基于液相色谱仪检测莫西克汀中间产物保护物含量的方法技术领域
本发明涉及莫西克汀中间产物检测方法的技术领域，特别是涉及一种基于液相色
谱仪检测莫西克汀中间产物之一保护物含量的方法。
背景技术
众所周知，莫西克汀作为新一代驱虫抗生素，对内寄生虫和外寄生虫有高度驱除
活性，主要用于反刍兽和马的大多数胃肠线虫和费线虫，反刍兽的某些节肢动物寄生虫，以
及犬恶丝虫发育的幼虫；属于大环内酯类抗虫生物制剂，具有高效驱虫活性和长效、安全等
特征；中间产物保护物是莫西克汀的中间产物之一，目的是为更有效地提取得到高含量的
最终产物。莫西克汀结构复杂，官能团较多，经上保护反应得到中间产物保护物的步骤，可
以降低原料的消耗，但保护物含量的检测目前未见报道。
目前莫西克汀中间产物保护物含量的检测在中国及EP、USP药典上均未体现。而莫
西克汀中间产物的转化不仅提高了最终产物的含量，也减少了原料的消耗，因而为严格控
制产品质量，莫西克汀中间产物之一保护物含量的检测及其合适有效的检测方法就尤为重
要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种能将尼莫克汀及保护物完全分离，准确度
高，重复性好，线性关系数高，精密度≤2.0％，灵敏度高，结果满意的基于液相色谱仪检测
莫西克汀中间产物之一保护物含量的方法。
本发明的一种基于液相色谱仪检测莫西克汀中间产物之一保护物含量的方法，包
括以下步骤：
a、制备供试品储备液：精密量取莫西克汀中间产物之一保护物适量，用95％乙醇
稀释至效价约为5000ug/mL，制成供试品储备液；
b、制备供试品溶液：精密量取5mL供试品储备液置50mL容量瓶中，并向容量瓶中
加内标物尼莫克汀25mg，用95％乙醇溶解定容至刻度，盖好瓶塞，用倒转的方式使瓶内的液
体混合均匀，于20-30℃放置5-10h；
c、制备对照品溶液A：精密称定10mg尼莫克汀置50mL容量瓶中，用95％乙醇溶解定
容至刻度；
d、制备对照品溶液B：精密称取10mg保护物置50mL容量瓶中，用95％乙醇溶解定容
至刻度；
e、色谱条件：采用LunaC185.0um4.6*150mm色谱柱，以85％甲醇为流动相，色谱
柱的柱温控制在25-35℃，流速为1.0～1.5mL/min，检测波长为240nm，进样量20μL；
f、系统适应性试验：打开液相色谱仪，预热5min，将对照品溶液连续进样3针，要求
内标物和中间体保护物分离度满足要求；
g、测定：分别精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按步骤e
的色谱条件进行测定；
h、按内标法计算出莫西克汀中间体含量。
本发明的一种基于液相色谱仪检测莫西克汀中间产物之一保护物含量的方法，所
述的步骤b中最佳温度为25℃，最佳放置时间为9h。
本发明的一种基于液相色谱仪检测莫西克汀中间产物之一保护物含量的方法，所
述的步骤e中色谱柱的最佳柱温为30℃，最佳流速为1.0mL/min。
与现有技术相比本发明的有益效果为：通过上述方法的设置，能将尼莫克汀及保
护物完全分离，准确度高，重复性好，线性关系数高，精密度≤2.0％，灵敏度高，结果满意。
附图说明
图1是保护物浓度与峰面积线性关系曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于
说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明的一种基于液相色谱仪检测莫西克汀中间产物之一保护物含量的方法，包
括以下步骤：
a、制备供试品储备液：精密量取莫西克汀中间产物之一保护物适量，用95％乙醇
稀释至效价约为5000ug/mL，制成供试品储备液；
b、制备供试品溶液：精密量取5mL供试品储备液置50mL容量瓶中，并向容量瓶中加
内标物尼莫克汀25mg，用95％乙醇溶解定容至刻度，盖好瓶塞，用倒转的方式使瓶内的液体
混合均匀，于20-30℃(最佳温度为25℃)放置5-10h(最佳放置时间为9h)；
c、制备对照品溶液A：精密称定10mg尼莫克汀置50mL容量瓶中，用95％乙醇溶解定
容至刻度；
d、制备对照品溶液B：精密称取10mg保护物置50mL容量瓶中，用95％乙醇溶解定容
至刻度；
e、色谱条件：采用LunaC185.0um4.6*150mm色谱柱，以85％甲醇为流动相，色谱
柱的柱温控制在25-35℃(最佳柱温为30℃)，流速为1.0～1.5mL/min(最佳流速为1.0mL/
min)，检测波长为240nm，进样量20μL；
f、系统适应性试验：打开液相色谱仪，预热5min，将对照品溶液连续进样3针，要求
内标物和中间体保护物分离度满足要求；
g、测定：分别精密量取供试品溶液、对照品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按步骤e
的色谱条件进行测定；
h、按内标法计算出莫西克汀中间体含量。
通过上述方法的设置，能将尼莫克汀及保护物完全分离，准确度高，重复性好，线
性关系数高，精密度≤2.0％，灵敏度高，结果满意。
