一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法技术领域
本发明属于饮用水遗传毒性检测及评价领域，涉及一种生物组试验准确评价饮用水遗传毒性的方法。
背景技术
随着高新技术产业的多元化，伴随着多种类、难降解的新生污染物质排入饮用水水源中，给饮用水安全带来了潜在的威胁。虽然饮用水技术得到了较大的发展，但对于纳米尺寸、痕量、亲水等有机物难于去除。此类物质通过协同作用、相加作用等方式联合作用于生物体，故理化分析方法无法反映多种污染物质作用对生物体的综合毒性效应和长期效应。另有研究表明，饮用水致突变性强弱与TOC或CODMn等指标并无对应关系，以3-氯-4(二氯甲基)-5-羟基-2(5H)-呋喃酮(MX)为例，其毒性可以和黄曲霉相比，是迄今为止在氯消毒自来水中发现的最强的致突变物质，其浓度为ng/L级，对TOC等贡献甚微，但对饮用水致突变性贡献可达11～67％，这意味着单项的理化水质指标和少数有毒物质的最高容许浓度尚不能完全保证饮用水的安全性，即使各项水质指标满足生活饮用水卫生标准(GB5749-2006)106项水质标准，作为人们长期饮用的毒性蓄积，也可能存在一定的安全风险。
目前已经建立的短期遗传毒性方法有200多种，分别检测基因突变、DNA损伤和染色体(组)畸变，很多研究者普遍使用其中的一到两种方法对水源水、自来水厂出水、管道出水等进行检验和评价。由于受试细胞或动物对有毒污染物质产生个体敏感性及特异性，会造成假阴性结果，造成对饮用水安全的误判，进而影响人类基因库的质量。所以，建立一种涵盖基因突变、DNA损伤和染色体(组)畸变的多遗传终点，涉及不同种类的受试动物，准确可行，快捷经济的方法势在必行。
发明内容
本发明针对背景技术的实际问题，提供了一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种多遗传终点生物组试验评价饮用水遗传毒性的方法，以自来水厂滤池出水和消毒后水为研究对象，以生物组遗传毒性试验：Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、仓鼠卵巢细胞微核试验、SOS/umu试验为评价标准，当生物组遗传毒性试验中有3个阳性结果即表示存在生物遗传毒性安全性。
本发明具有如下优点：
①包含有基因突变、染色体畸变和DNA损伤三个遗传学终点；
②试验生物包括原核、真核和哺乳类；
③包括体内、体外试验；
④包括性细胞和体细胞；
⑤检测手段相对简便、快捷、经济及实验室通用性好。
附图说明
图1为遗传毒性实验组合。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
具体实施方式一：本实施方式提供了一种涵盖多遗传终点评价饮用水遗传毒性的方法，其技术措施采用以下方案：
目前检测遗传毒性方法方法虽多，从检测方法来分，大体上可分为下述三类：基因突变试验、染色体畸变试验和DNA损伤及修复试验。对于致突变试验选择应符合下列原则：①应该包含有多个遗传学终点；②试验生物包括原核、真核和哺乳类；③包括体内、体外试验；④包括性细胞和体细胞；⑤检测手段相对简便、快捷、经济及实验室通用性好等原则。另外，对于诱变性测试评价结果的权重价值按如下原则：(1)其测试生物的进化程度：哺乳动物＞其他高等真核生物＞低等真核生物＞原核生物；(2)染毒方式：体内＞体外；(3)靶cell：生殖cell＞体cell；(4)观察终点：基因突变≈染色体损伤＞遗传学意义不明的。鉴于上述，有人提出加权法，对每一种测试系统获得阳性结果赋予正值，无活化系统的数值大于有活化系统的，获得阴性结果则赋予负值，无活化系统的绝对值小于有活化系统的。鉴于上述原则，本实施方式提出了一种涵盖多遗传终点的方法评价饮用水遗传毒性，分别从基因突变、染色体畸变和DNA损伤三个遗传学终点建立一套方法，如图1所示。
