非拮抗性EGFR结合分子及其免疫偶联物本申请是申请日为2011年10月28日、中国专利申请号为
201180062458.4(国际申请号为PCT/US2011/058385)、发明名称为
“非拮抗性EGFR结合分子及其免疫偶联物”的发明专利申请的分案
申请。
技术领域
本发明整体涉及结合到EGFR的抗体、其抗原结合片段、多肽和
免疫偶联物。具体地讲，本发明涉及作为免疫偶联物不会抑制EGFR
信号传导但对EGFR过表达肿瘤细胞具有高细胞毒性的抗EGFR抗体
及其片段。本发明还涉及将此类EGFR结合分子用于诊断和治疗疾病
诸如恶性肿瘤的方法。
发明背景
表皮生长因子受体(EGFR或ErbB1或HER1)是包括HER2
(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)的受体酪氨酸激酶(RTK)的
人表皮生长因子受体(HER)家族的成员。这些RTK共有由以下结构域
组成的同源结构：配体结合胞外结构域(ECD)、单跨跨膜结构域以及
包含催化激酶结构域和C端尾的胞内结构域。HER激酶信号传导通
过胞外配体的结合而引发，这种结合诱导受体二聚化和胞内区域的转
磷酸作用。这些事件生成初始信号，导致对细胞增殖和存活至关重要
的许多下游信号传导途径的激活。
EGFR在许多上皮细胞起源的恶性肿瘤类型中过表达，诸如头
颈、结直肠、肺、卵巢、肾、胰腺、皮肤和其它实体瘤。EGFR介导
的信号传导途径在肿瘤生长和转移的进展中发挥着重要作用，从而使
得EGFR成为肿瘤疗法的良好靶标(Baselga,Oncologist,7:2-8(2002),
Yarden和Sliwkowski,NatRevMolCellBiol,2:127-137(2001))。目前，
有四种EGFR靶向剂已得到批准用于治疗结直肠癌、胰腺癌、头颈癌
和非小细胞肺癌，包括两种小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(埃罗替
尼(Tarceva)和吉非替尼(Iressa))以及两种裸单克隆抗体(西妥昔单抗
(Erbitux)和帕尼单抗(Vectibix))。这些抗EGFR剂强烈抑制EGFR激活
和下游信号传导。TKI与ATP竞争对EGFR胞内激酶结构域(Baselga
和Arteaga,JClinOncol,23:2445-2459(20005))的结合，而两种单克
隆抗体则与EGFR配体竞争对受体的结合(Gill等,JBiolChem,
259:7755-7760(1984),Goldstein等,ClinCancerRes,1:1311-1318
(1995),Prewett等,ClinCancerRes,4:2957-2966(1998))。
抗EGFR疗法并不完美。抑制EGFR信号传导只在某些肿瘤类型
中有效。例如，抗EGFR抗体的疗效在具有KRAS、BRAF、PIK3CA
和PTEN突变的结直肠癌患者中显著降低(DeRoock等,LancetOncol,
11:753-762(2010),Bardelli和Sienna,JClinOncol,28:1254-1261
(2010))。另外，小分子EGFR抑制剂的活性也受限于具有激活EGFR
突变的NSCLC患者(Linardou等NatRevClinOncol,6:352-366
(2009),Paz-Ares等,JCellMolMed,14:51-69(2009),Mok等,Discov
Med,8:227-231(2009))。EGFR疗法还会导致皮肤毒性。EGFR在皮
肤正常基底上皮细胞中的表达在上皮的正常发育和生理机能中发挥
着关键作用，而抑制EGFR信号传导会导致多种皮肤毒性，包括痤疮
样皮疹、皮肤干燥、瘙痒症、甲沟炎、毛发异常、黏膜炎以及睫毛或
面部毛发生长加速(综述于Li和Perez-Soler,TargOncol4:107-119
(2009))。虽然极少危及生命，但是皮肤毒性会导致降低患者生活质量
的严重生理和心理不适。另外，在大约10％的患者中，皮肤毒性的严
重程度使得需要中断或停止治疗，这会影响EGFR抑制剂的临床结
果。
因此，需要改善的抗EGFR疗法，其对正常组织无害但仍能非常
有效地治疗EGFR过表达的恶性肿瘤。为了解决这一特定需求，本发
明着重于独特的EGFR抗体，它们作为免疫偶联物不会抑制EGFR信
号传导，但对EGFR表达肿瘤细胞具有高细胞毒性。
发明概述
本发明整体涉及结合到EGFR的抗体、其抗原结合片段、多肽和
免疫偶联物。具体地讲，本发明涉及作为免疫偶联物不会抑制EGFR
信号传导但对EGFR过表达肿瘤细胞具有高细胞毒性的抗EGFR抗体
及其片段。本发明还涉及将此类EGFR结合分子用于诊断和治疗疾病
诸如恶性肿瘤的方法。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及特异性结合到人EGFR的
非拮抗性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体具有至少一种选自以
下的特性：(a)在10μg/ml或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系和
人原代角质形成细胞中表皮生长因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化，(b)
在100nM或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系中转化生长因子α
(TGFα)与EGFR的结合，(c)在100nM或更低时不会抑制角质形成细
胞和MCF-10A上皮细胞的配体诱导增殖超过20％，(d)在100nM或
更低时不会抑制表达EGFR的NCI-H292和NCI-H322M肿瘤细胞的
基底增殖超过20％，以及(e)在100nM或更低时不会抑制A431细胞
系中西妥昔单抗和528抗体的结合超过30％。
在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段具有至少两种选自
以下的特性：(a)在10μg/ml或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系
和人原代角质形成细胞中表皮生长因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化，
(b)在100nM或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系中TGFα与
EGFR的结合，(c)在100nM或更低时不会抑制角质形成细胞和
MCF-10A上皮细胞的配体诱导增殖超过20％，(d)在100nM或更低
时不会抑制表达EGFR的NCI-H292和NCI-H322M肿瘤细胞的基底
增殖超过20％，以及(e)在100nM或更低时不会抑制A431细胞系中
西妥昔单抗和528抗体的结合超过30％。
在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段具有至少三种选自
以下的特性：(a)在10μg/ml或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系
和人原代角质形成细胞中表皮生长因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化，
(b)在100nM或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系中TGFα与
EGFR的结合，(c)在100nM或更低时不会抑制角质形成细胞和
MCF-10A上皮细胞的配体诱导增殖超过20％，(d)在100nM或更低
时不会抑制表达EGFR的NCI-H292和NCI-H322M肿瘤细胞的基底
增殖超过20％，以及(e)在100nM或更低时不会抑制A431细胞系中
西妥昔单抗和528抗体的结合超过30％。
在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段具有至少四种选自
以下的特性：(a)在10μg/ml或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系
和人原代角质形成细胞中表皮生长因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化，
(b)在100nM或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系中TGFα与
EGFR的结合，(c)在100nM或更低时不会抑制角质形成细胞和
MCF-10A上皮细胞的配体诱导增殖超过20％，(d)在100nM或更低
时不会抑制表达EGFR的NCI-H292和NCI-H322M肿瘤细胞的基底
增殖超过20％，以及(e)在100nM或更低时不会抑制A431细胞系中
西妥昔单抗和528抗体的结合超过30％。
在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段具有至少五种选自
以下的特性：(a)在10μg/ml或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系
和人原代角质形成细胞中表皮生长因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化，
(b)在100nM或更低时不会抑制MDA-MB468细胞系中TGFα与
EGFR的结合，(c)在100nM或更低时不会抑制角质形成细胞和
MCF-10A上皮细胞的配体诱导增殖超过20％，(d)在100nM或更低
时不会抑制表达EGFR的NCI-H292和NCI-H322M肿瘤细胞的基底
增殖超过20％，以及(e)在100nM或更低时不会抑制A431细胞系中
西妥昔单抗和528抗体的结合超过30％。
在另一个实施方案中，本发明涉及特异性结合到人EGFR的非拮
抗性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体：(a)在10μg/ml或更低
时不会抑制MDA-MB468细胞系和人原代角质形成细胞中表皮生长
因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化，(b)在100nM或更低时不会抑制
MDA-MB468细胞系中TGFα与EGFR的结合，(c)在100nM或更低
时不会抑制角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的配体诱导增殖超过
20％，(d)在100nM或更低时不会抑制表达EGFR的NCI-H292和
NCI-H322M肿瘤细胞的基底增殖超过20％，以及(e)在100nM或更
低时不会抑制A431细胞系中西妥昔单抗和528抗体的结合超过
30％。
在另一个实施方案中，本发明涉及特异性结合到人EGFR的非拮
抗性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体：(a)在10μg/ml或更低
时不会抑制MDA-MB468细胞系和人原代角质形成细胞中表皮生长
因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化，(b)在100nM或更低时不会抑制
MDA-MB468细胞系中TGFα与EGFR的结合，(c)在100nM或更低
时不会抑制角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的配体诱导增殖超过
20％，(d)在100nM或更低时不会抑制表达EGFR的NCI-H292和
NCI-H322M肿瘤细胞的基底增殖超过20％，和(e)在100nM或更低
时不会抑制A431细胞系中西妥昔单抗和528抗体的结合超过30％，
以及(f)在MDA-MB468细胞系中在不存在外源EGF的情况下不诱导
EGFR磷酸化。
在另一个实施方案中，本发明涉及特异性结合到人EGFR的非拮
抗性抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体：(a)在10μg/ml或更低
时不会抑制MDA-MB468细胞系和人原代角质形成细胞中表皮生长
因子(EGF)诱导的EGFR磷酸化，(b)在100nM或更低时不会抑制
MDA-MB468细胞系中TGFα与EGFR的结合，(c)在100nM或更低
时不会抑制角质形成细胞和MCF-10A上皮细胞的配体诱导增殖超过
20％，(d)在100nM或更低时不会抑制表达EGFR的NCI-H292和
NCI-H322M肿瘤细胞的基底增殖超过20％，和(e)在100nM或更低
时不会抑制A431细胞系中西妥昔单抗和528抗体的结合超过30％，
以及(f)在MDA-MB468细胞系中在不存在外源EGF的情况下诱导
EGFR磷酸化。
在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含(a)与选自SEQ
IDNO:17-20的参考VH序列至少90％相同的VH序列；以及(b)与选
自SEQIDNO:21-24的参考VL序列至少90％相同的VL序列。在另
一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含与参考VH和VL序列
至少95％相同的VH和VL序列。在另一个实施方案中，抗体或其抗
原结合片段包含与参考VH和VL序列至少99％相同的VH和VL序
列。在又一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含(a)选自SEQID
NO:17-20的VH序列；以及(b)选自SEQIDNO:21-24的VL序列。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:17
和SEQIDNO:21。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包
含SEQIDNO:18和SEQIDNO:22。在另一个实施方案中，抗体或其
抗原结合片段包含SEQIDNO:19和SEQIDNO:23。在另一个实施方
案中，抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:20和SEQIDNO:24。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到与选自以下的抗体
相同的人EGFR表位的抗体或其抗原结合片段：(a)包含SEQID
NO:17的VH多肽和SEQIDNO:21的VL多肽的抗体；(b)包含SEQ
IDNO:18的VH多肽和SEQIDNO:22的VL多肽的抗体；(c)包含SEQ
IDNO:19的VH多肽和SEQIDNO:23的VL多肽的抗体；以及(d)
包含SEQIDNO:20的VH多肽和SEQIDNO:24的VL多肽的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供竞争性抑制参考抗体与人EGFR
结合的抗体或其抗原结合片段，其中所述参考抗体选自：(a)包含SEQ
IDNO:17的VH多肽和SEQIDNO:21的VL多肽的抗体；(b)包含
SEQIDNO:18的VH多肽和SEQIDNO:22的VL多肽的抗体；(c)
包含SEQIDNO:19的VH多肽和SEQIDNO:23的VL多肽的抗体；
以及(d)包含SEQIDNO:20的VH多肽和SEQIDNO:24的VL多肽
的抗体。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体
或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含
CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2
和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQIDNO:1、
SEQIDNO:2和SEQIDNO:3的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序
列相同；以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，
所述CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分
别与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的参考轻链
CDR1、CDR2和CDR3序列相同。在另一个实施方案中，该抗体或
其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重
链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQIDNO:1、SEQID
NO:2和SEQIDNO:3的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；
以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述
CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQ
IDNO:13的参考轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或
其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQIDNO:1、SEQIDNO:4
和SEQIDNO:3的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；以及
(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、
CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQID
NO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的参考轻链CDR1、CDR2
和CDR3序列相同。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段
包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述
CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQIDNO:1、SEQIDNO:4和SEQID
NO:3的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
分别与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的参考轻链
CDR1、CDR2和CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或
其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
除了1、2或3个保守氨基酸置换外与SEQIDNO:1、SEQIDNO:5
和SEQIDNO:3的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；以及
(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、
CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQID
NO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的参考轻链CDR1、CDR2
和CDR3序列相同。在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段包
含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述
CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQIDNO:1、SEQIDNO:5和SEQID
NO:3的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
分别与SEQIDNO:11、SEQIDNO:12和SEQIDNO:13的参考轻链
CDR1、CDR2和CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或
其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQIDNO:6、SEQIDNO:7
和SEQIDNO:8的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；以及
(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、
CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQID
NO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的参考轻链CDR1、CDR2
和CDR3序列相同。在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段包
含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述
CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQID
NO:8的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
分别与SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的参考轻链
CDR1、CDR2和CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或
其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQIDNO:6、SEQIDNO:9
和SEQIDNO:8的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；以及
(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、
CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQID
NO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的参考轻链CDR1、CDR2
和CDR3序列相同。在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段包
含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述
CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQIDNO:6、SEQIDNO:9和SEQID
NO:8的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；以及(b)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
分别与SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的参考轻链
CDR1、CDR2和CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明提供特异性结合到人EGFR的抗体或
其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)含CDR1、
CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3
除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与SEQIDNO:6、SEQID
NO:10和SEQIDNO:8的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相同；
以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所述
CDR1、CDR2和CDR3除了1、2或3个保守氨基酸置换外分别与
SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的参考轻链CDR1、
CDR2和CDR3序列相同。在另一个实施方案中，权利要求27的抗
体或抗原结合片段包含：(a)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白
重链可变区，所述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQIDNO:6、SEQ
IDNO:10和SEQIDNO:8的参考重链CDR1、CDR2和CDR3序列相
同；以及(b)含CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变区，所
述CDR1、CDR2和CDR3分别与SEQIDNO:14、SEQIDNO:15和
SEQIDNO:16的参考轻链CDR1、CDR2和CDR3序列相同。
在一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段为鼠的、非人
的、人源化的、嵌合的、表面重塑的或人的。在另一个实施方案中，
该抗体或其抗原结合片段为全长抗体。在另一个实施方案中，该抗体
或其抗原结合片段为抗原结合片段。在另一个实施方案中，该抗体或
其抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、二硫
