一种弓形虫血清学检测方法技术领域
本发明为一种弓形虫病血清学诊断方法，对于慢性长期性弓形虫感染的动物具有
强敏感性。对隐性弓形虫病动物体诊断准确性高。
背景技术
弓形虫是一种专性细胞内寄生原虫，能寄生在除红细胞外的所有有核细胞内，随
血液和淋巴液扩散至全身各部位。中间宿主广泛且无特异性，终末宿主仅限于猫或猫科动
物。弓形虫病是一种危害巨大的人畜共患疾病，在中国属二类动物疫病。
弓形虫作为重要的机会性致病原虫，正常人和动物感染弓形虫后多呈隐性感染，
一般不引起明显症状，但可在体内长期潜伏，损伤多为占位压迫性损伤。但如果发生在胎
儿、机体免疫功能受损或缺陷的患者(如器官移植、艾滋病及恶性肿瘤患者等)，潜伏感染可
以被激活，从而引起严重的甚至危及生命的疾病，对人类健康和畜牧业发展构成严重威胁。
弓形虫病是人畜先天性共患疾病和流产的原因之一，还可引起脑炎和视网膜炎等。
临床上，关于弓形虫的诊断方法众多，特别是免疫血清学检测方法，这类方法具有
诊断快速、灵敏、简便、低成本等优势，是国际上弓形虫病诊断的主要方法。临床常用的免疫
诊断方法如：直接凝集试验（HA）、间接血细胞凝集试验（IHA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）
等。但是，以上方法普遍存在灵敏性不高易出现假阳性结果；阳性结果判定标准不易确定，
人为因素影响较大；操作较为繁琐，耗时较多，成本较高等缺点。
发明内容
为了解决目前采用的弓形虫的诊断方法存在着的诸多问题，本发明的主要目的是
提供一种更简便、更灵敏地对弓形虫病动物体做出准确诊断的新的弓形虫血清学检测方
法。
本发明的技术方案是以下述方式实现的：
1、一种弓形虫血清学检测方法，包括下述步骤
A、待检血清样品的获得、B、待检血清、阳性血清及阴性血清的梯度稀释、C、弓形虫抗原
混合液的配制、D、梯度血清与抗原混合液1:1反应、E、封板并37℃温箱过夜、F、阳性样品的
判定，
其中：
A、待检血清样品的获得
对任何温血动物的血清检测弓形虫的抗体IgG；血清4℃贮藏，避免反复冻融。
B、待检血清、阳性血清及阴性血清的梯度稀释
血清临界稀释度为1:200，从1:25梯度依次稀释到1:200，血清稀释在96孔“U”型板上进
行，每板需设置阳性及阴性血清对照：
1:25：取5μl血清，加入120μl血清缓冲液，移液枪吹打混匀；
1:50：取稀释液60μl，加入60μl血清缓冲液，移液枪吹打混匀；
1:100：取稀释液60μl,加入60μl血清缓冲液，移液枪吹打混匀；
1:200：取稀释液60μl,加入60μl血清缓冲液，移液枪吹打混匀。
血清缓冲液的配制：将42.5gNaCl、1.54gNaH2PO4、5.4gNa2HPO4溶解于900ml蒸馏水
中，调节PH至7.2；
C、弓形虫抗原混合液的配制
弓形虫抗原混合液需现用现配现以一板96孔“U”型反应板所需的抗原混合液（总量：
2.735ml）为例说明配制方法：
配制组份及体积比为：
抗原缓冲液：2-巯基乙醇：伊文思蓝溶液：弓形虫MAT抗原
=2500μl：35μl：50μl：150μl
抗原缓冲液的配制：将7.01gNaCl、3.09g硼酸、2.0g叠氮化钠溶解于900ml去离子水中，
加入24ml1NNaOH调PH至8.95；
伊文思蓝溶液的配制：将伊文思蓝溶解于用去离子水中配制成2mg/ml浓度即可；
弓形虫抗原的制备：
弓形虫速殖子经Vero细胞培养，收集速殖子，甲醛灭活，调至速殖子浓度为1.0×108/
ml；
D、梯度血清与抗原混合液1:1反应
取配制好的抗原混合液在96孔“U”型板中每孔加入25μl，吸取稀释后的血清溶液每孔
25μl，将二者吹打混匀；
E、封板并37℃温箱过夜
将混合均匀的血清反应板用塑料保鲜膜封闭严实，放置于37℃的恒温相中过夜；
F、阳性样品的判定
将96孔“U”型反应板置于光线明亮处，从反应板底部观察，板孔内可见凝集物呈“菊花
状”分布的即为阳性样品；板孔内可见凝集物呈现清晰“圆点状”分布的即为阴性样品；
抗原混合液制备时需将弓形虫MAT抗原先放置室温再严格混匀直至呈“牛乳状”。
所述的血清缓冲液是5倍浓度的血清缓冲液原液，储存于4℃长期使用；
