用于检测氟苯尼考的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒技术领域
本发明属于兽药残留分析和免疫学技术领域，具体涉及一种能识别氟苯尼考的单克
隆抗体，以及用于检测氟苯尼考的酶联免疫方法(ELISA)与试剂盒。
背景技术
氟苯尼考属于氯霉素类化合物，主要用于治疗动物呼吸道和肠道感染。氟苯尼考有
一定的胚胎毒性，中国、美国、日本及欧盟等许多国家和组织都规定了其在动物组织中
的最大残留限量。目前仪器分析的方法虽然能够达到对氟苯尼考的检测要求，但是仪器
昂贵、样品前处理繁琐、对操作人员要求也很高。免疫化学分析法特别是酶联免疫吸附
分析技术具有快速、灵敏度高、操作简单、适应性强等优点，适合高通量样品筛选，与
仪器检测方法相比，ELISA方法更具优势。
酶联免疫吸附法是以抗原抗体的特异性反应原理进行检测的生物技术，由于它是一
种简单、灵敏度高、特异性好的检测方法，因此得到了广泛的应用。目前国内外已有关
于氟苯尼考抗体制备方法的报道：Luo(2009)建立了检测猪肉中的氟苯尼考和氟苯尼考胺
的残留方法，以氟苯尼考胺为半抗原，采用甲醛偶联法进行免疫原合成，得到了一株可
以识别氟苯尼考和氟苯尼考胺的多克隆抗体。孙法良等(2009)建立了鸡肉当中氟苯尼考
的残留检测方法，以氟苯尼考琥珀酸酐为半抗原，通过琥珀酸酐法合成免疫原，得到了
一株多克隆抗体，对氟苯尼考IC50为79.3μg/L。冯才茂等(2012)以氟苯尼考胺为半抗原，
采用碳二亚胺法合成完全抗原，制备的多克隆抗体最低检测限为0.5μg/L，对氟苯尼考
交叉反应率为150％。朱爱荣等(2015)以氟苯尼考胺为半抗原，通过戊二醛法合成抗原，
最终获得了能够识别氟苯尼考的多克隆抗体。沈建忠等(2008)申请了一种检测氟苯尼考
及氟苯尼考胺的方法及其专用酶联免疫试剂盒的专利，以氟苯尼考胺为半抗原，通过
EDC方法合成免疫原，最终获得了能够同时识别氟苯尼考和氟苯尼考胺的多克隆抗体。
深圳市绿诗源生物科技有限公司于2009年申请了一种氟苯尼考类药物快速检测试剂盒
的专利，其中以氟苯尼考琥珀酸酐作为半抗原，通过混合酸酐法合成免疫原，通过免疫
小鼠或者新西兰大白兔从而获得能够识别氟苯尼考的单克隆抗体或者多克隆抗体。由上
可见，目前文献报道的多为多克隆抗体，多克隆抗体虽然灵敏度较高，但是批间变异大，
没有单克隆抗体性质稳定。另外，现有的单克隆或多克隆抗体识别的专属性和灵敏度较
低，无法特异性地识别氟苯尼考，且识别的IC50过高。
发明内容
本发明的目的为：
(1)提供一种能特异性识别氟苯尼考的单克隆抗体；
(2)提供所述单克隆抗体在制备检测氟苯尼考药物残留的酶联免疫试剂盒中的应
用；
(3)提供一种含有所述单克隆抗体的酶联免疫试剂盒；
(4)提供所述酶联免疫试剂盒在氟苯尼考药物残留非诊断目的检测中的应用；
(5)利用该单克隆抗体，建立一种氟苯尼考药物残留非诊断目的检测的ELISA方
法；
(6)提供一种所述的ELISA方法在氟苯尼考药物残留非诊断目的检测中的应用。
上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种能识别氟苯尼考单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCNO:C201548的杂交瘤
细胞株FF/7A8所分泌的。
所述的杂交瘤细胞株FF/7A8，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC
NO:C201548。
所述的单克隆抗体是以氟苯尼考胺(FFA)与琥珀酸酐(HS)反应后得到的氟苯尼
考胺半琥珀酸酯(FFA-HS)与载体蛋白偶联得到的偶联物作为免疫原制备得到的。本
发明优选的免疫原载体蛋白是血蓝蛋白(KLH)。
所述的单克隆抗体可用于制备检测氟苯尼考的酶联免疫试剂盒。
一种包含所述的单克隆抗体的试剂盒，该试剂盒是检测氟苯尼考药物残留的酶联免
疫试剂盒。
所述的试剂盒可用于氟苯尼考药物残留非诊断目的的检测。
本发明进一步提供一种氟苯尼考药物残留的非诊断目的酶联免疫检测方法，该方法
包括以下步骤：
(1)将氟苯尼考胺(FFA)与琥珀酸酐(HS)反应后的氟苯尼考胺半琥珀酸酯
(FFA-HS)与载体蛋白偶联，将得到的偶联物作为免疫原；
(2)将氟苯尼考胺(FFA)与载体蛋白偶联得到包被原；
(3)用步骤(1)的免疫原制备得到保藏号为CCTCCNO:C201548的杂交瘤细胞
株FF/7A8；
(4)用保藏号为CCTCCNO:C201548的杂交瘤细胞株FF/7A8制备单克隆抗体；
(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；
(6)样品处理和检测。