键连接的Fv、V-NAR结构域、IgNar、胞内抗体、IgGΔCH2、微型抗
体(minibody)、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、单域抗体、
DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
本发明还提供包含本文所述的VH和VL序列的多肽。
在一个实施方案中，本发明提供以基本上相似的结合亲和力结合
人和恒河猴EGFR的抗体或多肽。在一个实施方案中，该抗体或多肽
以约1.0nM至约10nM的Kd结合到人和恒河猴EGFR。在另一个实
施方案中，该抗体或多肽以约1.0nM或更佳的Kd结合到人和恒河猴
EGFR。在另一个实施方案中，结合亲和力通过流式细胞术、Biacore
或放射性免疫测定法测量。
在一个实施方案中，本发明提供产生本文所述的抗体或其抗原结
合片段或多肽的分离的细胞。
在一个实施方案中，本发明提供制备本文所述的抗体或其抗原结
合片段或多肽的方法，其包括：(a)培养表达该抗体、其抗原结合片段
或多肽的细胞，以及(b)从所述培养的细胞中分离所述抗体、其抗原
结合片段或多肽。在一个实施方案中，该细胞为真核细胞。
在一个实施方案中，本发明提供具有式(A)-(L)-(C)的免疫偶联
物，其中：(A)为本文所述的抗体或其抗原结合片段或多肽；(L)为连
接基；以及(C)为细胞毒剂；并且其中所述连接基(L)将(A)连到(C)。
在另一个实施方案中，该连接基选自可裂解的连接基、不可裂解的连
接基、亲水性连接基和二羧酸基连接基。在另一个实施方案中，该连
接基为不可裂解的连接基。在另一个实施方案中，该连接基选自：
N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)；N-琥珀酰亚胺基
4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二
硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)；N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基
甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)；N-磺基琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基
甲基)环己烷羧酸酯(磺基SMCC)；N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-
氨基苯甲酸酯(SIAB)；以及N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺丙酰胺
基)-四乙二醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。在另一个实施方案中，该
连接基为N-琥珀酰亚胺基-[(N-马来酰亚胺丙酰胺基)-四乙二醇]酯
(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
在另一个实施方案中，该免疫偶联物包含选自以下的细胞毒剂：
美登木素(maytansinoid)、美登木素类似物、多柔比星(doxorubicin)、
修饰的多柔比星、苯二氮紫杉烷、CC-1065、CC-1065类似物、
倍癌霉素(duocarmycin)、倍癌霉素类似物、加利车霉素(calicheamicin)、
多拉司他汀(dolastatin)、多拉司他汀类似物、奥里斯他汀(aristatin)、
茅层霉素(tomaymycin)衍生物和来普霉素(leptomycin)衍生物或所述
药剂的前药。在另一个实施方案中，该细胞毒剂为美登木素。在另一
个实施方案中，该细胞毒剂为N(2')-去乙酰基-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙
基)-美登素(DM1)或N(2')-去乙酰基-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-
美登素(DM4)。
在一个实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗体或其抗原结
合片段或多肽或本文所述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体的
药物组合物。在另一个实施方案中，该药物组合物包含第二抗癌剂。
在一个实施方案中，本发明提供包含经标记的本发明的抗体或其
抗原结合片段、多肽或免疫偶联物的诊断试剂。在一个实施方案中，
该标记选自放射性标记、荧光团、发色团、成像剂和金属离子。
在一个实施方案中，本发明提供包含本文所述的抗体或其抗原结
合片段、多肽或免疫偶联物的试剂盒。
在一个实施方案中，本发明提供抑制表达EGFR的细胞生长的方
法，其包括将该细胞与本文所述的免疫偶联物或药物组合物接触。在
另一个实施方案中，该细胞为肿瘤细胞。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗具有赘生物的患者的方
法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的免疫偶联物或药
物组合物。在另一个实施方案中，该赘生物选自：腹部、骨骼、乳腺、
消化系统、肝、胰腺、腹膜、肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、
胸腺、甲状腺、眼、头颈、中枢神经系统、外周神经系统、淋巴系统、
骨盆、皮肤、软组织、脾、胸部和泌尿生殖系统。在另一个实施方案
中，该方法包括向受试者施用第二抗癌剂。在另一个实施方案中，第
二抗癌剂为化疗剂。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗患者的细胞增殖性病症
的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的本文所述的免疫偶联物
或药物组合物。在另一个实施方案中，该细胞增殖性病症除了肿瘤外
还选自：肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质增生、子宫
内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶性上皮增生
(Heck病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其它细胞增殖性疾
病。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含编码多
肽的序列，该序列与选自SEQIDNO:17-28的序列至少90％相同。在
另一个实施方案中，该序列与选自SEQIDNO:17-28的序列至少95％
相同。在另一个实施方案中，该序列与选自SEQIDNO:17-28的序列
至少99％相同。
在一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含与SEQ
IDNO:29-40至少90％相同的序列。在另一个实施方案中，该多核苷
酸包含与SEQIDNO:29-40至少95％相同的序列。在另一个实施方案
中，该多核苷酸包含与SEQIDNO:29-40至少99％相同的序列。在又
一个实施方案中，本发明提供分离的多核苷酸，其包含选自SEQID
NO:17-40的序列。在另一个实施方案中，本发明提供包含本文所述
的多核苷酸的载体。在另一个实施方案中，本发明提供包含本文所述
的载体的宿主细胞。
附图简述
图1示出表格，其描述了指定的抗EGFR抗体对人EGFR
(huEGFR)和猴EGFR(maEGFR)抗原的结合亲和力。
图2示出表格，其描绘了在ML66VL(A)和VH(B)的表面重塑
中的具体框架表面残基变化。
图3示出ML66VL(A)和VH(B)的表面重塑序列和鼠对应物的
比对。
图4示出线形图，其描绘了ML-66(填充方形)和huML-66(空
白方形)与MDA-MB468细胞的结合。
图5示出Western印迹数据，其描绘了在MDA-MB468细胞(A)
和人原代角质形成细胞(B)中指定的抗EGFR抗体对配体诱导的
EGFR磷酸化的影响。
图6示出Western印迹数据，其描绘了在不存在外源EGFR配体
的情况下在MDA-MB468细胞中指定的抗EGFR抗体对EGFR磷酸
化的影响。
图7示出线形图，其描绘了在存在muEGFR-8(菱形)和huML66
(空白方形)的情况下生物素化TGFα(A)和EGF(B)配体与肿瘤细胞
的结合。
图8示出线形图，其描绘了muEGFR-8(菱形)和huML66(空
白方形)抑制人原代角质形成细胞生长的能力。
图9示出线形图，其描绘了muEGFR-8(菱形)和huML66(空
白方形)抑制由指定浓度的EGF(A)或TGF(B)刺激的MCF10A细胞
生长的能力。
图10示出线形图，其描绘了muEGFR-8(菱形)和huML66(空
白方形)抑制NCI-H292(A)和NCI-H322M(B)细胞系基底细胞生长
的能力。
图11示出线形图，其描绘了在存在指定浓度的muEGFR-8(菱
形)和huML66(空白方形)的情况下生物素化528抗体(A)和西妥昔
单抗(B)与MDA-MB468细胞的结合。
图12示出线形图，其描绘了在存在指定浓度的huML66和chKTI
抗体的情况下NK细胞介导的特异性杀伤百分比。
图13示出了huML66(A)和muEGFR-8(B)裸抗体及其相应的
DMx偶联物的结合曲线。
图14示出线形图，其描绘了ML66-SMCC-DM1和
ML66-SPDB-DM4偶联物在NCI-H226(A)、NCI-H292(B)和
NCI-H322M(C)细胞系中的细胞毒性。
图15示出线形图，其描绘了在存在或不存在过量ML66阻断性
抗体的情况下ML66-SMCC-DM1在KB细胞系中的细胞毒性。
图16示出线形图，其描绘了muEGFR-8-SMCC-DM1偶联物在
NCI-H226(A)、NCI-H292(B)和NCI-H322M(C)细胞系中的细胞毒性。
图17示出线形图，其描绘了KB肿瘤异种移植物在用指定的美
登木素偶联物处理的小鼠中的生长。
发明详述
本发明提供一类新的具有非拮抗剂特性的EGFR结合分子。另
外，抗EGFR抗体的免疫偶联物对EGFR表达细胞的杀伤效果出奇得
好，如使用体内肿瘤模型所证实。
I.定义
为了有利于理解本发明，下文定义了多个术语和短语。
如本文所用，“表皮生长因子受体”或"EGFR"是指成熟的酪氨酸
激酶细胞表面受体。术语“可溶性EGFR”或"sEGFR"是指含EGFR的
胞外配体结合结构域的EGFR的一部分。更具体地讲，sEGFR包含
成熟EGFR的第1-619位氨基酸(Ullrich等,HumanEpidermalGrowth
FactorcDNASequenceandAberrantExpressionoftheAmplifiedGene
inA-431EpidermoidCarcinomaCells,Nature,第309卷,418-25
(1986))。
短语“EGFR介导的癌症”是指特征在于上皮性肿瘤的癌症，其中
EGFR被异常激活到高于正常对应上皮组织中的水平。这些更高水平
的EGFR活性在许多类型的癌症中促进肿瘤生长。此类癌症包括但不
限于非小细胞肺癌、乳腺癌、结直肠癌、头颈癌和前列腺癌。EGFR
的异常激活可因以下方面所致：受体过表达、基因扩增、激活突变、
受体配体过表达和/或丧失EGFR活性的调节因子。
术语“抗体”意指通过免疫球蛋白分子可变区内的至少一个抗原
识别位点识别并特异性结合到靶标的免疫球蛋白分子，所述靶标诸如
为蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述物质的组
合。如本文所用，术语“抗体”涵盖完整的多克隆抗体、完整的单克隆
抗体、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)
突变体、多特异性抗体诸如由至少两个完整的抗体生成的双特异性抗
体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融
合蛋白，以及包含抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子，
只要该抗体表现出所需的生物活性即可。抗体可以是以下五大类免疫
球蛋白的任何一类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，或其亚类(同型)
(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，具体取决于它们重
链恒定结构域的性质，分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋
白具有不同的且熟知的亚单元结构和三维构型。抗体可以是裸抗体或
偶联到其它分子，诸如毒素、放射性同位素等。
“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体是抑制或降低其结合的抗原诸如
EGFR的生物活性的抗体。在一些实施方案中，阻断性抗体或拮抗性
抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。生物活性可以降低10％、
20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
如本文所用的关于抗体的短语“抑制EGFR激活的能力”旨在表
示抗体结合到EGFR导致人EGFR激活受到抑制以及在受体激活时出
现的人EGFR生物活性受到抑制。测量EGFR生物活性的一个或多个
指标(如使用细胞增殖测定法、细胞凋亡测定法、受体结合测定法、
受体磷酸化测定法或小鼠肿瘤模型(参见实施例)而确定)可评估抗
体抑制EGFR激活的能力。
术语“抗EGFR抗体”或“结合到EGFR的抗体”是指能够以足够的
亲和力结合EGFR使得抗体可用作靶向EGFR的诊断和/或治疗剂的
抗体。多种抗EGFR抗体在本领域中是已知的。例如，西妥昔单抗(Ab
225)和528Ab在美国专利号4,943,533中有所描述，该专利以引用的
方式并入本文。
抗EGFR抗体与不相关的非EGFR蛋白的结合程度可小于抗体结
合到EGFR的约10％，如例如通过放射性免疫测定法(RIA)所测定。
在某些实方案中，结合到EGFR的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、
≤1nM或≤0.1nM的解离常数(Kd)。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并指完整抗体的抗原决
定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv
片段、线性抗体、单链抗体以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“单克隆抗体”是指在单个抗原决定簇或表位的高度特异性识别
和结合中涉及到的均质性抗体群。这与多克隆抗体形成对比，多克隆
抗体则通常包含针对不同抗原决定簇的不同抗体。术语“单克隆抗体”
涵盖完整及全长单克隆抗体以及抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2、
Fv)、单链(scFv)突变体、包含抗体部分的融合蛋白质以及任何其它包
含抗原识别位点的修饰免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指通
过任何多种方式制备的此类抗体，包括但不限于通过杂交瘤、噬菌体
筛选、重组表达和转基因动物。
术语“人源化抗体”是指为含有最少非人(如，鼠)序列的特定免
疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其片段的非人(例如，鼠)抗体形式。
通常，人源化抗体是其中互补决定区(CDR)的残基被具有所需特异
性、亲和力和能力的非人物种(如，小鼠、大鼠、兔子、仓鼠)CDR
残基替换的人免疫球蛋白(Jones等,1986,Nature,321:522-525；
Riechmann等,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等,1988,Science,
239:1534-1536)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基
被具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种抗体中的相应残基替
换。人源化抗体可在Fv骨架区中和/或被替换的非人残基内进一步通
过另外残基的置换而修饰，以改善或优化抗体特异性、亲和力和能力。
一般来讲，人源化抗体将包含至少一个通常两个或三个下述可变结构
域的基本上全部，所述可变结构域包含对应于非人免疫球蛋白的
CDR区的全部或基本上全部，而FR区的全部或基本上全部则为人免
疫球蛋白共有序列的那些FR区。人源化抗体还可以包含通常为人免
疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。用于生成
人源化抗体的方法的实例在美国专利5,225,539中有所描述。
抗体的“可变区”是指单独的或组合的抗体轻链可变区或抗体重
链可变区。重链和轻链的可变区均由通过三个互补决定区(CDR)(也
称为高变区)连接的四个骨架区(FR)组成。每条链中的CDR通过FR
近距离保持在一起，并通过另一条链的CDR有助于形成抗体的抗原
结合位点。至少有两种技术可用于确定CDR：(1)基于跨物种序列变
异性的方法(即，Kabat等,SequencesofProteinsofImmunological
Interest,(第5版,1991,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMd.))；以
及(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-lazikani等(1997)
J.Molec.Biol.273:927-948))。此外，这两种方法的组合在本领域中有
时用于确定CDR。
Kabat编号系统通常用在提及可变区中的残基时(大约轻链的第
1-107位残基和重链的第1-113位残基)(例如，Kabat等,Sequencesof
ImmunologicalInterest.第5版,PublicHealthService,National
InstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。
如Kabat中的氨基酸位置编号是指用于抗体编绘的重链可变区或
轻链可变区的编号系统，见于：Kabat等.,SequencesofProteinsof
ImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutes
ofHealth,Bethesda,Md.(1991)。使用该编号系统，实际的线性氨基酸
序列可包含与可变区FR或CDR的缩短或插入相对应的更少的或另
外的氨基酸。例如，重链可变区可以包含在H2的第52位残基后的
单个氨基酸插入(根据Kabat的第52a位残基)以及在重链FR第82
位残基后的插入残基(例如，根据Kabat的第82a、82b和82c位等
残基)。对于给定的抗体，可通过在抗体序列同源性区域与“标
准”Kabat编号序列进行比对而确定残基的Kabat编号。相反，Chothia
则是指结构环中的位置(Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917
(1987))。ChothiaCDR-H1环的末端在使用Kabat编号约定进行编号
时在H32与H34之间根据环的长度而存在差异(这是因为Kabat编
号方案将插入置于H35A和H35B；如果35A和35B均不存在，则环
在第32位结束；如果仅存在35A，则环在第33位结束；如果35A
和35B均存在，则环在第34位结束)。AbM高变区代表了KabatCDR
与Chothia结构环之间的妥协，并被OxfordMolecular的AbM抗体建
模软件使用。
术语“人抗体”意指由人产生的抗体或使用本领域已知的任何技
术制备的具有与人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。对人抗体
的这种定义包括完整的或全长抗体、其片段和/或包含至少一条人重
链和/或轻链多肽的抗体，诸如包含鼠轻链和人重链多肽的抗体。
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自
两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链两者的可变区都对应于
具有所需特异性、亲和力和能力的衍生自一个哺乳动物物种(如小鼠、
大鼠、兔子等)的抗体可变区，而恒定区则与衍生自另一物种(通常
为人)的抗体中的序列同源，以避免在该物种中引起免疫反应。
术语“表位”或“抗原决定簇”在本文可互换使用，并指能够被特定
抗体识别和特异性结合的抗原部分。当抗原为多肽时，表位既可由连
续氨基酸形成，也可由通过蛋白质的三级折叠并置的非连续氨基酸形
成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时得以保持，而由三
级折叠形成的表位在蛋白质变性时则会丧失。一个表位通常以唯一的
空间构象包含至少3个更通常至少5个或8-10个氨基酸。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结
合伴侣(例如抗原)之间的非共价相互作用的总强度。除非另外指明，
否则如本文所用的“结合亲和力”是指反映结合对(例如抗体和抗原)
成员之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其伴侣Y的
亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域已知的常见
方法包括本文所述的那些方法进行测量。低亲和力抗体通常缓慢地结
合抗原并往往容易解离，而高亲和力抗体则更快地结合抗原并往往保
持结合更长的时间。测量结合亲和力的多种方法在本领域中是已知
的，它们中的任何一种均可用于本发明的目的。具体的示例性实施方
案将在下文描述。
“或更佳的”当在本文用于指代结合亲和力时是指分子与其结合伴
侣之间更强的结合。“或更佳的”当在本文用于指代更强的结合时由更
小的Kd数值表示。例如，对于具有“0.6nM或更佳的”抗原亲和力的
抗体，该抗体的抗原亲和力<0.6nM，即0.59nM、0.58nM、0.57nM
等或小于0.6nM的任何值。
所谓“特异性结合”一般是指抗体通过其抗原结合域结合到表位
并且该结合在抗原结合域与表位之间带来一定的互补性。根据该定
义，抗体在通过其抗原结合域比将会结合到随机、无关表位更容易地
结合到某表位时则称为“特异性结合”到该表位。术语“特异性”在本文
用于对某抗体结合到某抗原所依靠的相对亲和力进行限制。例如，抗
体"A"对于给定的表位可被视为比抗体"B"具有更高的特异性，或者可
称抗体"A"以比对于相关表位"D"所具有的特异性更高的特异性结合
到表位"C"。
所谓“优先地结合”是指抗体比将结合到相关、相似、同源或类似
表位更容易地特异性结合到某表位。因此，“优先地结合”到给定表位
的抗体将比结合到某相关表位更容易地结合到所述表位，即使此抗体
可与所述相关表位发生交叉反应。
在以下情况中将称抗体“竞争性抑制”参考抗体与给定表位的结
合：该抗体优先地结合到该表位，以至于在某种程度上阻断参考抗体
与表位的结合。竞争性抑制可通过本领域已知的任何方法测定，例如
竞争性ELISA测定法。可称抗体竞争性抑制参考抗体与给定表位的
结合达至少90％、至少80％、至少70％或至少60％或至少50％。
如本文所用的短语“基本上相似”或“基本上相同”是指两个数值
(通常一个与本发明的抗体相关，而另一个则与参考/比较抗体相关)
之间足够高的相似程度，使得本领域的技术人员将认识到两个值之间
的差异在所述值(例如，Kd值)度量的生物学特性的背景下几乎没
有生物学和/或统计学显著性。所述两个值之间的差异根据参考/比较
抗体的值可小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或
小于约10％。两“基本上相似的结合亲和力”之间的差异根据参考/比
较抗体的值通常小于约10％。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是指不存
在于自然界中的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。
分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括经过纯化达
到已不再为自然界中所见形式的那些多肽、抗体、多核苷酸、载体、
细胞或组合物。在一些实施方案中，分离的抗体、多核苷酸、载体、
细胞或组合物为基本上纯的。
如本文所用，“基本上纯的”是指至少50％纯(即，不含污染物)、
至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯的材料。
如本文所用的术语“免疫偶联物”或“偶联物”是指连接到细胞结
合剂(即，抗EGFR抗体或其片段)的化合物或其衍生物，并由以下
通式定义：C-L-A，其中C＝细胞毒素，L＝连接基以及A＝细胞结合
剂或抗EGFR抗体或抗体片段。免疫偶联物也可由反向的通式A-L-C
定义。
“连接基”是能够将化合物通常为药物(例如美登木素)以稳定的
共价方式连接到细胞结合剂(例如抗EGFR抗体或其片段)的任何化
学部分。在化合物或抗体保持活性的条件下，连接基可容易受以下裂
解的影响或基本上耐以下裂解：酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶
诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。合适的连接基在本领域
中是熟知的，包括例如二硫基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳
定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。连接基还可以包括如本
文所述的以及本领域已知的带电连接基及其亲水形式。
术语“癌症”和“癌的”是指或描述哺乳动物中的生理病症，其中一
群细胞的特征在于不受控的细胞生长。癌症的实例包括但不限于恶性
肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。“肿瘤”和“赘生物”是指因
良性(非癌的)或恶性(癌的)过度细胞生长或增殖包括癌前病变而
产生的一个或多个细胞。可以治疗和/或防止的“癌症”或“致瘤”疾病的
实例包括以下部分的赘生物：腹腔、骨骼、乳腺、消化系统、肝脏、
胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾丸、卵巢、胸
腺、甲状腺)、眼睛、头颈、神经系统(中枢和外周)、淋巴系统、骨
盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖系统。
术语“癌细胞”、“肿瘤细胞”和语法等同形式是指衍生自肿瘤或癌
前病变的总细胞群，包括非致瘤性细胞(构成肿瘤细胞群的大部分)
和致瘤性干细胞(癌干细胞)两者，如本文所用，术语“肿瘤细胞”
在仅指无更新和分化能力的那些肿瘤细胞时将通过术语“非致瘤性”
加以修饰，以将那些肿瘤细胞与癌干细胞区分。
术语“受试者”是指将为特定治疗的受体的任何动物(例如哺乳动
物)，包括但不限于人类、非人灵长类、啮齿类等等。一般来讲，术
语“受试者”和“患者”在涉及人类受试者时在本文可互换使用。
“联合”一种或多种另外的治疗剂施用包括同时(并行)施用和以
任何顺序连续施用。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其所呈剂型使得允许活性成分
的生物活性有效并且不含对将要施用给的受试者具有无法接受毒性
的附加组分。制剂可以为无菌的。
如本文所公开的“有效量”的抗体是足以实现具体指定的目的的
量。“有效量”可通过经验确定以及在涉及指定的目的时以常规方式确
定。
术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物中的疾病
或障碍的抗体或其它药物的量。就癌症而言，治疗有效量的药物可减
少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓或停
止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，在一定程度上减缓或停止)
肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上缓解与
癌症相关的一种或多种症状。参见本文关于“治疗”的定义。在药物可
防止癌细胞生长和/或杀伤现有癌细胞的程度内，药物可以是细胞抑
制性的和/或细胞毒性的。“预防有效量”是指在必要的剂量下和时间
段内有效实现所需预防结果的量。通常但非必定地，由于预防剂量在
疾病之前或疾病的早期阶段用于受试者，因此预防有效量将低于治疗
有效量。
本文所用的词语“标记”是指可检测的化合物或组合物，其直接或
间接偶联到抗体以便生成“标记”抗体。标记可以本身即可检测(例如，
放射性同位素标记或荧光标记)，或者就酶标记而言，可催化可检测
的底物化合物或组合物的化学变化。
“化疗剂”是可用于治疗癌症而不论作用机理的化合物。化疗剂包
括例如CD20拮抗剂诸如利妥昔单抗和环磷酰胺、多柔比星、长春新
碱、强的松、氟达拉滨、依托泊苷、甲氨蝶呤、雷利度胺、苯丁酸氮
芥、倍他司汀和/或此类化疗剂的改性形式。
诸如“治疗”或“以治疗”或“缓解”或“以缓解”的术语是指以下两
者：1)治愈、减缓、减少所诊断的病理状况或障碍的症状和/或阻止所
述病理状况或障碍的进展的治疗措施；以及2)防止和/或减慢所靶向
的病理状况或障碍的发展的预防或防止措施。因此，需要治疗的那些
包括已患有障碍的那些；有患有障碍倾向的那些；以及要防止其中的
障碍的那些。在某些实施方案中，如果患者表现出以下一种或多种情
况，则根据本发明的方法成功“治疗”了受试者的癌症：减少癌细胞数
量或完全不存在癌细胞；减小肿瘤大小；抑制或不存在癌细胞浸润到
周围器官，包括例如癌症扩散到软组织和骨骼；抑制或不存在肿瘤转
移；抑制或不存在肿瘤生长；缓解与具体癌症相关的一种或多种症状；
降低发病率和死亡率；改善生活质量；降低肿瘤的致瘤性、致瘤频率
或致瘤能力；降低肿瘤中癌干细胞的数量或频率；致瘤细胞分化成非
致瘤状态；或效果的某些组合。
如本文可互换使用的“多核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷
酸聚合物，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核
糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基、和/或它们的类似物，或可通过DNA
或RNA聚合酶结合到聚合物中的任何底物。多核苷酸可包括修饰的
核苷酸，诸如甲基化核苷酸和它们的类似物。核苷酸结构的修饰当存
在时可在聚合物组装前或组装后赋予。核苷酸的序列可通过非核苷酸
组分而中断。多核苷酸可在聚合反应后进一步修饰，诸如通过与标记
组分偶联。其它类型的修饰包括例如：“帽”；用类似物置换一个或多
个天然存在的核苷酸；核苷酸间修饰，诸如具有不带电键合(例如，
甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺、碳酸酯等)以及带电键合(例如，
硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些；含侧基部分的那些，诸如蛋
白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、多聚赖氨酸等)；含嵌入
剂(例如，吖啶、补骨脂素等)的那些；含螯合剂(例如，金属、放
射性金属、硼、氧化性金属等)的那些；含烷化剂的那些；含修饰键
合(例如α异头核酸等)的那些；以及多核苷酸的未修饰形式。另外，
通常存在于糖类中的任何羟基可例如被磷酸酯基团、磷酸基团取代，
由标准保护基团保护，或被活化以制备与另外核苷酸的另外键合，或
者可偶联到固体载体。5'和3'末端OH可以磷酸化或被胺或1至20
个碳原子的有机封端基团部分取代。其它羟基可以衍生化成标准保护
基团。多核苷酸还可以包括在本领域中熟知的核糖或脱氧核糖的类似
形式，包括例如2'-O-甲基-、2'-O-烯丙基、2'-氟代-或2'-叠氮基-核糖，
碳环糖类似物，α-异头糖，差向异构糖(诸如阿拉伯糖、木糖或来苏
糖)，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，无环类似物和无碱基核苷类似
物(诸如甲基核糖苷)。一个或多个磷酸二酯键合可被可供选择的连
接基团替换。这些可供选择的连接基团包括但不限于其中磷酸酯被
P(O)S(“硫代化物”)、P(S)S(“二硫代化物”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、
P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("formacetal")替换的实施方案，其中每
个R或R'独立地为H或取代的或未取代的任选地含醚(--O--)键合的
烷基(1-20C)、芳基、烯基、环烷基、环烯基或araldyl。不是多核苷
酸中的所有键都需要相同。前面的描述适用于本文提及的所有多核苷
酸，包括RNA和DNA。
术语“载体”是指能够在宿主细胞中递送并任选地表达一个或多
个基因或序列的构建体。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸DNA
或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关
的DNA或RNA表达载体、包封在脂质体中的DNA或RNA表达载
体以及某些真核细胞，诸如生产细胞。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，以指代任何长
度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，可以包含修饰的
氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖天然或通过干预
而修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、
磷酸化或任何其它操纵或修饰，诸如与标记组分偶联。该定义还包括
例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及
本领域已知的其它修饰的多肽。应当理解，由于本发明的多肽基于抗
体，因此在某些实施方案中，多肽可作为单链或关联链存在。
在两个或更多个核酸或多肽背景下的术语“相同的”或百分比“同
一性”是指在不考虑作为序列同一性一部分的任何保守氨基酸置换的
情况下进行最大对应性比较和比对(必要时引入空位)时，相同的或
具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或
子序列。百分比同一性可使用序列比较软件或算法或通过视觉检查而
测量。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的多种算法和软件在本领
域中是已知的。序列比对算法的一个这样的非限制性实例是在Karlin
等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268中所述的算法，如在
Karlin等,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中所改进，并结合
到NBLAST和XBLAST程序中(Altschul等,1991,NucleicAcidsRes.,
25:3389-3402)。在某些实施方案中，可如Altschul等,1997,Nucleic
AcidsRes.25:3389-3402中所述使用GappedBLAST。BLAST-2、
WU-BLAST-2(Altschul等,1996,MethodsinEnzymology,
266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,SouthSanFrancisco,
California)或Megalign(DNASTAR)是另外的可用于序列比对的公开
可用软件程序。在某些实施方案中，两核苷酸序列之间的百分比同一
性用GCG软件中的GAP程序测定(例如，使用NWSgapdna.CMP
矩阵以及40、50、60、70或90的空位权重和1、2、3、4、5或6的
长度权重)。在某些可供选择的实施方案中，可将结合了Needleman
和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的GCG软件包中
的GAP程序用于确定两氨基酸序列之间的百分比同一性(例如，使
用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4
的空位权重和1、2、3、4、5的长度权重)。作为另外一种选择，在
某些实施方案中，核苷酸或氨基酸序列之间的百分比同一性用Myers
和Miller的算法测定(CABIOS,4:11-17(1989))。例如，百分比同一性
可使用ALIGN程序(2.0版)并使用具有残基表的PAM120、12的
空位长度罚分和4的空位罚分测定。特定比对软件采用的最大比对的
合适参数可通过本领域的技术人员确定。在某些实施方案中，使用比
对软件的默认参数。在某些实施方案中，将第一氨基酸序列与第二氨
基酸序列的百分比同一性“X”计算为100×(Y/Z)，其中Y为在第一和
第二序列的比对(如通过视觉检查或特定的序列比对软件进行比对)
中评为相同匹配的氨基酸残基数，而Z为第二序列中的总残基数。如
果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的百分比同
一性将大于第二序列与第一序列的百分比同一性。
作为非限制性实例，可在某些实施方案中使用Bestfit程序
(Wisconsin序列分析软件包,Unix第8版,GeneticsComputerGroup,
UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,WI53711)确定
任何特定的多核苷酸是否具有与参考序列的某一百分比序列同一性
(例如，至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同，以及在一
些实施方案中，至少95％、96％、97％、98％或99％相同)。Bestfit
使用Smith和Waterman,AdvancesinAppliedMathematics2:482489
(1981)的局部同源性算法，以找到两序列之间同源性的最佳片段。当
根据本发明使用Bestfit或任何其它序列比对程序确定特定序列例如
是否与参考序列95％相同时，对参数的设置使得同一性的百分比在参
考核苷酸序列的整个长度上计算，并使得允许在参考序列总核苷酸数
最多5％的同源性中存在空位。
在一些实施方案中，本发明的两种核酸或多肽基本上相同，也就
是说当使用序列比较算法或通过视觉检查进行最大对应性比较和比
对时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少
90％并在一些实施方案中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷
酸或氨基酸残基同一性。同一性可存在于长度为至少约10个、约20
个、约40-60个或其间的任何整数个残基的序列区域上，并可在长于
60-80个残基例如至少约90-100个残基的区域上，并且在一些实施方
案中，序列在进行比较的序列(诸如核苷酸序列的编码区)的整个长
度上基本上相同。
“保守氨基酸置换”是其中将一个氨基酸残基替换为具有相似侧
链的另一氨基酸残基的置换。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本
领域中已有所定义，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、
酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(如甘氨酸、天
冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性
侧链(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、
甲硫氨酸、色氨酸)、β-支化侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)
和芳族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用苯
丙氨酸置换酪氨酸是保守置换。在一些实施方案中，在本发明的多肽
和抗体序列中的保守置换不会消除含有氨基酸序列的多肽或抗体与
抗原(即多肽或抗体所结合的EGFR)的结合。识别不消除抗原结合
的核苷酸和氨基酸保守置换的方法在本领域中是熟知的(参见例如
Brummell等,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi等ProteinEng.
12(10):879-884(1999)；以及Burks等Proc.Natl.Acad.Sci.USA
94:.412-417(1997))。
如在本公开和权利要求中所用，除非上下文另外明确指出，否则
单数形式“一”、“一种”、“该/所述”也包括复数形式。
应当理解，无论何处本文用语言“包含”来描述实施方案时，也提
供以“由...组成”和/或“基本上由...组成”描述的其它类似实施方案。
本文用在诸如“A和/或B”的短语中的术语“和/或”旨在包括“A和
B”、“A或B”、"A"和"B"。同样，用在诸如“A、B和/或C”的短语中
的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案中的每一个：A、B和C；A、B
或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独
的)；B(单独的)和C(单独的)。
II.EGFR结合剂
肿瘤通常过表达结合多种配体并促使肿瘤无限制生长的生长因
子受体。此类生长因子受体的一个实例为表皮生长因子受体(EGFR)
蛋白质家族的受体。
通过表皮生长因子受体(EGFR)蛋白质家族的成员的信号转导依
赖于通过配体结合而触发的同源二聚体或异源二聚体的形成。这一受
体家族由四种膜结合蛋白质构成：EGFR、HER2/neu、HER3和HER4。
这些蛋白质的过表达已在许多类型的癌症中与不良预后存在关联，这
些癌症包括但不限于：乳腺、结肠、卵巢、子宫内膜、胃、胰腺、前
列腺和唾液腺癌。虽然许多小组已开发了靶向EGFR蛋白质家族的各
个成员(例如HER2/neu或EGFR)的策略来抑制肿瘤生长，但是尚
未证实这些治疗能最终治愈这些形式的癌症。
根据本发明，提供了特异性结合到EGFR的新型药剂(例如抗
体)。这些新型药剂为非EGFR拮抗性的。然而，当附接到效应子(例
如，作为免疫偶联物)时，效应子补救杀伤活性，使得免疫偶联物可
起到抑制靶细胞生长和/或增殖的作用。
因此，本发明提供特异性结合EGFR的药剂。这些药剂在本文称
为“EGFR结合剂"。所述的EGFR结合剂与现有技术的EGFR结合剂
的不同之处在于它们为非拮抗性抗体，并可以为弱激动性的。
在某些实施方案中，EGFR结合剂为抗体、免疫偶联物或多肽。
在一些实施方案中，EGFR结合剂为人源化抗体。
在某些实施方案中，EGFR结合剂具有以下效果中的一种或多
种：抑制肿瘤细胞增殖、通过降低肿瘤中癌干细胞的频率而降低肿瘤
的致瘤性、抑制肿瘤生长、提高存活率、触发肿瘤细胞的细胞死亡、
将致瘤细胞分化成非致瘤状态或防止肿瘤细胞转移。
在一些实施方案中，EGFR结合剂能够减小肿瘤体积。EGFR结
合剂减小肿瘤体积的能力可例如通过测量％T/C值而评估，该值是进
行治疗的受试者的中位肿瘤体积除以对照受试者的中位肿瘤体积。在
一些实施方案中，用EGFR结合剂治疗导致小于约55％、小于约50％、
小于约45％、小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、
小于约20％、小于约15％、小于约10％或小于约5％的％T/C值。
在某些实施方案中，特异性结合人EGFR的免疫偶联物或其它药
剂通过细胞毒剂触发细胞死亡。例如，在某些实施方案中，将人EGFR
的抗体偶联到美登木素，而美登木素则在表达EGFR的肿瘤细胞中通
过蛋白质内化而激活。在某些可供选择的实施方案中，药剂或抗体未
偶联。
在某些实施方案中，EGFR结合剂能够抑制肿瘤生长。在某些实
施方案中，EGFR结合剂能够在体内(例如，在异种移植小鼠模型中
和/或在患有癌症的人类中)抑制肿瘤生长。
EGFR结合剂包括EGFR抗体ML66和EGFR-8及其片段、变体
和衍生物。EGFR结合剂还包括特异性结合到与抗体ML66和EGFR-8
相同的EGFR表位的EGFR结合剂。EGFR结合剂还包括竞争性抑制
ML66和EGFR-8抗体的EGFR结合剂。编码ML66的重链和轻链序
列的质粒于2010年10月21日以给定的保藏号PTA-11424保藏在美
国典型培养物保藏中心(ATCC)。编码EGFR-8的杂交瘤于2010年10
月21日以给定的保藏号PTA-11423保藏在ATCC。
EGFR结合剂还包括含有ML66和EGFR-8的重链和轻链CDR
序列的EGFR结合剂。ML66和EGFR-8的CDR序列(鼠和人源化
的)在下表1和2中描述。
表1：可变重链CDR氨基酸序列
表2：可变轻链CDR氨基酸序列
EGFR结合分子可以为特异性结合到EGFR的抗体或抗原结合片
段，其包含ML66或EGFR-8的CDR，而每个CDR具有最多四个(即，
0、1、2、3或4个)保守氨基酸置换。
多肽可包含本文所述的各条可变轻链或可变重链之一。抗体和多
肽还可以同时包含可变轻链和可变重链。鼠和人源化ML66和
EGFR-8抗体的可变轻链和可变重链序列在下表3和4中提供。
表3：可变重链氨基酸序列
表4:可变轻链氨基酸序列
本发明还提供包括以下的多肽：(a)具有与SEQIDNO:17-20至少
约90％序列同一性的多肽；和/或(b)具有与SEQIDNO:21-24至少约
90％序列同一性的多肽。在某些实施方案中，该多肽包括具有与SEQ
IDNO:17-24至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或
至少约99％序列同一性的多肽。因此，在某些实施方案中，该多肽包
括：(a)具有与SEQIDNO:17-20至少约95％序列同一性的多肽，和/
或(b)具有与SEQIDNO:21-24至少约95％序列同一性的多肽。在某
些实施方案中，该多肽包括(a)具有SEQIDNO:17-20的氨基酸序列的
多肽；和/或(b)具有SEQIDNO:21-24的氨基酸序列的多肽。在某些
实施方案中，该多肽为特异性结合EGFR的抗体和/或多肽。在某些
实施方案中，该多肽为特异性结合EGFR的鼠、嵌合或人源化抗体。
在某些实施方案中，具有与SEQIDNO:17-24某一百分比序列同一性
的多肽与SEQIDNO:17-24的不同之处只在于保守氨基酸置换。
表5：全长重链和轻链氨基酸序列
本发明还提供包括以下的多肽：(a)具有与SEQIDNO:25和27
至少约90％序列同一性的多肽；和/或(b)具有与SEQIDNO:26和28
至少约90％序列同一性的多肽。在某些实施方案中，该多肽包括具有
与SEQIDNO:25-28至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少
约98％或至少约99％序列同一性的多肽。因此，在某些实施方案中，
该多肽包括：(a)具有与SEQIDNO:25和27至少约95％序列同一性
的多肽，和/或(b)具有与SEQIDNO:26和28至少约95％序列同一性
的多肽。在某些实施方案中，该多肽包括(a)具有SEQIDNO:25和27
的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQIDNO:26和28的氨基酸序
列的多肽。在某些实施方案中，该多肽为特异性结合EGFR的抗体和
/或多肽。在某些实施方案中，该多肽为特异性结合EGFR的人源化
抗体。在某些实施方案中，具有与SEQIDNO:25-28某一百分比序列
同一性的多肽与SEQIDNO:25-28的不同之处只在于保守氨基酸置
换。
单克隆抗体可使用杂交瘤方法制备，诸如Kohler和Milstein(1975)
Nature256:495所述的那些方法。使用杂交瘤方法，将小鼠、仓鼠或
其它合适的宿主动物如上所述进行免疫，以引起通过淋巴细胞产生将
特异性结合到免疫抗原的抗体。淋巴细胞也可在体外进行免疫。在免
疫后，将淋巴细胞分离并使用例如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞系融
合，以形成杂交瘤细胞，然后可将其从未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细
胞中选出。然后，可在使用标准方法的体外培养中(Goding,
MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,1986)
或在动物体内作为腹水瘤，使产生抗所选抗原的特异性单克隆抗体的
杂交瘤繁殖，其中抗抗原性通过免疫沉淀法、免疫印迹或通过体外结
合测定法(例如放射性免疫测定法(RIA)、酶联免疫吸附测定法
(ELISA))而测定。然后可如上文针对多克隆抗体所述将单克隆抗体
从培养基或腹水中纯化。
作为另外一种选择，单克隆抗体也可使用如美国专利4,816,567
中所述的重组DNA方法制备。将编码单克隆抗体的多核苷酸从成熟
的B细胞或杂交瘤细胞中分离，诸如使用特异性扩增编码抗体重链
和轻链的基因的寡核苷酸引物通过RT-PCR进行分离，然后使用常规
程序测定它们的序列。接着将编码重链和轻链的分离的多核苷酸克隆
进合适的表达载体，其在转染进原本不会产生免疫球蛋白的诸如大肠
杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞的
宿主细胞中时，由宿主细胞产生单克隆抗体。另外，可如文献所述从
表达所需物种CDR的噬菌体展示文库中分离所需物种的重组单克隆
抗体或其片段(McCafferty等,1990,Nature,348:552-554；Clackson
等,1991,Nature,352:624-628；和Marks等,1991,J.Mol.Biol.,
222:581-597)。
可使用重组DNA技术以多种不同的方式对编码单克隆抗体的多
核苷酸进一步改性，以生成可供选择的抗体。在一些实施方案中，可
将例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域替换为1)例如人
抗体的那些区域以生成嵌合抗体，或2)非免疫球蛋白多肽以生成融合
抗体。在一些实施方案中，将恒定区截短或移除以生成单克隆抗体的
所需抗体片段。可变区的定点或高密度诱变可用于优化单克隆抗体的
特异性、亲和力等。
在一些实施方案中，人EGFR的单克隆抗体为人源化抗体。在某
些实施方案中，此类抗体在施用给人类受试者时在治疗学上用于降低
抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)反应。人源化抗体可使用本领域
已知的多种技术产生。在某些可供选择的实施方案中，EGFR的抗体
为人抗体。
人抗体可使用本领域已知的多种技术直接制备。可以生成在体外
免疫的或从产生抗靶抗原抗体的免疫个体中分离的永生化人类B淋
巴细胞(参见例如Cole等,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,
AlanR.Liss,第77页(1985)；Boemer等,1991,J.Immunol.,147
(1):86-95；和美国专利5,750,373)。另外，人抗体可以选自噬菌体文
库，其中该噬菌体文库表达人抗体，如例如在Vaughan等,1996,Nat.