血清缓冲液待使用时，用过滤过的0.01Mphosphatebufferedsaline(PBS)稀释5倍
即为工作血清缓冲液。
抗原缓冲液使用时，将0.4gbovineserumalbumin（BSA）溶解于100ml硼酸盐缓
冲液中即为工作抗原缓冲液。
本发明主要是依据免疫学原理，在经典的弓形虫病免疫学诊断方法（如HA、IHA等）
的基础上发展而来的，改良凝集实验为本项目组长期从事和探索弓形虫病研究和诊断，经
过大量的诊断方法比对和检测方法的改进，形成了这一套有效检测弓形虫病的方法。建立
了改良的血清学凝集试验。
本发明采用高纯度全虫体抗原极大提高了检测灵敏度；在操作上，仪器设备要求
不高，具体步骤简便；判定阳性结果清晰准确，有效地减少了人为误差因素的影响，提高了
弓形虫诊断的准确性和实效性。现请求专利给予保护和公开。
本发明技术的积极效果是：
1、弓形虫MAT抗原为虫体全抗原，检测滴度高，检测灵敏度高。
2、操作简便，不需要高端设备和仪器，成本较低。
3、阳性、阴性结果对比明显，便于观察记录。
4、自然溶血的血清样品不影响最终的结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明：
实施例一
需要以下试剂和器材：
待检血清、弓形虫病阳性血清、弓形虫病阴性血清、血清缓冲液、抗原缓冲液、弓形虫虫
体全抗原、2-巯基乙醇、伊文思蓝溶液、96孔“U”型板、保鲜膜、37℃恒温箱、移液枪。
A、待检血清样品的获得
任何温血动物的血清均可检测弓形虫的抗体IgG。血清一般4℃贮藏，尽量避免反复冻
融。
B、待检血清、阳性血清及阴性血清的梯度稀释
检测方法的血清临界稀释度为1:200，一般从1:25梯度依次稀释到1:200。血清稀释在
96孔“U”型板上进行。每板需设置阳性及阴性血清对照。
1:25：取5μl血清，加入120μl血清缓冲液，移液枪吹打混匀；
1:50：取稀释液60μl，加入60μl血清缓冲液，移液枪吹打混匀；
1:100：取稀释液60μl,加入60μl血清缓冲液，移液枪吹打混匀；
1:200：取稀释液60μl,加入60μl血清缓冲液，移液枪吹打混匀。
血清缓冲液的配制：将42.5gNaCl、1.54gNaH2PO4、5.4gNa2HPO4溶解于900ml蒸馏水
中，调节PH至7.2。以上配制的是5倍浓度的血清缓冲液原液，可储存于4℃长期使用。待使用
时，用过滤过的0.01Mphosphatebufferedsaline(PBS)稀释5倍即为工作血清缓冲液。
C、弓形虫抗原混合液的配制
弓形虫抗原混合液需现用现配。现以一板96孔“U”型反应板所需的抗原混合液（总量：
2.735ml）为例说明配制方法：
抗原缓冲液2500μl
2-巯基乙醇35μl
伊文思蓝溶液50μl
弓形虫MAT抗原150μl
抗原缓冲液的配制：将7.01gNaCl、3.09g硼酸、2.0g叠氮化钠溶解于900ml去离子水
中，加入24ml1NNaOH调PH至8.95。以上配制溶液为硼酸盐缓冲液，可室温贮藏。使用时，将
0.4gbovineserumalbumin（BSA）溶解于100ml硼酸盐缓冲液中即为工作抗原缓冲液，可4
℃贮藏。
伊文思蓝溶液的配制：将伊文思蓝溶解于用去离子水中配制成2mg/ml浓度即
可。
弓形虫抗原的制备：
弓形虫速殖子经Vero细胞培养，收集速殖子，甲醛灭活，调至速殖子浓度为1.0×108/
ml。
D、梯度血清与抗原混合液1:1反应
取配制好的抗原混合液在96孔“U”型板中每孔加入25μl，吸取稀释后的血清溶液每孔
25μl，将二者吹打混匀。稀释度需一一对应。
E、封板并37℃温箱过夜
将混合均匀的血清反应板用塑料保鲜膜封闭严实，放置于37℃的恒温相中过夜（大约
16h）。
F、阳性样品的判定
将96孔“U”型反应板置于光线明亮处，从反应板底部观察，板孔内可见凝集物呈“菊花
状”分布的即为阳性样品；板孔内可见凝集物呈现清晰“圆点状”分布的即为阴性样品。
本发明技术顺利实施的注意事项：
1、每一个反应板需设立阳性、阴性对照。
2、抗原混合液制备时需将弓形虫抗原先放置室温再严格混匀直至呈“牛乳状”。
3、反应板必须用保鲜膜封闭严实方可放入37℃温箱中。
4、避免交叉污染。