优选地，免疫原载体蛋白是血蓝蛋白(KLH)，包被原载体蛋白是卵清白蛋白(OVA)。
本发明的有益效果是：
1、本发明在抗体制备时，采用氟苯尼考胺与琥珀酸酐反应，得到氟苯尼考胺半琥
珀酸酯，将其作为半抗原并与载体蛋白偶联后作为免疫原，由该免疫原制备的单克隆抗
体能够特异性地识别氟苯尼考。
2、本发明的试剂盒和酶联免疫检测方法可用于检测动物性食物如猪肉、鸡肉、鱼、
猪肝脏和鸡肝脏中的氟苯尼考药物残留，而且检测灵敏度、准确度高，精密度好，IC50
值仅为0.21±0.02μg/L。
3、本发明所涉及的检测方法简单，易操作，检测成本低，对操作者身体健康危害
相对较小。
附图说明
图1为本发明的单克隆抗体与氟苯尼考标准品的间接竞争ELISA反应曲线图，X
轴为氟苯尼考(FF)标准溶液浓度对数值，Y轴为氟苯尼考标准品溶液的光密度值除以
“零”孔光密度值(B/B0)。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
实施例1免疫原和包被原的制备
1.3氟苯尼考胺半琥珀酸酯与血蓝蛋白偶联物(FFA-HS-KLH)的制备
称取氟苯尼考胺(FFA)247mg(1mmol)，BOC酸酐218mg(1mmol)，
Na2CO3106mg(1mmol)于50mL圆底烧瓶中，加入二氯甲烷10mL，室温反应过夜。过滤，
除掉Na2CO3，然后加入琥珀酸酐200mg(2mmol)，三乙胺1mL，60℃油浴条件下，回流
反应1d。蒸干除掉二氯甲烷，加三氟乙酸2mL，室温水浴反应2-4h，待反应完全滴加
三乙胺调中性，用乙酸乙酯洗涤2-3次，合并有机相，无水硫酸镁脱水后，蒸干得到黄
色油状物，即半抗原氟苯尼考胺半琥珀酸酯(FFA-HS)。反应式如下：
称取氟苯尼考胺半琥珀酸酯69.4mg，溶于1mLDMF中，加入DCC60mg和N-羟
基琥珀酰亚胺(NHS)34.6mg，室温避光反应8h，反应完全过滤得到A液。取3mLKLH
溶于3mLPBS中，为B液。冰浴条件下，将A液缓慢滴加到B液中，4℃反应8-10h。
将产物装入透析袋内，4℃条件下用PBS透析5d，每天更换透析液3次。得到的即为
FFA-HS-KLH。
1.4氟苯尼考胺卵清白蛋白偶联物(FFA-EDC-OVA)的制备
称取氟苯尼考胺24.7mg，溶于100μLDMF中为A液。称取40mgOVA溶于6mLPBS
中，为B液。将A液缓慢滴加到B液中，然后加入EDC16mg和NHS12mg。室温反
应过夜。将反应物装入透析袋内，4℃用PBS透析5d，每天更换透析液3次。得到的即
为完全抗原FFA-EDC-OVA。反应式如下：
实施例2单克隆抗体的制备
2.1动物免疫
利用发明人所在的国家兽药残留基准实验室制备的免疫原(FFA-HS-KLH)免疫
Balb/C小鼠(购自湖北省医学科学院实验动物中心)。免疫程序是取含FFA-HS-KLH偶联
物50～100μg的蛋白溶液与佐剂等量混合后注入小鼠体内，使其产生特异性血清。
2.2细胞融合和克隆化
参照杨汉春《动物免疫学》，利用发明人所在国家兽药残留基准实验室制备的
FFA-HS-KLH免疫原免疫Balb/C小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心实验动物中心)，
免疫程序为：基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点
注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化。最后于融合前三天(最好
于免疫结束后休整1月)腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。
融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性
血清)，在75％酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏，分离出脾细胞，与新鲜制备
的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞来自本实验室)按1～2×107个SP2/0与108个免疫
脾细胞(1:10～1:15)的比例于50mL离心管，用15mLRPMI-1640基础液重悬细胞，
1500r/min离心5min，洗细胞1次。离心的间隙将温浴的培养基，温浴的水，温浴的聚
乙二醇(PEG)等放入超净台。然后取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞和免疫脾细
胞的离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上控干水滴，轻敲管底使细胞松动。打开计时器，