Biotech.,14:309-314；Sheets等,1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.,
95:6157-6162；Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；以
及Marks等,1991,J.Mol.Biol.,222:581中所述。生成和使用抗体噬菌
体文库的技术还在以下文献中有所描述：美国专利号5,969,108、
6,172,197、5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915、
6,593,081、6,300,064、6,653,068、6,706,484和7,264,963；以及Rothe
等,2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(其中的每一者均
全文以引用方式并入)。亲和力成熟策略和链改组策略(Marks等,
1992,Bio/Technology10:779-783，以引用方式全文并入)在本领域中
是已知的并可用于生成高亲和力人抗体。
人源化抗体也可以在含有人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中
制备，该基因座在免疫时能够在不存在内源性免疫球蛋白产生的情况
下产生全谱人抗体。该方法在美国专利5,545,807、5,545,806、
5,569,825、5,625,126、5,633,425和5,661,016中有所描述。
本发明还涵盖特异性识别EGFR的双特异性抗体。双特异性抗体
是能够特异性识别和结合至少两个不同的表位的抗体。所述不同的表
位可在同一分子(例如同一EGFR)内，或在不同的分子上使得例如
抗体既可特异性识别和结合EGFR也可特异性识别和结合例如1)白
细胞上的效应分子，诸如T细胞受体(例如CD3)或Fc受体(例如
CD64、CD32或CD16)或2)如下文将详细描述的细胞毒剂。
示例性双特异性抗体可结合到两个不同的表位，其中至少一个源
于本发明的多肽。作为另外一种选择，可将免疫球蛋白分子的抗抗原
臂与结合到白细胞上的触发分子诸如T细胞受体分子(例如CD2、
CD3、CD28或B7)或IgG的Fc受体的臂结合，以便使细胞防御机
制集中表达特定抗原的细胞。双特异性抗体还可用于将细胞毒剂导向
表达特定抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合臂以及结合细胞毒剂或
放射性核素螯合剂诸如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。制
备双特异性抗体的技术在本领域中是常见的(Millstein等,1983,
Nature305:537-539；Brennan等,1985,Science229:81；Suresh等,1986,
MethodsinEnzymol.121:120；Traunecker等,1991,EMBOJ.
10:3655-3659；Shalaby等,1992,J.Exp.Med.175:217-225；Kostelny
等,1992,J.Immunol.148:1547-1553；Gruber等,1994,J.Immunol.
152:5368；以及美国专利5,731,168)。还可以想到具有不止两种效价
的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt等,J.Immunol.147:60
(1991))。因此，在某些实施方案中，EGFR的抗体为多特异性的。
在某些实施方案中，提供了抗体片段以例如增强肿瘤渗透。用于
产生抗体片段的多种技术是已知的。通常，这些片段通过完整抗体的
蛋白水解消化而产生(例如Morimoto等,1993,JournalofBiochemical
andBiophysicalMethods24:107-117；Brennan等,1985,Science,
229:81)。在某些实施方案中，抗体片段通过重组法产生。Fab、Fv
和scFv抗体片段都可在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达以及从中分
泌，从而允许产生大量的这些片段。此类抗体片段也可从上述抗体噬
菌体文库中分离。抗体片段也可以为例如美国专利5,641,870中所述
的线性抗体，并可以为单特异性的或双特异性的。用于产生抗体片段
的其它技术对本领域的技术人员将显而易见。
根据本发明，可使技术适于产生EGFR的特异性单链抗体(参见
美国专利号4,946,778)。此外，可使方法适于构建Fab表达文库(Huse,
等,Science246:1275-1281(1989))，以允许快速有效地鉴定具有所需
EGFR特异性的单克隆Fab片段，或其衍生物、片段、类似物或同系
物。可通过本领域的技术产生抗体片段，包括但不限于：(a)通过抗体
分子的胃蛋白酶消化而产生的F(ab')2片段；(b)通过还原F(ab')2片段
的二硫桥而生成的Fab片段；(c)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体
分子而生成的Fab片段；以及(d)Fv片段。
还可能所需的是，尤其是在抗体片段的情况下，对抗体进行修饰
以延长其半衰期。这可例如通过以下方式实现：通过抗体片段中合适
区域的突变将补救受体结合表位结合到抗体片段中；或将表位结合到
肽标签中，然后将肽标签在末端或中间融合到抗体片段(例如，通过
DNA或肽合成)。
异源偶联(heteroconjugate)抗体也在本发明的范围内。异源偶联抗
体由两个共价接合的抗体构成。此类抗体已例如被提出用于将免疫细
胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)。据设想，可使用合成
蛋白质化学中的已知方法在体外制备抗体，包括涉及交联剂的那些方
法。例如，可使用二硫键交换反应或通过形成硫醚键而构建免疫毒素。
用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和甲
基-4-巯基丁酰亚氨酸酯(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。
出于本发明的目的，应当理解，修饰的抗体可包含任何类型的可
变区，其提供抗体与人EGFR的多肽的缔合。就这一点而言，可变区
可包含或衍生自可被诱导以引起体液反应并生成抗所需肿瘤相关抗
原的免疫球蛋白的哺乳动物的任何类型。因此，修饰抗体的可变区可
例如具有人、鼠、非人灵长类(例如食蟹猴、恒河猴等)或狼起源。
在一些实施方案中，修饰免疫球蛋白的可变区和恒定区均为人的。在
其它实施方案中，可对相容抗体的可变区(通常衍生自非人类来源)
进行工程化处理或专门定制以改善结合特性或降低分子的免疫原性。
在此方面，可用于本发明的可变区可以人源化或通过包含导入的氨基
酸序列而以其方式改变。
在某些实施方案中，重链和轻链两者中的可变结构域通过至少部
分地替换一个或多个CDR并在必要时通过部分骨架区替换和序列变
化而改变。虽然CDR可衍生自与骨架区衍生自的抗体同一类或甚至
同一亚类的抗体，但是据设想，CDR将衍生自不同类的抗体并可能
衍生自不同种的抗体。将一个可变结构域的抗原结合能力转移到另一
个时，并不总是需要将所有的CDR都替换成供体可变区的完整CDR。
相反，在一些情况下，只需要转移保持抗原结合位点活性所必需的那
些残基。考虑到在美国专利号5,585,089、5,693,761和5,693,762中所
述的解释，本领域的技术人员完全能够通过执行常规实验或通过试错
试验获得具有降低的免疫原性的功能性抗体。
尽管提到对可变区的改变，但是本领域的技术人员将会认识到，
本发明的修饰抗体将包括与包含天然或未改变恒定区的免疫原性大
致相同的抗体相比时恒定区结构域的一个或多个的至少一部分发生
缺失或以其它方式改变以便提供所需的生化特性(诸如增强的肿瘤定
位或缩短的血清半衰期)的抗体(例如，全长抗体或其免疫反应性片
段)。在一些实施方案中，修饰抗体的恒定区将包括人类恒定区。与
本发明相容的对恒定区的修饰包括在一个或多个结构域中的一个或
多个氨基酸的添加、缺失或置换。也就是说，本文所公开的修饰抗体
可包含对三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)和/或对轻链恒
定结构域(CL)的一者或多者的改变或修饰。在一些实施方案中，设想
了其中一个或多个结构域部分或完全缺失的修饰恒定区。在一些实施
方案中，修饰抗体将包括其中整个CH2结构域都被移除的结构域缺
失的构建体或变体(ΔCH2构建体)。在一些实施方案中，省去的恒
定区结构域将被短氨基酸间隔物(例如10个残基)替换，该间隔物
提供一定程度的通常因不存在恒定区而赋予的分子柔性。
除了它们的构型外，本领域还已知恒定区介导多种效应子功能。
例如，抗体补体C1组分的结合激活补体系统。补体的激活在细胞病
原体的调理作用和裂解中具有重要意义。补体的激活还刺激炎性反应
并且还可牵涉在自身免疫超敏反应中。另外，抗体通过Fc区结合到
细胞，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合到细胞上的Fc受体
(FcR)。存在许多对不同类的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ
受体)、IgE(η受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞
表面上Fc受体的结合触发许多重要而各异的生物学反应，包括抗体
包被离子的吞入和毁坏、免疫复合物的清除、通过杀伤细胞裂解抗体
包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、
释放炎症介质、胎盘转移以及控制免疫球蛋白的产生。
在某些实施方案中，EGFR结合抗体提供改变的效应子功能，继
而影响所施用的抗体的生物学特征。例如，恒定区结构域的缺失或失
活(通过点突变或其它方式)可减少循环性修饰抗体的Fc受体结合，
从而增强肿瘤定位。在其它情况下，可能的是，根据本发明的恒定区
修饰适度减少补体结合，并因而缩短血清半衰期以及减少偶联的细胞
毒素的非特异性缔合。恒定区的其它修饰可用于消除二硫键或寡糖部
分，从而可因增强的抗原特异性或抗体柔性而实现增强的定位。相似
地，根据本发明的对恒定区的修饰可使用完全在技术人员能力范围内
的熟知的生物化学或分子学工程技术而容易地实现。
在某些实施方案中，为抗体的EGFR结合剂不具有一个或多个效
应子功能。例如，在一些实施方案中，抗体不具有抗体依赖性细胞毒
性(ADCC)活性和/或不具有补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些
实施方案中，抗体不结合到Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案
中，抗体不具有效应子功能。
应当注意，在某些实施方案中，可对修饰的抗体进行工程化处理
以将CH3结构域直接融合到相应修饰抗体的铰链区。在其它构建体
中，可能所需的是在铰链区与修饰的CH2和/或CH3结构域之间提供
肽间隔物。例如，可表达其中CH2结构域缺失而剩余的CH3结构域
(修饰或未修饰)通过5-20个氨基酸间隔物接合到铰链区的相容构
建体。可添加这样的间隔物，例如以确保恒定结构域的调控元件保持
自由并可接近，或确保铰链区保持柔性。然而，应该指出的是，氨基
酸间隔物可在一些情况下显示出免疫原性并引起针对构建体不想要
的免疫反应。因此，在某些实施方案中，添加到构建体的任何间隔物
将相对无免疫原性，或甚至完全没有免疫原性，以便维持修饰抗体的
所需生化品质。
除了整个恒定区结构域的缺失外，应当理解，可通过少数或甚至
单个氨基酸的部分缺失或置换而提供本发明的抗体。例如，在CH2
结构域的所选区域中的单个氨基酸突变可足以实质性减少Fc结合并
因而增强肿瘤定位。相似地，可能所需的是，只使控制待调节的效应
子功能(例如，补体CLQ结合)的一个或多个恒定区结构域的一部
分缺失。恒定区的此类部分缺失可改善抗体的所选特性(血清半衰
期)，而保留与完整的受试者恒定区结构域相关的其它所需功能。此
外，如上所述，本发明所公开的抗体的恒定区可通过增强所得构建体
特征的一个或多个氨基酸的突变或置换而修饰。在该方面，可能的是
破坏由保守结合位点(例如Fc结合)提供的活性，而基本上维持修
饰抗体的构型和免疫特征。某些实施方案可包括向恒定区添加一个或
多个氨基酸，以增强所需的特性，诸如减弱或增强效应子功能或提供
更多的细胞毒素或碳水化合物连接。在此类实施方案中，可能所需的
是，插入或复制衍生自所选恒定区结构域的特定序列。
本发明进一步包括基本上与本文所示的嵌合、人源化和人抗体或
其抗体片段同源的变体和等同物。这些可包含例如保守置换突变，即
一个或多个氨基酸被相似的氨基酸置换。例如，保守置换是指一个氨
基酸被同一大类中的另一氨基酸置换，诸如一个酸性氨基酸被另一个
酸性氨基酸置换，一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸置换，或一个
中性氨基酸被另一个中性氨基酸置换。保守氨基酸置换的目的在本领
域中是熟知的。
本发明的多肽可以是包含人EGFR的抗体或其片段的重组多肽、
天然多肽或合成多肽。在本领域中应当认识到，本发明的一些氨基酸
序列可在不明显影响蛋白质结构或功能的情况下变化。因此，本发明
进一步包括表现出显著活性或包含EGFR蛋白质的抗体或其片段的
区域的多肽变型形式。此类突变体包含缺失、插入、倒位、重复和类
型置换。
多肽和类似物可进一步修饰以包含通常不是蛋白质一部分的另
外化学部分。那些衍生化的部分可改善溶解性、生物半衰期或蛋白质
吸收。所述部分还可以减少或消除蛋白质的任何不良副作用等。这些
部分的概述可见于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,
第20版,MackPublishingCo.,Easton,PA(2000)。
本文所述的分离的多肽可通过本领域已知的任何合适的方法产
生。此类方法涵盖了从直接的蛋白质合成方法到构建编码分离多肽序
列的DNA序列并将那些序列在合适的转化宿主中表达。在一些实施
方案中，使用重组技术通过分离或合成编码所关注野生型蛋白质的
DNA序列而构建DNA序列。任选地，可通过位点特异性诱变对序列
进行诱变处理以提供其功能类似物。参见例如Zoeller等,Proc.Nat’l.
