一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法技术领域
本发明涉及一种成像方法，具体涉及一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨
显微成像方法，属于光学显微成像技术领域。
背景技术
长期以来，光学显微成像技术的分辨力受到衍射极限的限制。至今，利用非标记的方
法获得突破衍射极限分辨率的方法有两种，一种是利用场增强效应的相干反斯托克斯拉曼
散射显微镜，但它要用到尖端场增强，只能对样品表面成像，应用受到很大的限制。另一
种方法是受激拉曼显微成像，它使用两束斯托克斯光，一束呈高斯型，另一束呈环形，类
似荧光标记的STED方法。但这种方法只能获得分子某一化学键的拉曼谱，单靠此谱来判别
样品中的分子种类是困难的，要获得分子的其它拉曼谱，就要求激光器具有宽的调谐范围，
更严重的问题是需要很长的测试时间才能获得分子的完整拉曼谱，为获得样品的三维超衍
射分辨图像，所需成像时间太长。
相干反斯托克斯拉曼散射(CARS：CoherentAnti-StokesRamanScattering)是利
用四波混频的三阶非线性效应而产生反斯托克斯光信号的效应，现有技术中通过增加一与
泵浦光和斯托克斯光同时共线聚焦于样品的附加探测光，该附加探测光耗尽泵浦光和斯托
克斯光在其焦斑周边产生的声子，形成无用的CARS信号，而延迟的探测光中符合相位匹
配条件的光子则与焦斑中心区域的声子碰撞形成有用的CARS信号，将无用的CARS信号分
离，即可获得超衍射极限的空间分辨率。因采用具有宽带的超连续谱激光作为泵浦光和斯
托克斯光，从而获得分子的完整CARS谱信号，实现对整个分子成像。然而，该方法所需
的激光波长为4种，光路复杂且对调节机构要求很高，实现起来极为困难。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的光学显微成像方法成像时间长，成像光路复杂，
对成像结构要求高的问题。
本发明的技术方案是：一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，
包括以下步骤：
步骤一、将泵浦光、斯托克斯光和探测光共线聚焦于样品，调整泵浦光、斯托克斯光
和探测光的聚焦光斑中心的距离使三束光斑边缘相互重叠，形成三束光聚焦光斑的共同重
叠区域；
步骤二、在步骤一的基础上沿三个不同方向向外侧移动泵浦光、斯托克斯光和探测光
聚焦光斑中心，减小所述共同重叠区域的面积；
步骤三、获取由共同重叠区域所产生的反斯托克斯光信号进行成像。
所述泵浦光、斯托克斯光和探测光均为超短激光脉冲。
所述泵浦光、斯托克斯光和探测光的聚焦光斑中心连线的距离近似相等。
所述泵浦光、斯托克斯光和探测光为空心光束。
本发明与现有技术相比具有以下效果：而本发明只需利用三种波长不同的激光，将三
束光同时打到样品上，三束光的不需要中心对准，而是呈现三角形，在三束光的共同重叠
区域产生的反斯托克斯光信号，发光区域被压缩，实现超分辨成像，产生的CARS光强度
高，相比传统的成像方法，光路结构大大简化，实现难度降低，但成像效果更佳。
附图说明
图1是三束光聚焦光斑的位置示意图
图2是三束空心光束聚焦光斑的位置示意图
图中：1.泵浦光，2.斯托克斯光，3.探测光。
具体实施方式
结合附图说明本发明的具体实施方式：
实施例一、一种基于相干反斯托克斯拉曼散射效应的超分辨显微成像方法，包括以下
步骤：
步骤一、将泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3共线聚焦于样品，调整泵浦光1、斯托
克斯光2和探测光3的聚焦光斑中心的距离使三束光斑边缘相互重叠，形成三束光聚焦光
斑的共同重叠区域；
步骤二、在步骤一的基础上沿三个不同方向向外侧移动泵浦光1、斯托克斯光2和探
测光3聚焦光斑中心，减小所述共同重叠区域的面积，步骤三、获取由共同重叠区域所产
生的反斯托克斯光2信号进行成像。
所述泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3均为超短激光脉冲。
所述泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3的聚焦光斑中心连线的距离相等，即使三束
光的聚焦光斑中心连线呈现等边三角形。
实施例二、本实施例与实施例一的区别在于所述泵浦光1、斯托克斯光2和探测光3
为空心光束。
相干反斯托克斯拉曼散射(CARS：CoherentAnti-StokesRamanScattering)是利
用四波混频的三阶非线性效应而产生反斯托克斯光信号的效应，现有技术通常采用时间分
辨CARS，需要四束光是分别打到样品上的，互相之间有一定的延迟，要有相应的延迟装
置，增加了光路的繁琐性；由于时间分辨，产生的CARS信号强度是呈数量级下降的，导
致探测难度大；在光路上，要保证四束光的中心对的很准，实现难度很大。
本发明的反斯托克斯光信号是由泵浦光1、斯托克斯光2、探测光3共同作用而产生的，
将三束光各自偏移一定的位移，三束光的重叠区域则减小，即可控制反斯托克斯光信号仅
产生在该重叠区域，从而使得发光的区域变小，对该区域进行显微成像即可获得突破衍射
极限的成像分辨力。
三个光斑偏移的越大，重叠的区域自然就越小，即发出CARS信号的区域越小，因此分
辨力也就越高。