用1mL吸管吸取0.8mLPEG，手持装有混合细胞的离心管，将其放置在水浴中片刻，将
PEG缓慢的滴加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，1min内加完，持续搅拌30s。用吸管
取10mL基础液，沿管壁缓慢加到融合细胞上，边加边轻轻摇动(不能吹打)，5min内
分别加1mL，2mL，3mL，4mL，最后补加基础液到40mL，加完后，盖上盖子，反复
颠倒几次，使细胞混匀。800r/min5min离心，弃上清。吸取含有饲养细胞的HAT培养
基，用吸管将离心管中的融合细胞轻轻搅拌起来，液面附近逐滴滴入到含饲养细胞的血
清瓶中，搅拌混匀，动作要轻将细胞轻轻搅拌起来，千万不要吹打。颠倒混匀。然后将
细胞接种在细胞培养板上，每孔两滴，置于培养箱中培养。一次融合可接种4～6块96
孔板。根据需要也可少种，一般按SP2/0的细胞数计算，每孔接种量约含104左右个SP2/0
细胞。于37℃，5％CO2培养箱中培养。
融合当天记为第0d，前3d尽量不要移动细胞，第3d每孔补加1滴1％HAT完全培
养基，观察集落生长情况。第5d每孔吸出100μL上清，再补加2滴0.5％HAT完全培
养基，继续跟踪观察融合细胞。
待融合细胞集落长至培养孔1/10～1/5，同时用建立的间接ELISA方法进行筛选。
与零药物孔相比，药物孔OD值能被抑制的判为阳性。根据抑制率和细胞集落生长状况，
选择2～6个强阳性的仅有1-2个单集落的细胞孔，采用有限稀释方法进行克隆化。
经过3～4次克隆，最终筛选出分泌抗氟苯尼考药物抗体的单克隆杂交瘤细胞株，
申请人将其命名为FF/7A8，并于2015年4月24日送位于湖北省武汉市武汉大学内的
中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCCNO:C201548。对该细胞
系进行了染色体计数，结果显示，SP2/0的染色体数为62～68条，脾细胞染色体为40
条，而杂交瘤细胞的染色体数目平均值为102.8条，说明融合细胞的确是SP2/0细胞与
脾细胞的杂交产物。将该细胞株经腹腔注射Balb/C小鼠，生产单克隆抗体。采用购自
ThermoSxientific公司的鼠单克隆抗体(Monoclonalantibody,Mab)快速ELISA同型试剂
盒对本发明所得到的单克隆抗体的亚型和轻链进行鉴定，结果为小鼠IgG1亚型。
实施例3氟苯尼考间接竞争ELISA检测方法的建立
3.1试剂的配制(本实施例使用的试剂除另注明外均采用以下方法配制)
磷酸盐缓冲液：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4.12H2O2.9g，KCl0.2g，加双蒸
水至1000mL，调节pH至7.4；
包被液：取Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，加三蒸水至1000mL，调节pH值至9.6；
洗涤液：NaCl8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KCl0.2g，Tween200.5mL，
加双蒸水至1000mL，调节pH至7.4；
封闭液：卵清蛋白1g溶于100mL磷酸盐缓冲液中；
底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至
1000mL；
底物液B：Na2HPO414.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢脲6.4mL，加双蒸水至
1000mL；
底物混合液：将A液和B液按体积比1:1混合即得，现配现用；
终止液：2mol/L硫酸溶液。
3.2包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定
选择上述合成的FFA-EDC-OVA作为包被原，用包被液稀释成8mg/L、4mg/L、
2mg/L、1mg/L、0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0.0625mg/L8个浓度，在96孔酶标
板，从第一至第八列依次加入，4℃过夜；洗涤3次，拍干，加入封闭液200μL，37℃
封闭60min；洗涤3次，拍干，在酶标板的第一行至第八行依次加入100μL磷酸盐缓冲
液稀释的稀释倍数为15000、30000、60000、120000、240000、480000、960000、1920000
的单克隆抗体，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干；各孔加入1:5000倍磷酸盐缓冲液稀
释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(简称二抗，以下所指二抗均为HRP标记的羊抗鼠IgG