Acad.Sci.USA81:5662-5066(1984)和美国专利号4,588,585。
在一些实施方案中，编码所关注多肽的DNA序列将通过使用寡
核苷酸合成仪的化学合成方法构建。此类寡核苷酸可基于以下方面而
设计：所需多肽的氨基酸序列，以及选择那些在将要产生所关注重组
多肽的宿主细胞中偏好的密码子。可将标准方法用于合成编码所关注
分离多肽的分离多核苷酸序列。例如，可将完整的氨基酸序列用于构
建反向翻译的基因。另外，可以合成包含编码特定分离多肽的核苷酸
序列的DNA寡聚物。例如，可以合成编码所需多肽的多个部分的多
个小寡核苷酸，然后进行连接。各个寡核苷酸通常包含5'或3'悬垂，
以用于互补组装。
组装(通过合成、定点诱变或另一种方法)后，将编码所关注的
特定分离多肽的多核苷酸序列插入表达载体并可操作地连接到适合
在所需宿主中表达蛋白质的表达控制序列。正确的组装可通过以下方
法加以确认：核苷酸测序、限制性酶切作图以及在合适的宿主中表达
生物活性多肽。本领域熟知的是，为了在宿主中获得转染基因的高表
达水平，必须将基因可操作地连接到在所选的表达宿主中为功能性的
转录和翻译表达控制序列。
在某些实施方案中，将重组表达载体用于扩增和表达编码人
EGFR抗体或其片段的DNA。重组表达载体是可复制的DNA构建体，
其具有编码抗EGFR抗体或其片段的多肽链的合成的或衍生自cDNA
的DNA片段，该片段可操作地连接到衍生自哺乳动物、微生物、病
毒或昆虫基因的合适转录或翻译调控序列。转录单元通常包含以下部
分的组合件：(1)在基因表达中具有调控作用的一个或多个遗传元件，
例如转录启动子或增强子；(2)转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构
或编码序列；以及(3)合适的转录和翻译起始和终止序列，如将在下
文详细描述。此类调控元件可包括控制转录的操纵子序列。另外还可
以包含通常由复制起点赋予的在宿主中的复制能力以及有利于识别
转化体的选择基因。DNA区域在它们彼此功能相关时则为可操作连
接的。例如，在以下情况中则为将信号肽的DNA(分泌前导序列)
可操作地连接到多肽的DNA：所述信号肽的DNA作为参与所述多肽
分泌的前体而表达；在以下情况中则为将启动子可操作地连接到编码
序列：所述启动子控制所述序列的转录；或在以下情况中则为将核糖
体结合位点可操作地连接到编码序列：所述核糖体结合位点的定位可
使得允许翻译。旨在用于酵母表达系统的结构元件包括使得能够通过
宿主细胞在胞外分泌翻译蛋白质的前导序列。作为另外一种选择，如
果重组蛋白在没有前导序列或转运序列的情况下表达，则其可以包含
N端甲硫氨酸残基。该残基可任选地随后从所表达的重组蛋白上裂
解，以提供最终产物。
表达控制序列和表达载体的选择将取决于宿主的选择。可以采用
多种表达宿主/载体组合。可用于真核宿主的表达载体包括例如含有
来自SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的
载体。可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如得自大
肠杆菌(Esherichiacoli)的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9及其衍
生物；更宽宿主范围的质粒，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。
适合表达EGFR结合多肽或抗体(或将用作抗原的EGFR蛋白质)
的宿主细胞包括受合适启动子控制的原核生物、酵母、昆虫或更高等
的真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大
肠杆菌或杆菌。更高等的真核细胞包括如下所述的哺乳动物源的确立
细胞系。也可采用无细胞的翻译系统。适合与细菌、真菌、酵母和哺
乳动物细胞宿主一起使用的克隆和表达载体由Pouwels等(Cloning
Vectors:ALaboratoryManual,Elsevier,N.Y.,1985)进行了描述，该文献
的相关公开内容据此以引用方式并入。关于产生蛋白质(包括产生抗
体)的方法的另外信息可见于例如美国专利公布号2008/0187954、美
国专利号6,413,746和6,660,501以及国际专利公布号WO04009823，
它们中的每一者据此以引用方式全文并入本文。
多种哺乳动物或昆虫细胞培养系统也有利地用于表达重组蛋白。
可在哺乳动物细胞中进行重组蛋白的表达，因为此类蛋白通常正确折
叠、适当修饰并具有完整的功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例
包括Gluzman(Cell23:175,1981)所述的猴肾细胞的COS-7细胞系，
以及其它能够表达合适载体的细胞系，包括例如L细胞、C127、3T3、
中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可包
含非转录元件，诸如复制起点、连接到待表达的基因的合适的启动子
和增强子、和其它5'或3'侧翼非转录序列、以及5'或3'非翻译序列，
诸如必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位
点以及转录终止序列。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白的杆状病毒系
统在Luckow和Summers,Bio/Technology6:47(1988)中进行了综述。
通过转化宿主产生的蛋白质可根据任何合适的方法纯化。此类标
准方法包括层析(例如，离子交换层析、亲和层析和分级柱层析)、
离心、差别溶解或通过用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。可将诸
如六聚组氨酸、麦芽糖结合域、流感病毒外壳蛋白序列和谷胱甘肽
S-转移酶的亲和标签附接到蛋白质，以允许通过经过合适的亲和柱而
容易地纯化。分离的蛋白质还可使用诸如蛋白质水解、核磁共振和X
射线晶体学进行物理表征。
例如，可使用市售蛋白质浓缩过滤器例如Amicon或Millipore
Pellicon超滤单元首先对将重组蛋白分泌进培养基中的系统的上清液
进行浓缩。在浓缩步骤后，可将浓缩物施加到合适的纯化基质上。作
为另外一种选择，可以采用离子交换树脂，例如具有二乙氨乙基
(DEAE)侧基的基质或基材。基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、
纤维素或常用于蛋白质纯化的其它类型。作为另外一种选择，可以采
用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括含有磺丙基或羧甲基的
多种不溶性基质。最后，可采用使用疏水性RP-HPLC介质(例如具
有甲基或其它脂族侧基的硅胶)的一个或多个反相高效液相色谱
(RP-HPLC)步骤，以进一步纯化EGFR结合剂。还可以按多种组合形
式采用某些或全部上述纯化步骤，以提供均匀的重组蛋白。
在细菌培养中产生的重组蛋白可例如通过以下方法分离：首先从
细胞沉淀中提取，然后进行一个或多个浓缩、盐析、水性离子交换或
尺寸排阻色谱步骤。可将高效液相色谱(HPLC)用于最终纯化步骤。
用于重组蛋白表达的微生物细胞可通过任何便利的方法破坏，包括冻
融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂。
本领域已知用于纯化抗体和其它蛋白质的方法还包括例如在美
国专利公布号2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中所述
的那些，它们均据此以引用方式全文并入本文。
在某些实施方案中，EGFR结合剂为非抗体的多肽。用于鉴定和
产生以高亲和力结合到蛋白靶标的非抗体多肽的多种方法在本领域
中是已知的。参见例如Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304
(2007)；Hosse等,ProteinScience,15:14-27(2006)；Gill等,Curr.Opin.
Biotechnol.,17:653-658(2006)；Nygren,FEBSJ.,275:2668-76(2008)
和Skerra,FEBSJ.,275:2677-83(2008)，它们均以引用方式全文并入
本文。在某些实施方案中，噬菌体展示技术已用于鉴定/产生EGFR
结合多肽。在某些实施方案中，多肽包括选自以下类型的蛋白质支架：
蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域和
硫氧还蛋白。
在一些实施方案中，所述药剂为非蛋白质分子。在某些实施方案
中，所述药剂为小分子。可用于鉴定非蛋白质EGFR结合剂的组合化
学库和技术对本领域的技术人员是已知的。参见例如Kennedy等,J.
Comb.Chem,10:345-354(2008)；Dolle等,J.Comb.Chem.,9:855-902
(2007),和Bhattacharyya,Curr.Med.Chem.,8:1383-404(2001)，它们
均以引用方式全文并入本文。在某些进一步的实施方案中，所述药剂
为碳水化合物、糖胺聚糖、糖蛋白或蛋白聚糖。
在某些实施方案中，所述药剂为核酸适配子。适配子是已基于它
们结合到另一分子的能力而加以选择(例如，从随机或经诱变处理的
库中)的多核苷酸分子。在一些实施方案中，适配子包括DNA多核
苷酸。在某些可供选择的实施方案中，适配子包括RNA多核苷酸。
在某些实施方案中，适配子包含一个或多个经修饰的核酸残基。生成
和筛选接合到蛋白质的核酸适配子的方法在本领域中是熟知的。参见
例如美国专利号5,270,163、美国专利号5,683,867、美国专利号
5,763,595、美国专利号6,344,321、美国专利号7,368,236、美国专利
号5,582,981、美国专利号5,756,291、美国专利号5,840,867、美国专
利号7,312,325、美国专利号7,329,742、国际专利公布号WO
02/077262、国际专利公布号WO03/070984、美国专利申请公布号
2005/0239134、美国专利申请公布号2005/0124565和美国专利申请公
布号2008/0227735，它们均以引用方式全文并入本文。
III.免疫偶联物
本发明还涉及包含连接到或偶联到药物或前药的如本文所公开
的抗EGFR抗体、抗体片段及其功能等同物的偶联物(也称为免疫偶
联物)。合适的药物或前药在本领域中是已知的。该药物或前药可以
是细胞毒剂。用于本发明的细胞毒性偶联物的细胞毒剂可以是导致细
胞死亡，或诱导细胞死亡或以某一方式降低细胞活力的任何化合物，
并包括例如美登木素和美登木素类似物。其它合适的细胞毒剂为例如
苯二氮类、紫杉烷类、CC-1065和CC-1065类似物、倍癌霉素类和
倍癌霉素类似物、烯二炔类(诸如加利车霉素)、多拉司他汀和多拉
司他汀类似物(包括奥里斯他汀类)、茅层霉素衍生物、来普霉素衍
生物、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长
春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥和吗啉代多柔比星。
此类偶联物可通过使用连接基制备，以便将药物或前药连接到抗
体或功能等同物。合适的连接基在本领域中是熟知的，并包括例如二
硫基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团
和酯酶不稳定基团。
药物或前药可例如通过二硫键连接到抗EGFR抗体或其片段。连
接基分子或交联剂包含可与抗EGFR抗体或其片段反应的反应性化
学基团。与细胞结合剂反应的反应性化学基团可以为N-琥珀酰亚胺
基酯和N-磺基琥珀酰亚胺基酯。另外，连接基分子包含可以是可与
药物反应形成二硫键的二硫代吡啶基的反应性化学基团。连接基分子
包括例如N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)(参见例
如Carlsson等,Biochem.J.,173:723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺基
4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)(参见例如美国专利号4,563,304)、
N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)(参见
美国专利公布号20090274713)、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)
戊酸酯(SPP)(参见例如CAS登录号341498-08-6)、2-亚氨基硫烷或
乙酰基琥珀酸酐。例如，抗体或细胞结合剂可通过交联试剂修饰，然
后将因此衍生的含有游离或保护硫醇基团的抗体或细胞结合剂与含
二硫键或硫醇的美登木素反应，以产生偶联物。偶联物可通过色谱法
纯化，包括但不限于HPLC、尺寸排阻、吸附、离子交换和亲和捕获、
渗析或切向流过滤。
在本发明的另一方面，将抗EGFR抗体通过二硫键和聚乙二醇间
隔物连接到细胞毒性药物，以增强免疫偶联物的效力、溶解性或功效。
此类可裂解的亲水性连接基在WO2009/0134976中有所描述。此连接
基设计的另外有益效果是抗体-药物偶联物的所需高单体比和最少聚
集。在该方面具体设想了通过具有聚乙二醇间隔物((CH2CH2O)n＝1-14)
的二硫基(-S-S-)连接的细胞结合剂与药物的偶联物，其具有2-8的窄
范围的载药量，表现出相对高效的对癌细胞的生物活性，并具有所需
的高偶联得率和高单体比以及最少蛋白质聚集的生化特性。
在该方面具体涵盖的是式(I)的抗EGFR抗体药物偶联物或式(I')
的偶联物：
CB–[Xl–(–CH2–CH2O–)n–Y–D]m(I)
[D-Y-(–CH2–CH2O–)n–Xl]m-CB(I')
其中：
CB代表抗EGFR抗体或片段；
D代表药物；
X代表通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸键或醚键附接到细胞结合
剂的脂族、芳族或杂环单元；
Y代表通过二硫键附接到药物的脂族、芳族或杂环单元；
l是0或1；
m是2至8的整数；以及
n是1至24的整数。
在一些实施方案中，m是2至6的整数。
在一些实施方案中，m是3至5的整数。
在一些实施方案中，n是2至8的整数。作为另外一种选择，如
在例如美国专利号6,441,163和7,368,565中所公开，可首先对药物进
行修饰以引入适合与细胞结合剂反应的反应性酯。这些含活化的连接
基部分的药物与细胞结合剂的反应提供另一种产生细胞结合剂药物
偶联物的方法。还可使用PEG连接基将美登木素类连接到抗EGFR
抗体或片段，如例如在美国专利6,716,821中所述。这些PEG不可裂
解连接基团既可溶于水也可用于非水性溶剂，并可用于将一种或多种
细胞毒剂接合到细胞结合剂。示例性PEG连接基团包括杂双官能PEG
连接基，其通过一端的官能巯基或二硫基以及另一端的活性酯在连接
基的相对两端与细胞毒剂和细胞结合剂反应。作为使用PEG连接基
团合成细胞毒性偶联物的一般实例，再次参考以引用方式整体并入本
文的美国专利6,716,821。合成始于具有反应性PEG部分的一种或多
种细胞毒剂与细胞结合剂反应，从而导致每个反应性PEG部分的末
端活性酯被细胞结合剂的氨基酸残基置换，得到包含通过PEG连接
基团共价键合到细胞结合剂的一种或多种细胞毒剂的细胞毒性偶联
物。作为另外一种选择，可将细胞结合剂用双官能PEG交联剂修饰，
以引入反应性二硫基部分(诸如吡啶二巯基)，然后可将其用含硫醇
的美登木素处理以提供偶联物。在另一种方法中，可将细胞结合剂用
双官能PEG交联剂修饰以引入硫醇部分，然后可将其用含反应性二
硫基的美登木素(诸如吡啶二巯基)处理，以提供偶联物。
还可以制备具有不可裂解连接基的抗体-美登木素偶联物。此类
交联剂在本领域中有所描述(参见美国专利公布号20050169933)并
包括但不限于N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯
(SMCC)。在一些实施方案中，将抗体用如文献中所述的诸如琥珀酰
亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基
-SMCC、马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、磺基
-MBS或琥珀酰亚胺基碘醋酸酯的交联试剂修饰，以引入1-10个反应
性基团(Yoshitake等,Eur.J.Biochem.,101:395-399(1979)；Hashida
等,J.AppliedBiochem.,56-63(1984)；和Liu等,Biochem.,18:690-697
(1979))。然后使修饰的抗体与含硫醇的美登木素衍生物反应，以产生
偶联物。偶联物可通过SephadexG25柱凝胶过滤法或通过渗析法或
切向流过滤法而纯化。将修饰的抗体用含硫醇的美登木素处理(1至
2摩尔当量/马来酰亚胺基)，再将抗体-美登木素偶联物通过Sephadex
G-25柱凝胶过滤法、陶瓷羟磷灰石柱层析法、渗析法或切向流过滤
法或这些方法的组合进行纯化。通常，每个抗体平均连接1-10个美
登木素。一种方法是将抗体用琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)-
环己烷-1-羧酸酯(SMCC)修饰以引入马来酰亚胺基，然后将修饰的抗
体与含硫醇的美登木素反应以得到硫醚连接的偶联物。同样，得到每
个抗体分子含1至10个药物分子的偶联物。以相同的方式制备抗体、
抗体片段和其它蛋白质的美登木素偶联物。
在本发明的另一方面，将EGFR抗体通过居间的PEG间隔物经
由不可裂解的键合连接到药物。包含在药物与抗EGFR抗体或片段之
间形成连接基的亲水性PEG链的合适交联试剂在本领域中也是熟知
的，或者可商购获得(例如得自QuantaBiodesign,Powell,Ohio)。合
适的含PEG的交联剂也可通过市售的PEG本身用本领域技术人员已
知的标准化学合成技术合成。可通过在美国专利公布20090274713和
WO2009/0134976中详述的方法使药物与双官能的含PEG的交联剂
反应以得到下式的化合物：Z–Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D，然后可与
细胞结合剂反应以提供偶联物。作为另外一种选择，可将细胞结合剂
用双官能的PEG交联剂修饰，以引入硫醇反应性基团(诸如马来酰
亚胺或卤代乙酰胺)，然后可将其用含硫醇的美登木素处理以提供偶
联物。在另一种方法中，可将细胞结合剂用双官能的PEG交联剂修
饰以引入硫醇部分，然后可将其用硫醇反应性美登木素(诸如具有马
来酰亚胺或卤代乙酰胺的美登木素)处理，以提供偶联物。
因此，本发明的另一方面为式(II)或式(II')的抗EGFR抗体药物偶
联物：
CB–[Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D]m(II)
[D-Yp–(–CH2–CH2–O–)n–Xl]m-CB(II')
其中，CB代表抗EGFR抗体或片段；
D代表药物；