本发明的一种基于液相色谱仪检测莫西克汀中间产物之一保护物含量的方法，步
骤h中内标法的计算公式如下：
式中：f：相对校正因子
Ax、As：供试品、内标物主峰面积
Cx、Cs：供试品、内标物浓度(ug/mL)
本发明的一种基于液相色谱仪检测莫西克汀中间产物之一保护物含量的方法，其
整体试验方法如下：
1.仪器与试剂
1.1仪器
仪器名称
仪器型号
液相色谱仪
戴安U3000
电子天平
CP225D
色谱柱
Luna C18 5.0um 4.6*150mm
1.2试剂
名称
来源
规格
甲醇
Fisher scientific
色谱纯
供试品
研发提取室
工业产品
2.溶液配制
(1)、制备供试品储备液：精密量取莫西克汀中间产物之一保护物适量，用95％乙
醇稀释至效价约为5000ug/mL，制成供试品储备液；
(2)、制备供试品溶液：精密量取5mL供试品储备液置50mL容量瓶中，并向容量瓶中
加内标物尼莫克汀25mg，用95％乙醇溶解定容至刻度，盖好瓶塞，用倒转的方式使瓶内的液
体混合均匀，于20-30℃放置5-10h；
(3)、制备对照品溶液A：精密称定10mg尼莫克汀置50mL容量瓶中，用95％乙醇溶解
定容至刻度；
(4)、制备对照品溶液B：精密称取10mg保护物置50mL容量瓶中，用95％乙醇溶解定
容至刻度；
(5)、制备对照品溶液C：精密称定内标物尼莫克汀100mg置50mL容量瓶中，用95％
乙醇溶解定容至刻度；
(6)、制备对照品溶液D：精密称定保护物对照品100mg置50mL容量瓶中，用95％乙
醇溶解定容至刻度；
3.色谱条件
色谱柱：LunaC185.0um4.6*150mm
柱温：30℃
波长：240nm
流速：1.0mL/min
进样量：20μl
分析时间：35min
流动相：85％甲醇溶液
4.测定方法
精密量取供试品溶液20ul，自动进样，注入液相色谱，按内标法计算莫西克汀中间
体含量。
5.验证试验
5.1系统适用性试验
打开液相色谱仪，预热5min，将对照品溶液连续进样3针，要求内标物及中间体保
护物之间分离度满足要求。
5.2线性试验
精密量取对照品溶液B0.5mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL，对照品溶液C0.5mL、
0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.5mL置10mL容量瓶中，用95％乙醇定容至刻度，在25℃下放置9h，按
上述3色谱条件测定，以试液浓度(c)对峰面积(A)进行线性回归，要求R2≥0.999。实验结果
见下表：
表1线性实验结果
线性试液
线性浓度ug/mL
A
50％
88.45
64.6619
80％
141.53
101.9776
100％
176.91
129.6454
120％
212.29
156.7311
150％
265.36
197.0678
根据表1和图1可明显看出，线性试液50％至150％试液浓度与其峰面积线性方程
为：y＝1.3294x+4.0629；线性相关系数R2为0.9996，大于0.999，线性试验通过。
5.3校正因子试验
同线性试验，计算公式如下：
K对照品：中间体线性回归方程的斜率；K内标：内标物线性回归方程的斜率。
实验结果见下表：
表3校正因子试验结果
根据表3可得出保护物校正因子为1.7。
5.4精密度试验
取对照品溶液，不同时间、人员条件下进样2次，按上述3色谱条件测定，测定主峰
峰面积的RSD不得过2.0％。实验结果见下表：
表4精密度试验结果
根据表4可明确得出不同时间、不同人员对照溶液2次进样，测得甲醛峰面积RSD为
0.6％，小于2.0％，精密度试验通过。
5.5稳定性试验
取制备好的对照品溶液，于温度25℃按表5放置不同时间后进样，按上述3色谱条
件测定，测定对照品溶液主峰面积的RSD％≤1.0％。实验结果见表6：
表5放置时间
表6稳定性试验结果
由以上结果可知，对照品溶液于25℃放置9h，对照品溶液主峰面积RSD为0.5％，小
于1.0％，说明对照品溶液于25℃放置9h内稳定。
5.6回收率试验
加标溶液：向供试品溶液中加入保护物对照品各10mg、15mg、20mg，分别标记加标
溶液1、2、3。
按上述3色谱条件测定，分别精密量取供试品溶液、加标溶液1、加标溶液2、加标溶
液3各20μL，注入液相色谱仪，根据以下计算公式计算中间体加标回收率。
加标回收率％＝实测值/理论值
其中：W对：中间体对照品称重，mg；
f：各残媒校正因子；
P％：中间体对照品含量；
Ax、As：加标溶液中中间体物质及内标物的峰面积；
C中间体、Cs：供试品溶液中间体及加标溶液中内标物的浓度，ug/ml；
V：加标溶液定容后体积，50mL。
回收率在80％～120％之间。
实验结果见下表：
表7回收率试验结果
回收率均在80％～120％之间，回收率实验通过。
通过线性试验、精密度试验、稳定性试验、回收率试验等试验充分验证了本方法的
准确、科学性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型
也应视为本发明的保护范围。