抗体，购自武汉飞弈生物技术有限公司)100μL，37℃孵育30min，洗涤5次，拍干；各
孔加入100μL底物混合液，避光显色15min，加入50μL终止液，用自动酶标仪在450nm
波长处测定光密度值(OD值)，结果见表1。
结果表明，初步确定包被原FFA-EDC-OVA的包被浓度为1mg/L或0.5mg/L，抗体
工作浓度为1:240000或1:120000。
表1包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定
3.3最佳包被原浓度和抗体工作浓度的确定
以初步确定的包被原FFA-EDC-OVA包被浓度，设置1mg/L、0.5mg/L2个浓度包被酶
标板。将氟苯尼考用磷酸盐缓冲液稀释成0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0.1μg/L、0.05μg/L、
0μg/L6个浓度，分别将1:240000和1:120000磷酸盐缓冲液稀释的单克隆抗体(因为作间接
竞争ELISA时，单克隆抗体的加样体积减小了一半，相应地单克隆抗体稀释度减小一半)
和上述氟苯尼考溶液各加50μL进行间接竞争ELISA。以氟苯尼考浓度对数值作为横坐标，
以氟苯尼考标准溶液的OD值与“零”孔OD值的比值(B/B0)作为纵坐标绘制抑制曲线，
选择线性较佳、产生50％抑制时氟苯尼考浓度(IC50)较低者作为包被浓度。以最佳包被原
浓度包被酶标板，将氟苯尼考稀释成0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0.1μg/L、0.05μg/L、0μg/L
6个浓度，将抗体以中心浓度1:240000等差设置4个稀释度，单克隆抗体和系列浓度氟苯
尼考标准溶液各加50μL进行间接竞争ELISA，绘制抑制曲线，选择线性较佳、IC50值较
低者作为最佳抗体工作浓度。结果见表2和表3。
表2最佳包被原浓度优化
包被原浓度
抗体稀释倍数
0孔OD
IC50值
0.5
160000
2.236
0.37
1
240000
2.147
0.23
表3最佳抗体稀释度优化
抗体稀释倍数
0孔OD
IC50(μg/
230000
2.398
0.33
240000
2.133
0.21
250000
1.995
0.31
260000
1.634
0.42
结果表明，包被浓度为1mg/L，抗体稀释度为1:240000时，其IC50最低。
3.4标准曲线的建立
将氟苯尼考用磷酸盐缓冲液配制成0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0.1μg/L、0.05μg/L、
0μg/L6个系列浓度，每个浓度重复5孔，按照间接竞争ELISA方法测定，重复测定5
次。以氟苯尼考溶液浓度的对数值为横坐标，B/B0为纵坐标绘制标准曲线，求出IC50。
本试剂盒的IC50值为0.21±0.02μg/L。
3.5交叉反应试验
将氯霉素类药物用磷酸盐缓冲液配制成适当浓度，用建立的ELISA方法测定各药
物的IC50值，每个药物3个复孔，以单克隆抗体对氟苯尼考的交叉反应率为100％，利
用公式1计算单克隆抗体对各药物的交叉反应率，结果见表4。
表4本发明试剂盒对各种氯霉素类药物的交叉反应率
结果表明，单克隆抗体只对氟苯尼考有较高的识别率，对其它氯霉素类药物识别率
很低，表明特异性较好。
实施例4本发明氟苯尼考残留检测ELISA试剂盒的组装
4.1本发明ELISA试剂盒由下述部分组成：
1)包被有包被原FFA-EDC-OVA的固相载体(酶标板)；
2)氟苯尼考标准溶液6瓶，浓度分别为0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0.1μg/L、0.05μg/L、
0μg/L；
3)保藏号为CCTCCNO:C201548的杂交瘤细胞株FF/7A8分泌的单克隆抗体；
4)辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液；
5)浓缩磷酸盐缓冲液：NaCl80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O29.0g，KCl2.0g，
加双蒸水至1000mL；
6)浓缩洗涤液：NaCl80.0g，KH2PO42.0g，Na2HPO4·12H2O29.0g，KCl2.0g，Tween20
5mL，加双蒸水至1000mL；
7)底物液A：3,3',5',5-四甲基联苯二胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸
水至1000mL；