X代表通过硫醚键、酰胺键、氨基甲酸键或醚键键合到细胞结合
剂的脂族、芳族或杂环单元；
Y代表通过选自以下的共价键键合到药物的脂族、芳族或杂环单
元：硫醚键、酰胺键、氨基甲酸键、醚键、胺键、碳碳键和腙键；
l是0或1；
p是0或1；
m是2至15的整数；以及
n是1至2000的整数。
在一些实施方案中，m是2至8的整数；以及
在一些实施方案中，n是1至24的整数。
在一些实施方案中，m是2至6的整数。
在一些实施方案中，m是3至5的整数。
在一些实施方案中，n是2至8的整数。合适的含PEG的连接基
的实例包括具有以下部分的连接基：与抗EGFR抗体或其片段反应的
N-琥珀酰亚胺基酯或N-磺基琥珀酰亚胺基酯部分，以及与化合物反
应的基于马来酰亚胺基或卤代乙酰基的部分。PEG间隔物可通过本文
所述的方法结合到本领域已知的任何交联剂中。
本文所公开的许多交联剂在美国专利公布号20050169933和
20090274713中以及在WO2009/0134976中详细描述；它们的内容整
体以引用方式并入本文。
本发明包括其中将约2至约8个药物分子(“载药量”)例如美登
木素连接到抗EGFR抗体或其片段的方面，该偶联物的抗肿瘤作用与
连接到相同细胞结合剂的更低或更高数量的载药量相比有效得多。如
本文所用的“载药量”是指可附接到细胞结合剂(例如，抗EGFR抗体
或其片段)的药物分子(例如美登木素)的数量。在一个方面，可附
接到细胞结合剂的药物分子的数量可在约2至约8的范围内(例如
1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、
3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、
4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、
5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、
7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1)。可以使用
N2’-去乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)和N2’-去乙酰基
-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。
抗EGFR抗体或其片段可通过使双官能交联剂与抗EGFR抗体或
其片段反应而修饰，从而导致交联剂分子共价连接到抗EGFR抗体或
其片段。如本文所用，“双官能交联剂”是将细胞结合剂共价连接到药
物(诸如本文所述的药物)的任何化学部分。在另一种方法中，通过
药物提供连接部分的一部分。在该方面，药物包含连接部分，其为用
于将细胞结合剂连接到药物的更大连接基分子的一部分。例如，为了
形成美登木素DM1，对美登素的C-3羟基处的侧链进行修饰，以具
有游离的巯基基团(SH)。该美登素(maytansine)的巯基化形式可与修
饰的细胞结合剂反应，以形成偶联物。因此，最终的连接基由两种组
分组装，其中一种由交联剂提供，而另一种由DM1的侧链提供。
药物分子还可通过中间载体分子诸如血清白蛋白连接到抗体分
子。
如本文所用，“连接到细胞结合剂”或“连接到抗EGFR抗体或片
段”的表述是指偶联分子，其包含通过合适的连接基团或其前体结合
到细胞结合剂抗EGFR抗体或片段的至少一种药物衍生物。一个连接
基团为SMCC。
在某些实施方案中，可用于本发明的细胞毒剂为美登木素类和美
登木素类似物。合适的美登木素类的实例包括美登木醇(maytansinol)
和美登木醇类似物。包括与美登木醇和美登木醇类似物一样的抑制微
管形成并对哺乳动物具有高度毒性的任何药物。
合适的美登木醇酯的实例包括具有修饰芳环的那些以及在其它
位置具有修饰的那些。此类合适的美登木素类在美国专利号
4,424,219、4,256,746、4,294,757、4,307,016、4,313,946、4,315,929、
4,331,598、4,361,650、4,362,663、4,364,866、4,450,254、4,322,348、
4,371,533、5,208,020、5,416,064、5,475,092、5,585,499、5,846,545、
6,333,410、7,276,497和7,473,796中有所公开。
在某个实施方案中，本发明的免疫偶联物利用正式名称为N2’-去
乙酰基-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素的含硫醇的美登木素(DM1)作
为细胞毒剂。DM1由以下结构式(III)表示：
在另一个实施方案中，本发明的偶联物利用含硫醇的美登木素
N2’-去乙酰基-N2’(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(例如DM4)作
为细胞毒剂。DM4由以下结构式(IV)表示：
另一种包含具有空间位阻硫醇键的侧链的美登木素为N2’-去乙酰
基-N-2’(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(称为DM3)，其由以下结构式(V)
表示：
在美国专利号5,208,020和7,276,497中教导的美登木素类的每一
种也可用于本发明的偶联物。就这一点而言，5,208,020和7,276,697
的整个公开内容以引用方式并入本文。
美登木素类上的许多位置可作为对连接部分进行化学连接的位
置。例如，具有羟基的C-3位、用羟甲基修饰的C-14位、用羟基修
饰的C-15位以及具有羟基的C-20位均预期可以使用。在一些实施方
案中，C-3位作为对连接部分进行化学连接的位置，并且在一些特定
实施方案中，美登木醇的C-3位用作对连接部分进行化学连接的位
置。
一些偶联物的结构示意图显示如下：
用于产生此类抗体-美登木素偶联物的多篇描述在美国专利号
6,333,410、6,441,163、6,716,821和7,368,565中提供，它们均全文并
入本文中。
一般来讲，可将水性缓冲液中的抗体溶液用摩尔过量的具有带反
应性基团的二硫基部分的美登木素类孵育。可将反应混合物通过添加
过量的胺(诸如乙醇胺、牛磺酸等)而猝灭。然后可通过凝胶过滤法
纯化美登木素-抗体偶联物。
每个抗体分子结合的美登木素分子的数量可通过在252nm和
280nm处分光光度测量吸光度比而确定。美登木素分子/抗体的平均
数可例如为1-10或2-5。
蒽环类化合物及其衍生物、中间体和修饰版本也可用于制备抗
EGFR免疫偶联物。例如，可将多柔比星、多柔比星衍生物、多柔比
星中间体和修饰的多柔比星用于抗EGFR偶联物。示例性化合物在
WO2010/009124中有所描述，该专利以引用方式全文并入本文。此
类化合物包括例如下式的化合物或其药学上可接受的盐：
其中R1为氢原子、羟基或甲氧基，并且R2为C1-C3烷氧基。
可在体外对抗体与美登木素或其它药物的偶联物抑制多种不想
要的细胞系的能力进行评估。例如，可将诸如NCI-H226、NCI-H292
和NCI-H322M的细胞系容易地用于评估这些化合物的细胞毒性。可
将待评估的细胞暴露于化合物4至5天，然后通过已知的方法在直接
测定法中测量细胞的存活分率。然后可通过测定法的结果计算IC50
值。
免疫偶联物可根据本文所述的一些实施方案内化到细胞中。因
此，免疫偶联物可在通过EGFR表达细胞摄取或内化时发挥治疗作
用。在一些特定实施方案中，免疫偶联物包含通过可裂解的连接基连
接到细胞毒剂的抗体、抗体片段或多肽，并且将细胞毒剂从抗体、抗
体片段或多肽裂解，其中其由EGFR表达细胞内化。
在一些实施方案中，免疫偶联物能够减小肿瘤体积。例如，在一
些实施方案中，用免疫偶联物治疗导致小于约50％、小于约45％、
小于约40％、小于约35％、小于约30％、小于约25％、小于约20％、
小于约15％、小于约10％或小于约5％的％T/C值。
在本发明的另一方面，可将siRNA分子而非药物连接到本发明
的抗体。可通过常用于修饰寡核苷酸的方法将siRNA连接到本发明
的抗体(参见例如美国专利公布20050107325和20070213292)。因
此，可使以其3’或5’-亚磷酰胺形式的siRNA与具有羟基官能团的交
联剂的一个末端反应，以在siRNA与交联剂之间形成酯键。相似地，
siRNA亚磷酰胺与具有末端氨基的交联剂反应导致交联剂通过胺连
接到siRNA。作为另外一种选择，可将siRNA通过标准化学方法衍
生化，以引入硫醇基团。可使该含硫醇的siRNA与经过修饰以引入
活性二硫基或马来酰亚胺部分的抗体反应，以产生可裂解的或不可裂
解的偶联物。可通过该方法将1-20个siRNA分子连接到抗体。
III.多核苷酸
在某些实施方案中，本发明涵盖多核苷酸，所述多核苷酸包括编
码特异性结合EGFR的多肽或此多肽片段的多核苷酸。例如，本发明
提供一种多核苷酸，其包含编码人EGFR抗体或编码此抗体片段的核
酸序列。本发明的多核苷酸可以是RNA的形式或DNA的形式。DNA
包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA；以及可以为双链或单链的，
并且如果为单链的则可以为编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方案中，多核苷酸为分离的。在某些实施方案中，多
核苷酸为基本上纯的。
本发明提供一种多核苷酸，其包括编码含有选自SEQIDNO:1-28
的序列的多肽的多核苷酸。
本发明进一步提供包含选自下表7-9中所示的那些序列的多核苷
酸。
表7：可变重链多核苷酸序列
表8：可变轻链多核苷酸序列
表9：全长重链和轻链多核苷酸序列
本发明还提供具有与SEQIDNO:29-40至少约95％、至少约
96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列同一性的多核苷酸。
因此，在某些实施方案中，该多肽包括：(a)具有与SEQIDNO:29-32、
37或39至少约95％序列同一性的多肽，和/或(b)具有与SEQID
NO:33-36、38或40至少约95％序列同一性的多肽。在某些实施方案
中，该多肽包括(a)具有SEQIDNO:29-32、37或39的氨基酸序列的
多肽；和/或(b)具有SEQIDNO:33-36、38或40的氨基酸序列的多肽。
在某些实施方案中，该多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编
码序列在同一阅读框中融合到例如有助于从宿主细胞中表达和分泌
多肽的多核苷酸(例如，用作控制多肽从细胞转运的分泌序列的前导
序列)。具有前导序列的多肽为前蛋白，并可具有由宿主细胞裂解以
形成成熟形式的多肽的前导序列。多核苷酸还可编码为成熟蛋白质外
加5'氨基酸残基的前蛋白。具有前序列的成熟蛋白质为前蛋白并为蛋
白质的无活性形式。将前序列裂解后，留下活性成熟蛋白质。
在某些实施方案中，该多核苷酸包含成熟多肽的编码序列，该编
码序列在同一阅读框中融合到允许例如纯化编码多肽的标记序列。例
如，就细菌宿主而言，标记序列可以是由pQE-9载体提供的六聚组
氨酸标签，以提供融合到标记的成熟多肽的纯化；或者当使用哺乳动
物宿主(例如COS-7细胞)时，标记序列可以是衍生自流感病毒血
凝素蛋白的血凝素(HA)标签。
本发明进一步涉及上文所述的编码例如片段、类似物和衍生物的
多核苷酸的变体。
多核苷酸变体可在编码区、非编码区或两者中包含改变。在一些
实施方案中，多核苷酸变体包含产生沉默置换、添加或缺失但不改变
编码多肽的性质或活性的改变。在一些实施方案中，核苷酸变体因遗
传密码的简并性通过沉默置换而产生。可出于多种原因产生多核苷酸
变体，例如以优化特定宿主的密码子表达(将人mRNA中的密码子
变成细菌宿主诸如大肠杆菌偏好的那些密码子)。
本发明还提供包含本文所述的多核苷酸的载体和细胞。
IV.使用方法和药物组合物
本发明的EGFR结合剂(包括抗体、免疫偶联物和多肽)可用于
多种应用，包括但不限于治疗方法，诸如治疗癌症。在某些实施方案
中，所述药剂可用于抑制肿瘤生长、诱导分化、减小肿瘤体积和/或
降低肿瘤的致肿瘤性。使用方法可以是体外、间接体内或体内方法。
在某些实施方案中，EGFR结合剂或抗体或免疫偶联物或多肽不拮抗
其所结合到的人EGFR。
在一个方面，本发明的抗EGFR抗体和免疫偶联物可用于检测生
物样品中EGFR的存在。如本文所用的术语“检测”涵盖定量或定性检
测。在某些实施方案中，生物样品包括细胞或组织。
在一个方面，本发明提供检测生物样品中EGFR的存在性的方
法。在某些实施方案中，该方法包括将生物样品与抗EGFR抗体在允
许抗EGFR抗体结合到EGFR的条件下接触，并检测在抗EGFR抗
体与EGFR之间是否形成了复合物。
在一个方面，本发明提供诊断与EGFR的表达增加相关的障碍的
方法。在某些实施方案中，该方法包括：将供试细胞与抗EGFR抗体
接触；通过检测抗EGFR抗体与EGFR的结合测定供试细胞的EGFR
表达水平(定量或定性地)；以及将供试细胞的EGFR表达水平与对
照细胞(例如，与供试细胞来源于相同组织的正常细胞，或与此正常
细胞的EGFR表达水平相当的细胞)的EGFR表达水平进行比较，其
中与对照细胞相比供试细胞表达更高水平的EGFR则表示存在与
EGFR的表达增加相关的障碍。在某些实施方案中，该供试细胞得自
疑似患有与EGFR表达增加相关的障碍的个体。在某些实施方案中，
该障碍为细胞增殖性障碍，诸如癌症或肿瘤。
在某些实施方案中，如上所述的那些诊断或检测方法包括检测抗
EGFR抗体与在细胞表面上表达的EGFR的结合或与由在其表面上表
达EGFR的细胞获得的细胞膜制备物中的EGFR的结合。在某些实施
方案中，该方法包括将细胞与抗EGFR抗体在允许抗EGFR抗体结合
到EGFR的条件下接触，并检测在抗EGFR抗体与细胞表面上的
EGFR之间是否形成了复合物。用于检测抗EGFR抗体与在细胞表面
上表达的EGFR的结合的示例性测定法为"FACS"测定。
某些其它方法可用于检测抗EGFR抗体与EGFR的结合。此类方
法包括但不限于在本领域熟知的抗原结合测定法，诸如Western印迹、
放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、
免疫沉淀测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定和免疫组织化学
(IHC)。
在某些实施方案中，对抗EGFR抗体进行标记。标记包括但不限
于直接检测的标记或部分(诸如荧光、发色、电子致密、化学发光和
放射性标记)以及例如通过酶促反应或分子相互作用而间接检测的部
分(诸如酶或配体)。
在某些实施方案中，将抗EGFR抗体固定到不溶性基质上。固定
作用使得抗EGFR抗体与在溶液中保持游离的任何EGFR分离。这通
常通过以下方式实现：在测定程序前使抗EGFR抗体不溶，如通过吸
附到水不溶性基质或表面(Bennich等，美国专利号3,720,760)或通
过共价偶联(例如，使用戊二醛交联)；或者在抗EGFR抗体与EGFR
之间形成复合物后使抗EGFR抗体不溶，例如通过免疫沉淀法。
可使用本发明的免疫偶联物对任何上述实施方案进行诊断或检
测，以替代或补充抗EGFR抗体。
在某些实施方案中，用EGFR结合剂或拮抗剂(例如抗EGFR抗
体)治疗的疾病为癌症。在某些实施方案中，该癌症的特征在于EGFR
结合剂(如抗体)结合到的EGFR表达细胞。
在进一步的方面，本发明涉及用于治疗细胞增殖性病症的改进方
法，其中EGFR被表达，尤其是其中EGFR被异常表达(例如过表达)，
包括膀胱、脑、头颈、胰腺、肺、乳腺、卵巢、结肠、前列腺、皮肤
和肾癌，所述方法包括将治疗有效量的本发明的抗EGFR结合剂施用
给对其有需要的人类受试者。在另一个实施方案中，抗体为人源化的。
在另一个优选的实施方案中，人源化抗体包含修饰的CDR，其除了
保持结合活性所必需的那些位置外(例如SDR)可以在任何位置包
含置换。可通过本发明的抗EGFR结合剂治疗的细胞增殖性病症的实
例包括但不限于位于以下部分中的赘生物：腹腔、骨骼、乳腺、消化
系统、肝脏、胰腺、腹膜、内分泌腺(肾上腺、甲状旁腺、垂体、睾
丸、卵巢、胸腺、甲状腺)、眼睛、头颈、神经系统(中枢和外周)、
淋巴系统、骨盆、皮肤、软组织、脾脏、胸部和泌尿生殖系统。
相似地，其它细胞增殖性病症也可通过本发明的抗EGFR结合剂
治疗。此类细胞增殖性病症的实例除了赘生物外还包括但不限于：位
于上列器官系统中的肾上腺皮质增生(库欣病)、先天性肾上腺皮质
增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生、乳腺增生、内膜增生、局灶
性上皮增生(Heck病)、皮脂腺增生、代偿性肝增生以及任何其它细
胞增殖性疾病。
本发明进一步提供使用本文所述的抗体或其它药剂抑制肿瘤生
长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括将细胞与
EGFR结合剂(例如抗体)在体外接触。例如，将表达EGFR的永生
化细胞系或癌细胞系在向其中加入了抗体或其它药剂以抑制肿瘤生
长的培养基中培养。在一些实施方案中，从患者样本诸如组织活检样
本、胸膜积液或血样中分离肿瘤细胞，然后在向其中加入了EGFR结
合剂以抑制肿瘤生长的培养基中培养。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括将肿瘤或肿瘤细胞
与EGFR结合剂(例如抗体)在体内接触。在某些实施方案中，将肿
瘤或肿瘤细胞与EGFR结合剂接触在动物模型中进行。例如，可将
EGFR结合剂施用给已在免疫缺陷小鼠(如NOD/SCID小鼠)中生长
的表达一种或多种EGFR的异种移植物以抑制肿瘤生长。在一些实施
方案中，从患者样本诸如组织活检样本、胸膜积液或血样中分离癌干
细胞，再注射到免疫缺陷小鼠中，然后向其施用EGFR结合剂以抑制
肿瘤细胞生长。在一些实施方案中，在将致瘤细胞引入动物中的同时
或短时间后施用EGFR结合剂，以防止肿瘤生长。在一些实施方案中，
在致瘤细胞已长到指定的大小后，作为治疗剂施用EGFR结合剂。
在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括向受试者施用治疗
有效量的EGFR结合剂。在某些实施方案中，受试者为人。在某些实
施方案中，受试者具有肿瘤或已摘除了肿瘤。
在某些实施方案中，肿瘤表达EGFR结合剂或抗体将结合到的
EGFR。
此外，本发明提供一种降低受试者中肿瘤的致肿瘤性的方法，其
包括向受试者施用治疗有效量的EGFR结合剂。在某些实施方案中，
肿瘤包含癌干细胞。在某些实施方案中，肿瘤中癌干细胞的频率通过
施用所述药剂而降低。
本发明进一步提供将致瘤细胞分化成非致瘤细胞的方法，其包括
将致瘤细胞与EGFR结合剂接触(例如，通过将EGFR结合剂施用给
具有含致瘤细胞的肿瘤或已摘除了这种肿瘤的受试者。
本发明还提供了本文所述的EGFR结合剂、多肽或抗体诱导细胞
(包括但不限于肿瘤细胞)分化的用途。例如，设想了包括将细胞与
有效量的本文所述的EGFR结合剂(例如抗EGFR抗体)接触的诱导
细胞分化的方法。本发明还提供了包括将治疗有效量的EGFR结合
剂、多肽或抗体施用给受试者而诱导受试者中肿瘤细胞分化的方法。
在某些实施方案中，肿瘤为胰腺肿瘤。在某些其它实施方案中，肿瘤
为结肠肿瘤。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用治疗有
效量的EGFR结合剂、多肽或抗体。