一、生物组遗传毒性试验预处理方法
遗传毒性试验预处理方法采用两种，其中Ames试验、体内微核小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验以及小鼠精子畸形试验采用预处理模式一，而仓鼠卵巢细胞微核试验和SOS/umu试验采用预处理模式二。
1、预处理模式一：采用固相萃取法，以XAD-2型树脂为吸附树脂，颗粒度40～60目。使用前将树脂用重蒸甲醇、丙酮各提取8h，装入磨口瓶中以重蒸甲醇浸泡备用。将精制过的树脂湿法装入特制的玻璃吸附柱中至树脂床高110mm，并在吸附柱底部和树脂床上铺经甲醇和丙酮提取过得玻璃丝。然后放出甲醇，至甲醇恰好达树脂床顶部为止，然后用1000～1200ml蒸馏水分5～6次冲洗树脂柱，冲洗净残存甲醇后，保留树脂柱被蒸馏水覆盖，以防进气。吸附柱上端通过医用滴管与盛水容器相连，利用虹吸作用通过调节螺旋夹控制水样流经树脂床的流速为50～70mL/min，过柱水的总体积为250L。过柱完毕，用60～80ml重蒸的乙醚洗脱，首次洗脱时使乙醚在柱子中存留30～40min。洗脱液收集到烧杯中并加入经马弗炉于600℃烘干3h后的无水硫酸钠进行脱水处理，最后用转移到KD浓缩器于43℃水浴的条件下浓缩至1ml以下，4℃冰箱保存备用。
2、预处理模式二：采样瓶采用5L清洁、干燥棕色玻璃瓶。采集水样时，瓶内用待测水样润洗3次，每种水样采集10L。所有水样使用直径为142mm的Millipore微滤系统和孔径0.7μm的APFF玻璃纤维滤膜(美国Millipore)过滤后再经活化后的HLB柱富集。HLB柱采用二氯甲烷和甲醇活化柱子。将水样通过样品管连接至活化好的HLB柱，每根HLB柱富集水样2升，富集完毕并抽干水后，以10mL二氯甲烷为淋洗剂分三次(第一次4mL、第二次3mL和第三次3mL)进行洗脱，旋蒸浓缩后，添加经脱水的无水硫酸钠，用柔和高纯氮气吹干后置换0.2mL生物实验溶剂DMSO于-20℃冰箱保存用于遗传毒性生物测试。
二、生物组遗传毒性试验方法
1、Ames试验方法方法简述如下：试验设计为四个剂量组，换算成有机富集物的水的体积计，也即相当于水样的体积为7L/皿、5L/皿、3L/皿和1L/皿4个水量(剂量)梯度，除了上述的4个剂量组外，还设有空白对照组(自发回变)、溶剂对照组(DMSO组)和阳性对照组(TA98是采用的Dexon，TA100是采用的NaN3)。本试验采用平板掺入法，试验中向融化的顶层培养基中，依次注入试验菌株增菌液0.1mL和受试物溶液(预处理后的水样)0.1mL，将其混匀后注入到底层培养基平板上，并在37℃条件下培养48h，然后计数每皿的回变菌落数。每次试验每个剂量做3个平行皿，在相同试验条件下再重复一次，最后以6皿平均值计算试验结果。
2、SOS/umu试验方法：将-80℃冷冻复苏TA1535/PSK1002菌液取适量加入适量含氨比西林的LB培养基(溶菌肉汤培养基，用于生化分子实验预培养菌种)中，保持温度37℃，进行振荡隔夜培养。第二天，使用TGA培养液对菌液提前培养1h，试验分别在+S9(间接遗传毒性)和-S9(直接遗传毒性)下开展。测定培养液595nm波长下的吸光度值A595。依次往反应菌液中注入1mlZ-buffer溶液，10μ1CHCl3震荡摇均，加入1ml含ONPG(显色剂)的缓冲溶液进行振荡摇匀，保持温度为30℃，经过60min振荡反应，加入Na2CO3停止反应，往96孔酶标板加入上清液，分别在420nm和550nm波长下测定吸光度值A420和A550。DMSO为阴性对照组。96孔板每孔的有机富集物水的浓度梯度为0.0835L/孔、0.0418L/孔、0.0209L/孔、0.0104L/孔、0.0052L/孔和0.0026L/孔。