8)底物液B：Na2HPO414.6g，柠檬酸9.3g，0.75％过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水
至1000mL，调节pH至5.0～5.4；
9)终止液：2mol/L硫酸溶液。
4.2酶标板的制备
用包被液将FFA-EDC-OVA稀释成1mg/L，每孔加入100μL，4℃过夜，倾去包被液，
每孔加入250μL洗涤液洗涤3次，拍干，然后每孔加入封闭液250μL，37℃孵育60min，
倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封保存。
实施例5本发明的酶联免疫试剂盒的测定程序
5.1试剂的配制
1)样品稀释液：将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用三蒸水稀释10倍后使用。
2)洗涤液：将试剂盒中提供的洗涤液用三蒸水稀释10倍后使用。
3)底物混合液：根据每次所需用量，将配制的底物液A和底物液B按体积1:1混
匀，现配现用。
5.2样品前处理
猪肉、鸡肉、鱼肉、猪肝和鸡肝的前处理：
1)称取2.00±0.02g可食性组织匀质样品于50mL离心管中，加8mL乙酸乙酯，震
荡5min，室温4000r/min离心5min；
2)取上清2mL氮气吹干，用正己烷2mL复溶，涡旋30s，再加入PBS1mL混合，
室温4000r/min离心5min，取下层水相供试剂盒测定，本处理对组织样品的稀释倍数为2。
5.3测定步骤
1)加样：向酶标板微孔中加入一系列浓度氟苯尼考标准溶液或样品溶液50μL，然
后加入单克隆抗体工作液50μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；
2)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL洗涤3次并拍干；
3)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液：每孔中加入辣根过氧化
物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体工作液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育30min；
4)洗涤：倒出孔中的液体，每孔中加入洗涤液250μL，洗涤3次并拍干；
5)加底物：每孔中加入底物混合液100μL，置于湿盒中，37℃恒温孵育15min；
6)加终止液：每孔中加入终止液50μL；
7)测定：用酶标仪在450nm处测定每孔的光密度值(OD值)。
5.4结果判断
标准曲线：
以所测定的标准品OD值除以“零”孔OD值(B/B0)为纵坐标，氟苯尼考浓度的对
数值为横坐标作标准曲线，并进行线性回归，给出回归方程。
组织中氟苯尼考药物浓度计算：
计算样品的抑制率(所获得的样品的OD值除以“零”孔OD值)，代入标准曲线
的回归方程中，计算出组织中氟苯尼考浓度(μg/kg)。
实施例6本发明试剂盒的灵敏度、精密度、准确度、重复性试验
6.1本发明试剂盒的灵敏度试验
以标准曲线的IC50值和组织最低检测限(LOD)作为本发明检测试剂盒的灵敏度指
标。将氟苯尼考标准品稀释成为0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0.1μg/L、0.05μg/L、0μg/L6
个浓度，每个浓度5个复孔，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，取5次测定的
IC50的平均值。LOD通过以下步骤决定，测定20份空白组织样品的OD值，根据标准
曲线的回归方程计算出相应的氟苯尼考浓度，然后计算出氟苯尼考浓度的平均值和
标准差(SD)，根据公式计算出组织中的最低检测限。本发明的IC50值为
0.21±0.02μg/L，氟苯尼考在动物组织中的最低检测限详见表5。
表5动物组织中的最低检测限
6.2本发明试剂盒的精密度试验
将氟苯尼考标准品稀释成0.8μg/L、0.4μg/L、0.2μg/L、0.1μg/L、0.05μg/L、0μg/L6
个浓度，每浓度5个重复，按照间接竞争ELISA方法重复测定5次，应用标准曲线的回
归方程计算出各浓度氟苯尼考标准溶液的测定值，计算板内和板间变异系数，结果见表6。
表6标准曲线的板内及板间变异系数
6.3本发明试剂盒的准确度、重复性试验
将三个浓度的氟苯尼考分别添加到猪肉、鸡肉、鱼肉、猪肝脏和鸡肝脏样品中，其
添加回收率在78.0％～111.8％之间，批内与批间变异系数＜15％，测定结果见表7～11。
表7猪肉中添加回收率
表8鸡肉中添加回收率
表9鱼肉中添加回收率
表10猪肝脏中添加回收率
表11鸡肝脏中添加回收率