杆菌的抑菌效果明显增强，静止培养时抑菌效果更明显。0047实施例6硫化氢抑制过氧化氢酶活性0048奥奈德希瓦氏菌200RPM30C摇瓶培养4小时至OD600045，实验平行设置6组，每组3个重复。吸4ML培养液，磷酸缓冲液离洗后，加1M。
20、L磷酸缓冲液，超声破碎细胞工作3秒，间隙4秒，20循环，离心后，取上清液粗酶液180L，加入10LNAHS溶液和10LH2O2，使总体积为200L，其中的H2S浓度分别为0M、125M、25M、50M、100M和200M，H2O2为500M。30保温30MIN后，离心，加1500LFOX1试剂，混匀后室温反应30分钟，测OD560H2O2与FOX1试剂反应，H2O2越多，OD560越高，求剩余的过氧化氢。根据消耗的H2O2量，计算过氧化氢酶的相对活力，结果见图6。0049由图6可知，硫化氢可以显著抑制细菌内过氧化氢酶的活力，从而减少过氧化氢酶对过氧化氢的降解，减少溶液中过氧化氢浓度的降低。00。
21、50用小牛肝过氧化氢酶标准品购自生物工程公司代替细菌的细胞提取液，其余操作同上，检测平均值结果如图7所示。0051由图7可知，初始溶液中的H2O2为500M，经一定时间反应后，溶液中残余的过氧化氢A560与硫化氢浓度成正比，说明硫化氢显著抑制小牛肝过氧化氢酶，50M的硫化氢说明书CN104206416A5/6页7几乎完全抑制小牛肝过氧化氢酶活力。0052实施例7硫化氢与过氧化氢协同抑制细菌生物膜的形成00532MLLB培养基加至24孔板中，每孔中按图8所示加入NA2S和H2O2溶液，使每孔的H2S和H2O2的终浓度达到设定值，在室外自然环境中暴露30分钟，30培养24小时后拍照，并收获形成的生。
22、物膜，加无菌水2ML后混匀，测定膜的生物量OD600，结果平均值见图9。0054由图8和图9可知，在不添加H2O2的情况下，H2S对生物膜的形成没有抑制作用，而添加H2O2后，随着H2S浓度的提高，对细菌生物膜的生成，抑制作用越强。同样，在不添加H2S的情况下，H2O2对生物膜的形成没有抑制作用，而添加H2S后，随着H2S浓度的提高，对细菌生物膜的抑制作用越强。0055实施例8硫化氢与过氧化氢协同处理对无菌室的消毒效果0056在容积为50M3的无菌室中，先采用4G/M3硫化氢对无菌室进行处理并维持10分钟，再采用10G/M3过氧化氢蒸汽处理并维持60分钟，结束后通入无菌空气10分钟，将无菌LB。
23、平板暴露于无菌室30分钟后，在30的恒温箱中培养24小时，检测LB平板中的菌落数，以仅采用10G/M3过氧化氢蒸汽维持60分钟的消毒方式作对照，评价两种处理的消毒杀菌效果，每种处理平行设置三组试验，求平均数，结果如表1所示。0057表1硫化氢与过氧化氢协同处理对无菌室的消毒效果00580059由表1可知，在硫化氢和过氧化氢的协同作用下无菌室的消毒杀菌效果明显优于仅用过氧化氢消毒的效果。0060实施例9硫化氢与气态氧化剂协同处理对超净间物品的消毒效果0061在容积为约12M3、温度为25的超净间中，堆放待消毒灭菌的培养皿，试管和橡胶管，先采用01G/M3硫化氢对超净间进行处理并维持10分钟，再采。
24、用5G/M3气态氧化剂处理并维持30分钟，结束后通入无菌空气10分钟，上述气态氧化剂分别采用过氧化氢蒸汽、臭氧蒸汽、过氧乙酸蒸汽和二氧化氯蒸汽，以仅采用气态氧化剂的消毒方式作对照。结束后，用50ML无菌水反复50次冲洗这些灭菌物品，然后将洗涤水混入450ML保温于55的LB固体培养基中，混匀后倒平板，每皿25ML，将平板在30的恒温箱中培养24小时后，检测20个LB平板中的总菌落数，以评价消毒杀菌效果，每种处理平行设置三组试验，求平均数，结果如表2所示。0062表2不同消毒剂与硫化氢协同对超净间物品的消毒效果比较0063说明书CN104206416A6/6页80064由表2可知，在硫化氢和气态。
25、氧化剂组合下超净间消毒的杀菌效果优于单用气态氧化剂消毒的灭菌效果。0065实施例10硫化氢与紫外线协同处理对超净工作台的消毒效果0066超净工作台容积约1立方米，分别用紫外照射30分钟和10ML001MM硫化氢喷雾后，再用紫外照射30分钟处理，同上用平板暴露法检测消毒杀菌效果，每种处理平行设置三组试验，求平均数，结果见表3。0067表3硫化氢与过氧化氢协同处理对超净工作台的消毒效果0068处理菌落数1菌落数1菌落数1平均紫外照射30分钟20281621001MM硫化氢紫外照射30分钟02110069由表3可知，硫化氢也可以增强紫外线的消毒灭菌效果。0070实施例11硫化氢与漂白粉协同处理对餐具。
26、的消毒效果0071饭盒用5漂白粉浸泡20分钟处理和100M硫化氢溶液中浸泡5分钟后再用5漂白粉浸泡15分钟处理，处理后用100ML无菌生理盐水冲洗两次，加10ML无菌生理盐水震荡，收集荡洗后的生理盐水并将它富集于微孔滤膜，贴于LB平板上，培养后检测消毒杀菌效果，每种处理平行设置三组试验，求平均数，结果见表4。0072表4硫化氢与漂白粉协同处理对餐具的消毒效果0073处理菌落数1菌落数1菌落数1平均漂白粉48323538100M硫化氢5漂白粉浸泡75870074由表4可知，硫化氢可以增强漂白粉的消毒灭菌效果。说明书CN104206416A1/4页9图1图2说明书附图CN104206416A2/4页10图3图4说明书附图CN104206416A103/4页11图5图6图7说明书附图CN104206416A114/4页12图8图9说明书附图CN104206416A12。