3、仓鼠卵巢细胞微核试验方法：试剂细胞使用CHO-K1细胞，本试验试验方法由中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室马梅老师课题组构建，详细试验步骤见参考文献<Assessingofgenotoxicityof16centralizedsource-watersinChinabymeansoftheSOS/umuassayandthemicronucleustest：InitialidentificationofthepotentialgenotoxicantsbyuseofaGC/MSmethodandtheQSARToolbox3.0>。
染色体损伤效应判断依据：当水样中存在具有染色体损伤效应的遗传毒物时，在细胞急性毒性小于50％的情况下，微核率随着水源水样暴露浓度的增加而显著增加即呈现出剂量-响应关系。通过以下公式计算微核率(MN％)、亚二倍体率和微核比率PI：
PI＝水样MN％/阴性对照MN％(3)。
4.小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验方法：试验剂量根据成人需水量来设计，成人日均需水量包括饮水、食物水和代谢水，分别为1200mL、1000mL和300mL，成人体重以55kg计算，可得来源于饮水和食物水的总量为(1200+1000)mL/55kg＝40mL/kg·bw。小白鼠试验剂量分别按人日需水量的1000倍、100倍和10倍的梯度设计，也即：1000×：40mL/kg·bw×1000＝40000mL/kg·bw＝40L/kg·bw；100×：40mL/kg·bw×100＝4000mL/kg·bw＝4L/kg·bw；10×：40mL/kg·bw×10＝400mL/kg·bw＝0.4L/kg·bw。另设阴性对照组(也即溶媒对照，由50％水和50％色拉油及2～3滴吐温经快速震摇而形成的乳浊液，喂养剂量为20mL/kg·bw)和阳性对照组(采用环磷酰胺，喂养剂量为40mg/kg·bw)。小白鼠采用经口灌胃途径投予受试物。采用30h投予受试物(和对照物)法，也即间隔24h二次投予受试物或对照物，并在第二次灌胃后6h采用颈椎脱臼方式处死小白鼠，获取股骨，使用眼科剪刀减去股骨的两端，将骨髓腔暴露出来，使用内充小牛血清的2mL注射器冲出一滴骨髓，按常规血涂片法涂片，大约2～3cm长度。在自然干燥后使用甲醇固定5～10min后，在Giema应用液中染色10～15min，蒸馏水冲洗后，自然干燥。选择细胞分散均匀、且染色良好和形态完整的区域，采用双盲法阅片，每只小白鼠观察1000个PCE，计算有微核细胞数和微核细胞率(‰)。
5、小鼠精子畸形试验方法参见《小鼠精子畸形试验》(GB15193.7-2003)：试验中小白鼠采用经口灌胃途径投予受试物。连续每日一次喂养5d，在首次给予受试物后的第35天采用颈椎脱臼方式处死，并取出其两侧附睾，放置于事先盛有1mL生理盐水的平皿中。使用眼科剪刀纵向剪开附睾，静置3～5min后，轻轻摇动，然后使用四层镜头纸过滤，吸取滤液涂片，在空气中自然干燥后，使用甲醇固定5min以上，自然干燥后，采用1～2％的伊红染色1h，然后用蒸馏水轻轻冲洗，待其干燥后阅片。每只小白鼠至少检查1000个完整精子，记录畸形的精子数和类型，并计算出畸形率。
三、评价方法
3个单向指标阳性即存在生物遗传毒性。
具体实施方式二：本实施方式对国内南方某一自来水厂进行评价。取水厂滤池出水和消毒后水，按照具体实施方式一所述方法进行遗传毒性评价。