本发明还提供包含本文所述的EGFR结合剂的一种或多种的药
物组合物。在某些实施方案中，该药物组合物进一步包含药学上可接
受的媒介物。这些药物组合可用于抑制肿瘤生长并治疗人类患者的癌
症。
在某些实施方案中，通过将本发明的纯化抗体或药剂与药学上可
接上的媒介物(例如载体、赋形剂)组合而制备制剂以便储存和使用
(Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy20thEditionMack
Publishing,2000)。合适的药学上可接受的媒介物包括但不限于：无毒
缓冲剂，诸如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；盐，诸如氯化钠；抗氧化
剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯
化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚；丁醇或苄醇；对羟
基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶
酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇和间甲酚)；低分子量多肽(例如少
于约10个氨基酸残基)；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋
白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷
氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，诸如单
糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸
如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；金属络
合物(例如Zn-蛋白质络合物)；以及非离子表面活性剂，诸如TWEEN
或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物可以任何多种方式施用以用于局部或全身
治疗。施用可以经局部(诸如施用到粘膜，包括阴道和直肠递送)，
诸如透皮贴片、油膏剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、
液体和粉末剂；肺部(例如，通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括通
过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和透皮)；口腔；或肠胃外，包括静
脉、动脉、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；或颅内(如鞘内或心室
内)施用。
本发明的抗体或免疫偶联物可在药物复合制剂或给药方案中与
具有抗癌性质的第二化合物组合作为联合疗法。药物复合制剂或给药
方案的第二化合物可具有与复合制剂的ADC的互补活性，使得它们
不对彼此造成不利影响。本发明还提供包含EGFR结合剂和第二种抗
癌剂的药物组合物。
对于疾病的治疗，本发明的抗体或药剂的合适剂量取决于待治疗
的疾病类型、疾病的严重性和病程、疾病的反应性、抗体或药剂是用
于治疗还是预防目的、之前的疗法、患者的临床史等等，它们均由治
疗医生决定。抗体或药剂可一次性施用或持续数天至数月经一系列治
疗而施用，或直到实现治愈或实现疾病状态的缓解(例如，肿瘤体积
减小)。最佳给药方案可以通过患者体内药物蓄积的测量值而计算，
并将根据各抗体或药剂的相对效能而变化。施用医生可容易地确定最
佳剂量、给药方法和重复率。在某些实施方案中，剂量为0.01μg至
100mg/kg体重，并可每天、每周、每月或每年给予一次或多次。在
某些实施方案中，抗体或其它EGFR结合剂每两周给予一次或每三周
给予一次。在某些实施方案中，抗体或其它EGFR结合剂的剂量为约
0.1mg至约20mg/kg体重。治疗医生可以基于药物在体液或组织中
测得的停留时间和浓度而估计重复率。
联合治疗可提供“协同效应”以及显示出“协同性”，即当一起使用
的活性成分大于单独使用化合物导致的效应总和时而实现的效应。当
按以下方式使用活性成分时可以获得协同效应：(1)在复合单位剂量
制剂中共配制并同时施用或递送；(2)通过作为单独的制剂交替地或
平行地递送；或(3)通过某些其它方案。当在交替疗法中递送时，当
将化合物按顺序施用或递送例如通过单独注射器的不同注射而施用
时，可获得协同效应。一般来讲，在交替疗法期间，将各活性成分的
有效剂量按顺序施用，即连续地施用，而在联合疗法中，将两种或更
多种活性成分的有效剂量一起施用。
VI.包含EGFR结合剂的试剂盒
本发明提供包含本文所述的抗体、免疫偶联物或其它药剂并可用
于执行本文所述的方法的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒在一个
或多个容器中包含至少一种纯化的抗EGFR抗体。在一些实施方案
中，该试剂盒包含执行检测测定所必需的和/或足够的所有组成部分，
包括执行测定的所有对照、说明书以及分析和展示结果所必需的任何
软件。本领域的技术人员将容易地认识到，本发明所公开的抗体、免
疫偶联物或其它药剂可容易地结合到在本领域熟知的给定试剂盒形
式的一种中。
本发明进一步提供包含EGFR结合剂(例如EGFR结合抗体)以
及第二种抗癌剂的试剂盒。在某些实施方案中，第二种抗癌剂为化疗
剂(例如利妥昔单抗)。
实施例
应当理解，本文所述的实施例和实施方案仅是用于示例性目的，
并且本领域的技术人员将想到对其各种修改或更改，而这些修改或更
改也将落在本申请的精神和范围内。
实施例1
大鼠ML66EGFR抗体的生成和选择
为了产生大鼠EGFR抗体，将SD雌性大鼠(CharlesRiver
Laboratory,Wilmington,MA)经皮下注射溶于Titermax辅剂(Sigma
Aldrich,St.Luis,MO)中的MDA-MB468乳腺癌细胞系(ATCC)膜制备
物。在第一次免疫后三周，用溶于PBS的相同抗原重复一次免疫。
细胞融合前三天，经腹膜内注射另一剂抗原。根据标准动物方案采集
大鼠脾脏，在两张无菌、磨砂显微载玻片之间磨碎，得到单细胞悬液。
用ACK裂解缓冲液进行红细胞裂解后，接下来将脾细胞与鼠骨髓瘤
P3X63Ag8.653细胞(P3细胞)(J.F.Kearney等.1979,JImmunol,123:
1548-1550)以1个P3细胞:3个脾脏细胞的比率混合，再将细胞用聚
乙二醇1500(Roche)融合。为了选择杂交瘤，将融合的细胞重悬在含
有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)(SigmaAldrich)的RPMI-1640培养
基中，然后以200μl/孔接种到平底96孔板中。然后将板在5％CO2
培养箱和37℃下孵育，直到杂交瘤克隆可用于抗体筛选。
采用人EGFR表达大鼠YB2/0稳定细胞和野生型YB2/0细胞
(ATCC)通过全细胞ELISA进行杂交瘤培养上清液筛选。将只与EGFR
表达YB2/0细胞系反应但不与亲代细胞系反应的杂交瘤克隆通过有
限稀释进行亚克隆。对稳定的亚克隆进行培养，将抗体使用商业分型
试剂(Roche)进行分型。得到总共12个EGFR特异性大鼠单克隆抗体，
选择了ML66克隆，因为其在其它实施例中所述的独特特性。
鼠EGFR-8抗体的生成和选择
为了产生鼠抗EGFR抗体，以5×106个细胞每只小鼠的剂量每2
周一次持续5次，将头颈鳞状细胞癌细胞系诸如CA922(Japanese
CollectionofResearchBioresources(JCRB),Shinjuku,Japan)和HSC4
(JCRB,Shinjuku,Japan)皮下注射进Balb/c雌性小鼠(CharlesRiver
Laboratory,Wilmington,MA)。在为了产生杂交瘤而处死的前三天，免
疫小鼠接受腹膜内注射另一剂量的抗原。根据标准动物方案采集小鼠
脾脏，在两张无菌、磨砂显微载玻片之间磨碎，得到RPMI-1640培
养基中的单细胞悬液。在将红细胞用ACK裂解缓冲液裂解后，接下
来将脾细胞与鼠骨髓瘤P3细胞以1个P3细胞:3个脾细胞的比率混
合。对脾细胞和P3细胞的混合物进行洗涤，并在室温下在融合培养
基(0.3M甘露糖醇/D-山梨醇、0.1mMCaCl2、0.5mMMgCl2和1mg/ml
BSA)中用链霉蛋白酶处理3min。通过添加FBS(胎牛血清，
Invitrogen)终止反应；然后洗涤细胞，重悬在2ml冷的融合培养基
中，用BTXECM2001电融合机(HarvardApparatus)融合。将融合的
细胞轻轻加到含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)(SigmaAldrich)的
RPMI-1640选择培养基中，在37℃孵育20min，然后以200μl/孔的
密度接种到平底96孔板中。然后将板在5％CO2培养箱和37℃下孵
育，直到杂交瘤克隆可用于抗体筛选。也可以使用用于免疫和杂交瘤
产生的其它技术，包括在J.Langone和H.Vunakis(编辑,Methodsin
Enzymology,第121卷,"ImmunochemicalTechniques,PartI"；
AcademicPress,Florida)以及E.Harlow和D.Lane("Antibodies:A
LaboratoryManual"；1988；ColdSpringHarborLaboratoryPress,New
York,NY)中所述的那些技术。
使用流式细胞术结合测定通过未处理或经EGF(R&DSystems)
处理的免疫细胞进行了杂交瘤筛选。由于用EGF孵育下调了细胞表
面上的EGFR水平，因此EGFR特异性杂交瘤上清液将只与未处理的
细胞反应而不与经EGF处理的细胞反应。将用于筛选的靶细胞首先
在无血清培养基中过夜培养，然后分离成两个部分。将一部分细胞不
进行处理，将另一部分在37℃下用EGF处理3小时。将经EGF处理
的细胞用CellTraceTMfarredDDAO-SE(Invitrogen)标记，与未处理的
细胞按1:1的比率混合，然后在冰上用杂交瘤上清液孵育2小时。然
后洗涤细胞，用FITC标记的抗小鼠IgG(JacksonImmunoresearch)孵
育，洗涤，用福尔马林固定，再使用FACScalibur(BDBioscience)分
析。将EGFR特异性杂交瘤扩增，将上清液通过ELISA使用可溶性
重组人EGFR胞外域(RELIATech)作为抗原而重新筛选。使用流式细
胞术结合测定通过人EGFR表达A431表皮癌细胞系(ATCC)和猴
EGFR表达Vero细胞系(非洲绿猴肾上皮细胞系)(ATCC)进行重新
筛选。简而言之，将杂交瘤上清液用A431细胞和DDAO标记的Vero
细胞在冰上孵育1小时。将细胞洗涤两次，然后用PE偶联的山羊抗
小鼠IgG抗体(JacksonImmunoresearch)在冰上孵育1小时。然后将细
胞用FACS缓冲液洗涤，在福尔马林中固定，再使用FACSCalibur流
式细胞仪(BDBiosciences)分析。
对与人和鼠抗原均发生反应的阳性杂交瘤克隆抑制EGFR表达
HCC827细胞(ATCC)基底增殖的能力进行测试。简而言之，将指数生
长的HCC827细胞以2000个细胞/孔铺到96孔板的100μl含10％FBS
的完整培养基中。将100μl杂交瘤上清液加到细胞中，将混合物在
37℃下在潮湿的5％CO2培养箱中孵育5天。使用比色WST-8测定法
(DojindoMolecularTechnologies,Rockville,MD)测定了细胞增殖水
平。WST-8经活细胞中的脱氢酶还原成可溶于组织培养基的橙色甲臜
产物，所产生的甲臜的量与活细胞的数量成正比。将WST-8最终量
的10％加到各孔中，将板在37℃下再孵育2-4h。然后通过在Spectra
MaxM2酶标仪(MolecularDevices,Sunnyvale,CA)中在450nm处测
量吸光度(A450)对板进行分析。将仅含培养基和WST-8的孔的背景
A450吸光度从所有值中减去。通过将各个经处理的样品的值除以未
处理细胞的孔的平均值而计算存活分率(存活分率＝(A450处理的样
品–A450背景)/(A450未处理的样品–A450背景))。对结果归一化，
使得存活分率0表示无细胞的孔的值，而1则表示无任何EGFR抗体
的含血清培养基中的细胞增殖水平。选择了缺乏抑制HCC827细胞生
长能力的EGFR-8杂交瘤。将它们通过有限稀释进行亚克隆。选择一
个通过流式细胞术分析而表现出与亲代细胞相同的抗EGFR反应性
的亚克隆，用于后续分析。对稳定的亚克隆进行培养，将抗体使用商
业分型试剂(Roche)进行分型。
抗体纯化
使用标准方法诸如蛋白A或G层析(HiTrapProteinA或GHP,1
mL,AmershamBiosciences)将抗体从杂交瘤亚克隆上清液中纯化。
简而言之，通过加入1/10体积的1MTris/HCl缓冲液(pH8.0)制备层
析用上清液。将经过pH调节的上清液通过0.22μm滤膜过滤，然后
上样到用结合缓冲液(PBS,pH7.3)平衡的柱子上。将柱子用结合缓冲
液洗涤，直到获得在280nm处无吸光度的稳定基线。将抗体用含有
0.15MNaCl的0.1M乙酸缓冲液(pH2.8)用0.5mL/min的流速洗脱。
收集大约0.25mL的馏分，并通过添加1/10体积的1MTris/HCl(pH8.0)
中和。将峰馏分经1×PBS过夜渗析两次，再通过0.2μm滤膜过滤而
除菌。将纯化的抗体通过A280吸光度定量。
将蛋白A纯化的馏分使用离子交换层析(IEX)进一步提纯，其中
将季铵盐(Q)层析用于鼠抗体。简而言之，将蛋白A纯化的样品缓冲
交换到结合缓冲液(10mMTris，10mM氯化钠，pH8.0)中并经0.22
μm过滤器过滤。然后将制备好的样品上样到已用120cm/h流速的结
合缓冲液平衡的Q快速流树脂(GELifesciences)。对柱子大小进行选
择以具有足够的容量结合样品中的所有MAb。然后将柱子用结合缓
冲液洗涤，直到得到280nm处无吸光度的稳定基线。将抗体经20倍
柱体积(CV)的10mM至500mM氯化钠梯度洗脱。基于280nm处的
吸光度测量值(A280)收集峰馏分。使用AgilentHPLC1100系统
(Agilent,SantaClara,CA)在带有SWXL保护柱,6.0×40mm(Tosoh
Bioscience,Montgomeryville,PA)的TSK凝胶G3000SWXL,7.8×300
mm柱上通过尺寸排阻色谱(SEC)评估单体的百分比。合并单体含量
高于95％的馏分，使用TFF系统缓冲交换到PBS(pH7.4)中，然后通
过经0.2μm滤膜过滤而除菌。使用1.47的消光系数通过A280确定纯
化抗体的IgG浓度。将可供选择的方法诸如陶瓷羟基磷灰石(CHT)也
用于以高选择性提纯抗体。将具有40μm粒度的II型CHT树脂
(Bio-RadLaboratories)与针对IEX层析所述的相似方案一起使用。
CHT的结合缓冲液对应于20mM磷酸钠(pH7.0)，将抗体经20CV的
20-160mM磷酸钠梯度洗脱。
实施例2
对人和猴EGFR抗原的结合亲和力
为了确定EGFR抗体对人和猴抗原的结合亲和力，将EGFR表达
人肿瘤细胞系诸如MDA-MB468(ATCC)和A431细胞(ATCC)以及称
为Vero的非洲绿猴肾细胞系(ATCC)用于流式细胞术结合测定。简而
言之，将细胞用多种浓度的EGFR抗体在4℃下孵育1h。洗涤细胞，
用PE偶联的二抗(JacksonImmunoresearch)在4℃孵育1h。接下来再
次洗涤细胞，固定在福尔马林中，在FACSarray(BDBioscience)中分
析。为了确定这些抗体的结合亲和力，在半对数图中针对抗体浓度绘
制几何平均荧光强度。通过非线性回归生成剂量反应曲线，使用
GraphPadPrismv4(GraphPadsoftware)计算对应于各抗体的表观解离
常数(Kd)的曲线的EC50值。EGFR-8抗体、ML66抗体、西妥昔单抗
和帕尼单抗对人肿瘤细胞系和Vero细胞均表现出强特异性结合。图1
所示的表格列出了各抗体对人和猴EGFR的Kd。
实施例3
ML66抗体的VL和VH区的克隆和测序
使用RNeasy试剂盒(QIAgen)根据制造商的方案由ML66杂交瘤
的5×106个细胞制备了总细胞RNA。随后使用SuperScriptIIcDNA
合成试剂盒(Invitrogen)由总RNA合成了cDNA。
对衍生自杂交瘤细胞的cDNA进行的第一轮简并PCR反应的程
序基于Wang等((2000)JImmunolMethods.233:167-77)和Co等((1992)
JImmunol.148:1149-54)所述的方法。使用以下简并引物通过PCR扩
增VH序列：EcoMH1
CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQIDNO:41)、
EcoMH2CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG
(SEQIDNO:42)和BamIgG1
GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQID
NO:43)。使用以下简并引物通过PCR扩增VL序列：SacIMK
GGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQIDNO:44)和
HindKL
TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGT
GC(SEQIDNO:45)。(混合碱基定义如下：N＝G+A+T+C，S＝G+C，
Y＝C+T，M＝A+C，R＝A+G，W＝A+T)。将PCR反应混合物在1％低
熔点琼脂糖凝胶上运行，切下300至400bp条带，使用ZymoDNA
微柱纯化，并送往AgencourtBiosciences进行测序。将相应的5’和3’
PCR引物用作测序引物，以从两个方向生成可变区cDNA。从DNA
测序结果预测了VH和VL区的氨基酸序列。
由于用于克隆VL和VHcDNA序列的简并引物改变5’末端序列，
因此需要进行另外的测序努力，以确认完整的序列。将初步cDNA序
列用于在NCBIIgBlast网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)搜索
抗体序列所来源的大鼠种系序列。然后设计PCR引物，以退火到大
鼠抗体的种系相关前导序列，使得此新的PCR反应将得到不被PCR
引物改变的完整可变区cDNA序列。作为另外一种选择，如Co等,
((1992)JImmunol.148:1149-54)中所述的RACE程序也用于获得5’末
端序列。如上所述进行PCR反应、条带纯化和测序。
用于序列确认的质量测定
将可变区的cDNA序列信息与种系恒定区序列组合，以得到全长
抗体cDNA序列。然后计算重链和轻链的分子量，并与通过大鼠ML66
抗体的LC/MS分析得到的分子量进行比较。分子量测量值与ML66
轻链和重链的cDNA序列一致。
ML66抗体的人源化
按照前人所述的表面重塑方法，诸如在Roguska等,Proc.Natl.