1、Ames试验分析
本试验中需要用到的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型(TA98和TA100菌株)直接由UnitedStatesUniversityofCaliforniaAmes实验室提供，鉴定菌种特性符合试验要求。
数出每个平皿的回变菌落数，并且求出6个平行皿的均值数及标准差，分别得出TA98和TA100的致突变率MR，所得结果如表1所示。一般认为，Ames试验呈现阳性(可引起碱基置换型的基因突变)结果的判断条件必须同时满足两个条件：①受试物组(TA98或TA100)的回变菌落数与自发回变组菌落数之比MR≥2；②呈现有剂量-反应响应关系(显著水平为p＝0.01或0.05)。由表1可知，自来水厂消毒后水在剂量为7L/皿时为阳性结果，而在3L/皿和5L/皿时随剂量的增加回变菌落与阴性对照比有显著差异，但尚未达到自发回变的2倍(即MR＜2)，也即可判断为Ames阴性结果。
表1评价自来水厂滤后水和消毒后水Ames试验结果列表
2、SOS/umu试验分析
本试验过程中会使用到鼠伤寒沙门菌S.typhimuriumTA1535/PSK1002(下文简称TA1535/PSK1002)菌株(购自日本大阪府公共卫生协会)和S9(购自中国疾控中心)。
由测定的吸光值根据β-半乳糖苷酶诱导活性U值：
其中，t为反应时间(20min)，v为菌液的稀释倍率(本试验中为0.0656)。
计算水样的IR值：
其中，U样品和UDMSO分别是样品和阴性对照组的U值。
一般说来，SOS/umu试验(即DNA损伤效应)呈阳性的判断条件为在急性毒性＜50％的情况下同时满足：①IR≥2(国际接受最低阳性诱导值)；②存在剂量-响应关系。阳性则说明水中存在可以引起DNA损伤效应的遗传毒物。对于DNA损伤效应阳性样品，可根据其强度与阳性化合物4-NQO(-S9)和BaP(+S9)损伤效应强度进行比较，分别得到水样中4-NQO和BaP的当量毒性浓度，分别表示为TEQ4-NQO和TEQBaP，并计算出相应的致癌风险P(成年人体重W＝70kg，每日饮水2L计算)。
P = TEQ 4 - NGO × 0.001 × 2 70 × 0.369 . ]]>
通过自来水厂的滤后水和消毒水的检测结果，得到各水样IR值与样品浓度，如表2所示，在无代谢活化条件(-S9)下，自来水厂滤后水SOS呈阴性，消毒后出水SOS呈阳性(在最高剂量为0.0835L/孔时IR≥2)，出厂水TEQ4-NQO范围为0.0444～0.0582ug/L，致癌风险处于4.68×10-7～6.14×10-7之间，低于美国EPA安全致癌风险控制区间1.0×10-6～1.0×10-4(本研究采取10-5作为安全标准)，这也表明消毒工艺会增加滤后出水遗传毒性效应。
表2评价-S9和+S9条件下滤后出水与消毒后出水的TEQ4-NQO、其致癌风险值与TEQBaP值
注：“-”表示无剂量-响应关系。
3、仓鼠卵巢细胞微核试验分析
试验最初水样暴露浓度为0.5mg/L、0.25mg/L、0.125mg/L、0.0625mg/L、0.03125mg/L和0.015625mg/L，根据急性毒性实验结果发现样品暴露浓度为0.5mg/L的细胞急性毒性超过50％，故选择了0.25mg/L、0.125mg/L和0.0625mg/L三个梯度进行观测微核率和亚二倍体率，详细结果见表3所示。
一般认为，CHO-K1微核试验(染色体损伤效应)阳性结果判定条件为：在急性毒性＜50％时，MN％随水样暴露浓度呈现剂量-响应关系。本试验采用One-WayANOVA检验通过与对照组相比微核率有显著性增加，显著性水平为p＝0.05。其中，微核率和亚二倍体率用来分析微核产生的MOA，对于通过断裂方式产生的微核，亚二倍体率不会随着微核的增加而增加；而通过整倍体脱落方式产生的微核，亚二倍体率随着微核的增加而增加。
由表3可知，供水厂C-I和C-II两种工况下的滤后水和出厂水在所有试验剂量下的体外微核试验均呈现阴性结果，这说明这些样品均表现为染色体无损伤效应。这表明供水厂滤后水和出厂水中不存在具有染色体损伤效应的遗传毒物，且回用反冲洗废水和混合生产废水亦不会对此有影响。
表3滤后水和出厂水CHO-K1染色体损伤效应结果列表
4、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
本试验选用SPF级昆明种小白鼠，体重(W)约为25～35g。每个水样需用到50只，雌雄各一半。随机分成为5组，每组10只，雌雄各5只(购自哈尔滨医科大学实验动物中心)，试验在小白鼠在实验室适应环境3天后进行。
一般来说，小鼠骨髓嗜多染红细胞微核致阳性结果判定条件为：①微核率＞5‰；或②阴性对照组和阳性对照组的微核发生率有显著性差异(p＜0.01或0.05)，有剂量-响应关系。由表4可知，出厂水在高(1000×)剂量组和中(100×)剂量组均可以诱导雌雄小鼠骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核细胞率增高(与阴性对照比，p＜0.01或p＜0.05)，即在本实验条件下，该两个样品为致突变阳性，而滤后水这两种剂量均为阴性，说明在高剂量组和中剂量组下，致小鼠骨髓细胞染色体畸变作用可能是由消毒引起的。其余水样、剂量都呈阴性结果。因此，可推断出消毒可能会增加滤后水致染色体损伤效应。
表4评价滤后水和消毒水小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验
5、小鼠精子畸形试验
本试验选用的小白鼠来源和剂量设计与微核试验相同，具体分组为每个水样使用35只，随机分成5组，每组7只，以保证试验结束后每组至少有5只动物。
一般说来，判断小鼠精子畸形阳性的条件为：①将投予受试物的小鼠组与阴性对照组比较，精子畸形率至少≥2倍的阴性对照组畸形率；或②经过统计学有显著性差异(p＜0.01)，并有剂量-反应关系。如表5所示，消毒后出水具有使雄性生殖细胞发生突变的效应。
表5滤后水和消毒后水小鼠精子畸形试验结果
注：与阴性对照比，**：P＜0.01。
6、多遗传终点生物组试验评价某水厂遗传毒性综合分析
将不同遗传学终点的毒理试验结果综合分析，如表6所示。滤后水的不同遗传学终点遗传毒理试验在所有试验剂量下均呈现阴性结果，这表明FB供水厂滤后水中均为检测出明显的致基因突变、致DNA损伤、致染色体损伤和致生殖细胞突变的遗传毒性污染物。虽然Ames试验、SOS/umu试验(-S9)、微核试验、小鼠精子畸形试验消毒后水检测结果出现阳性，这表明消毒会增出厂水中的致基因突变、致DNA损伤(直接致损伤效应)、致染色体损伤和致生殖细胞突变的遗传毒性污染物浓度。但是所有出现的这些阳性结果均出现在受试动物、细胞或细菌暴露在高剂量受试物的情况下(如Ames是在7L/皿，小鼠精子畸形试验是在40L/kg·bw(1000×)的剂量下)检测出阳性，这表明FB水厂的消毒后出水中致遗传毒性物质含量非常低，并通过SOS/umu试验发现人长期正常饮用时，其致癌风险远低于EPA安全风险控制值，Ames试验表明在3L/皿的剂量时消毒后水呈现阴性结果。
总之，通过多遗传学终点的遗传毒理试验表明，在以相当于成年人正常饮水量(如Ames试验3L/皿、微核和小鼠精子试验10倍成人正常饮用水量)的受试物投予试验动物、细胞及细菌的条件下，滤后水和消毒水遗传毒理试验结果均呈现阴性。
表6不同遗传学终点遗传毒理试验结果汇总表