Acad.Sci.,USA,91(3):969-973(1994)和Roguska等,ProteinEng.
9(10):895-904(1996)中所述的方法，将ML66抗体人源化，这些参考
文献全文以引用方式并入本文。表面重塑通常涉及识别轻链和重链中
的可变区骨架表面残基并通过人等同残基将它们替换。啮齿动物
CDR保留在表面重塑的抗体中。ML66的示例性CDR如表10中所指
出的而定义。除了用于表面重塑的AbM重链CDR2定义外，表中还
提供了ML66的大鼠和人两种版本的示例性Kabat定义的重链CDR2。
带下划线的序列标记了不是考虑用于表面重塑的CDR的Kabat重链
CDR2的部分。
表10
大鼠HCCDR2：VIWNHGGTDYNSVIKS
人源化HCCDR2：VIWNHGGTDYNPSIKS
表面残基位置定义为具有30％或更高的相对可及性的任何位置
(PedersenJ.T.等,J.Mol.Biol.1994；235:959-973)。然后将计算的表
面残基与人种系表面序列进行比对，以鉴定同源性最高的人表面序
列。用作轻链可变结构域的替换表面的人种系序列为IGKV7-3*01，
用作重链可变结构域的替换表面的人种系序列为IGHV4-39*02。具体
的骨架表面残基变化在图1中给出。轻链中总共有六个表面残基以及
重链中总共有九个表面残基被替换为人对应物。图2示出ML66轻链
和重链可变结构域的表面重塑序列与其大鼠对应物的比对。
人源化ML66(huML66)抗体的重组表达
由BlueHeronBiotechnology对huML66的可变区序列进行密码
子优化和合成。序列的侧翼为限制性酶切位点，用于通过单链哺乳动
物表达质粒中的相应恒定系列进行框内克隆。将轻链可变区克隆进
pAbKZeo质粒中的EcoRI和BsiWI位点。将重链可变区克隆进
pAbG1Neo质粒的HindIII和Apa1位点。将这些质粒可用于在瞬时或
稳定哺乳动物细胞转染中表达重组抗体。使用改进的PEI程序
(Durocher,Y.等.,NucleicAcidsRes.30:E9(2002))，进行了在HEK293T
细胞中表达重组抗体的瞬时转染。使用如上所述的标准程序通过蛋白
A和精制层析步骤纯化上清液。
实施例4
人源化抗体的结合亲和力
在使用MDA-MB468细胞的流式细胞术测定法中，将huML66
抗体的结合亲和力与鼠对应物进行了比较。如实施例2中所述进行了
结合测定，各抗体通过非线性回归生成的剂量-反应曲线在图4中示
出。使用GraphPadPrismv4(GraphPadsoftware,SanDiego,CA)计算
出的Kd证实人源化不影响ML66抗体的结合亲和力。将抗KTI
(Kunitz胰蛋白酶抑制剂)抗体(由得自ATCC的杂交瘤产生)用作
阴性对照。
实施例5
EGFR配体诱导型EGFR激活的抑制
EGFR配体结合诱导EGFR磷酸化，然后激活下游信号传导途径。
为了调查抗EGFR抗体在配体诱导型EGFR激活中的作用，使用
MDA-MB468肿瘤细胞系和成人原代角质形成细胞执行了Western印
迹分析。简而言之，将细胞以1×106个胞/孔的密度接种到6孔板中，
在正常培养基中培养。洗涤细胞，在37℃下在含有0.1％BSA的不含
血清/EGF的培养基中饥饿处理2小时。将10μg/ml的抗体加到细胞
中，将混合物在37℃下孵育3小时。将50ng/ml的EGF(R&DSystems)
加到混合物中，在37℃下孵育15分钟。然后将细胞用冰冷的PBS洗
涤，在含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。将蛋白裂
解物在SDS-PAGE中分离，然后转移到硝酸纤维素膜。将膜用5％BSA
封闭，用抗磷酸酪氨酸抗体(克隆4G10,Millipore)在4℃下过夜孵育。
对膜进行洗涤，用HRP偶联的抗小鼠抗体(JacksonImmunoresearch)
在室温下孵育1小时，然后再次洗涤。将信号用ECL(增强化学发光)
系统(GEHealthcare)检测。为了确保将等量的蛋白质加到各泳道中，
将膜洗脱并用抗β-微管蛋白抗体(SigmaAldrich)重新检测。
如图5所示，EGF刺激在MDA-MB468细胞和人原代角质形成
细胞中均导致了强EGFR磷酸化。用西妥昔单抗和帕尼单抗处理细胞
强烈抑制了EGF诱导的EGFR磷酸化，而huML66和muEGFR-8抗
体对EGFR激活无影响。将抗KTI抗体用作阴性对照。
实施例6
EGFR抗体的激动活性
为了调查本发明的EGFR抗体在不存在EGFR配体的情况下对
EGFR信号传导的作用，将MDA-MB468肿瘤细胞如实施例5中所述
在无血清培养基中进行饥饿处理。然后将细胞在37℃下用10μg/ml
的EGFR抗体处理3小时。作为阳性对照，将未处理的细胞用50ng/ml
的EGF在37℃下孵育15分钟。制备蛋白质裂解物，并如实施例5
中所述用Western印迹进行分析。代表性结果在图6中示出。EGF处
理明显地诱导了MDA-MB468细胞中的强EGFR磷酸化。相似地，
muEGFR-8抗体也诱导了EGFR磷酸化，尽管EGFR磷酸化的水平低
于EGF的磷酸化水平。相比之下，帕尼单抗、西妥昔单抗和huML66
抗体在不存在配体的情况下未影响EGFR信号传导。实施例5和6
中所述的结果表明：EGFR-8抗体是激动性的，而ML-66抗体不影响
EGFR信号传导。
实施例7
配体结合竞争
EGFR信号传导抑制的一种机理是配体结合的阻断。为了检验
EGFR抗体是否抑制配体结合到EGFR，在存在抗EGFR抗体的情况
下通过流式细胞术测量了生物素化EGFR配体与MDA-MB468细胞
的结合。使用EZ-linkMicroSulfo-NHS-LC生物素化试剂盒(Pierce,
Rockland,IL)根据制造商的说明进行TGFα(R&Dsystem)的生物素
化。生物素化的EGF购自Invitrogen。在竞争测定前，建立生物素化
配体的结合曲线。将不同浓度的抗EGFR抗体与生物素化配体在
EC50浓度(对于EGF和TGFα分别为1.8nM和10nM)下预混，将
混合物与细胞在冰上孵育30分钟。然后，将细胞用FACS缓冲液洗
涤两次，再用链霉亲和素-APC偶联物(JacksonImmunoresearch)在冰
上孵育15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤两次，在FACSCalibur
(BDBioscience)中使用FlowJo程序(TreeStar)进行分析。在半对数图
中针对抗体浓度绘制几何平均荧光强度。如图7中所示，西妥昔单抗
和帕尼单抗均强烈抑制了配体结合，而阴性对照抗体(抗KTI抗体)
无任何影响。有趣的是，huML66抗体似乎促进TGFα结合(图7A)，
但其对EGF结合的影响甚微(图7B)，而muEGFR-8抗体则似乎对
TGFα和EGF结合均有促进作用。
实施例8
人原代角质形成细胞和正常上皮细胞系的生长抑制测定
皮肤、胃肠道和其它器官中的人正常基底上皮细胞在生理上表达
EGFR。这些组织中的EGFR信号传导对于上皮细胞生长至关重要。
西妥昔单抗和帕尼单抗以及小酪氨酸激酶抑制剂诸如埃罗替尼和吉
非替尼对EGFR功能的破坏导致显著的皮肤毒性。为了模拟皮肤和其
它上皮细胞中的潜在毒性，制定了使用人原代角质形成细胞
(Invitrogen)和非致瘤乳腺上皮细胞系MCF10A(ATCC)的增殖测定。
在该测定中，按制造商的建议将细胞以1,500-2,000个细胞/孔的密度
铺到含有EGFR配体的培养基中，并用抗EGFR抗体在37℃下孵育5
天。在角质形成细胞测定中(图8)，使细胞在0.2ng/ml的EGF和不
同浓度的抗体中生长。而在MCF10A细胞测定中(图9)，则将细胞
用不同浓度的EGFR配体和固定浓度(10μg/ml)的抗体孵育。使用比色
WST-8测定法(DojindoMolecularTechnologies,Rockville,MD)测定了
细胞增殖水平。WST-8经活细胞中的脱氢酶还原成可溶于组织培养基
的橙色甲臜产物，所产生的甲臜的量与活细胞的数量成正比。将
WST-8最终体积的10％加到各孔中，将板在37℃下在潮湿的5％CO2
培养箱中再孵育2-4h。然后通过在SpectraMaxM2酶标仪(Molecular
Devices,Sunnyvale,CA)中在450nm处测量吸光度(A450)对板进行分
析。将仅含培养基和WST-8的孔的背景A450吸光度从所有值中减去。
通过将各个经处理的样品的值除以未处理细胞的孔的平均值而计算
存活分率(存活分率＝(A450处理的样品–A450背景)/(A450未处
理的样品–A450背景))。对结果归一化，使得0表示不存在EGF时
的细胞增殖水平，而1则表示在存在EGF但无任何抗EGFR抗体处
理的情况下的细胞增殖水平。
在进行增殖确定前，确认了抗EGFR抗体与人原代角质形成细胞
以及MCF10A细胞的结合。角质形成细胞增殖测定的代表性结果在
图8中示出。如通过毒性特征所预知，西妥昔单抗和帕尼单抗以剂量
依赖性方式强烈抑制了角质形成细胞增殖，而huML66和muEGFR-8
抗体则与阴性对照嵌合KTI抗体相似对角质形成细胞几乎无影响。
相似地，如图9中所示，西妥昔单抗和帕尼单抗强烈抑制了MCF10A
细胞增殖，而huML66和muEGFR-8抗体则对正常上皮细胞生长几
乎无影响。这些数据表明：ML66和EGFR-8抗体对正常上皮细胞的
毒性弱于西妥昔单抗和帕尼单抗。
实施例9
NCI-H292和NCI-H322M细胞系基底增殖的抑制
为了确定抗EGFR抗体在抑制肿瘤细胞基底增殖水平方面的能
力，制定了使用EGFR表达NCI-H292(ATCC)和NCI-H322M(NCI)
肺肿瘤细胞系的增殖测定法。将细胞以2,000个细胞/孔的密度铺到含
10％FBS的正常生长培养基中，并在37℃和存在不同浓度的抗EGFR
抗体的情况下生长5天。如实施例8中所述，使用比色WST-8测定
法测量了细胞增殖水平。将OD结果归一化，使得存活分率1表示无
抗EGFR抗体的正常生长培养基中生长的细胞，而0则表示无细胞的
孔。
图10A和B分别示出使用NCI-H292和NCI-H322M细胞的增殖
测定结果。西妥昔单抗和帕尼单抗处理以剂量依赖性方式抑制了两种
细胞系的增殖。相比之下，huML66和muEGFR-8抗体不影响肿瘤细
胞生长。
实施例10
抗EGFR抗体结合竞争
为了区分抗EGFR抗体的结合表位，使用流式细胞术进行了抗体
结合竞争测定。在本实验中，在存在不同浓度的“竞争性”抗体的情况
下测量了生物素化528抗体(由得自ATCC的528杂交瘤产生)和西
妥昔单抗与MDA-MB468细胞的结合。如实施例8中所述，首先将
528抗体和西妥昔单抗用生物素标记。将0.2nM的生物素化528抗体
或西妥昔单抗与不同浓度的帕尼单抗、西妥昔单抗、528、muEGFR-8、
huML66和KTI抗体预混。将抗体混合物与靶A431细胞在冰上孵育
2h。洗涤细胞，用链霉亲和素-alexa488偶联物在冰上孵育1h。洗涤
后，将细胞固定，在FACScalibur中分析。在半对数图中针对抗体浓
度绘制几何平均荧光强度，并归一化使得100％表示在不存在竞争抗
体的情况下生物素化参考抗体的最大结合，而0％则表示在不存在生
物素化抗体的情况下的背景染色。图11A和B分别示出在存在竞争
抗体的情况下生物素化528抗体和西妥昔单抗的代表性结合结果。图
11中的数据表明：528、西妥昔单抗和帕尼单抗彼此竞争，而huML66
和muEGFR-8抗体不与西妥昔单抗和528抗体竞争，从而表明本发
明的抗体与不同于西妥昔单抗和528抗体的表位的表位结合。
实施例11
huEGFR抗体的ADCC活性
使用新鲜分离的人自然杀伤(NK)细胞作为效应细胞，将乳酸脱氢
酶(LDH)释放测定法用于测量肿瘤细胞系的抗体依赖性细胞介导的
细胞毒性(ADCC)(ShieldsRL,JBiolChem.2001276(9):6591-604)。首
先使用NK细胞分离试剂盒II(#130-091-152；MiltenyiBiotec,Auburn,
CA)的改善方案，从正常供体(ResearchBloodComponents,Inc.,
Brighton,MA)的人外周血液中分离NK细胞。将外周血液用1×PBS
稀释2倍。将25mL稀释后的血液小心铺层到50mL锥形管中的25
mLFicollPaque上，并在400g和RT下离心45分钟。从界面处采集
外周血单核细胞(PBMC)，转移到新的50mL锥形管中，用1×PBS洗
涤一次。对PBMC计数，以2.5×107个细胞/100μl的浓度用MACS缓
冲液(1×PBS,0.5％BSA,2mMEDTA)重悬，然后向细胞悬液中加入
1/4倍体积的NK细胞生物素-抗体混合物(Biotin-AntibodyCocktail)。
NK细胞生物素-抗体混合物包含结合到除了NK细胞的淋巴细胞的生
物素化抗体，从而导致NK细胞的阴性选择。将混合物在4℃孵育10
分钟，然后加入将结合到生物素化抗体的3/5倍体积的MACS缓冲液
和2/5倍体积的NK细胞微珠混合物。将细胞-抗体混合物在4℃下再
孵育15分钟。接下来，将细胞用50mL的MACS缓冲液洗涤一次，
然后重悬在3mL的MACS缓冲液中。使用autoMACS分离机(Miltenyi
Biotec)将NK细胞作为阴性部分而分离。将所得的NK细胞铺到30mL
完整RPMI培养基(补充了5％胎牛血清、1％青霉素-链霉素、1mM
HEPES、1mM丙酮酸钠、1％100XMEM非必需氨基酸溶液的
RPMI-1640)上过夜。后续测定以及所有的稀释均在RHBP培养基(补
充了20mMHEPES,pH7.4、0.1％BSA和1％青霉素-链霉素的
RPMI-1640培养基)中进行。
将RHBP培养基中多种浓度的抗体按50μL/孔一式两份地等分
到圆底96孔板中。将靶细胞(在该实验中为A431细胞系)以106
个细胞/mL的浓度重悬在RHBP培养基中，再以100μL/孔添加到含
有抗体稀释液的各孔中。将含有靶细胞和抗体稀释液的板在室温下孵
育30分钟。然后，将NK细胞以50μL/孔添加到含有靶细胞的孔中。
典型的比率为1个靶细胞对应3-4个NK细胞。对于各实验设立了以
下对照：仅NK细胞、仅靶细胞(自发LDH释放)、含NK细胞的靶
细胞(抗体依赖性LDH释放)、含10％TritonX-100的靶细胞(最大
LDH释放)。将混合物在37℃下孵育4h以允许细胞裂解。将板以1200
rpm离心10分钟，将100μL上清液小心转移到新的平底96孔板。
将得自细胞毒性检测试剂盒(Roche1644793)的LDH反应混合物
(100μL/孔)加到各孔中，并在室温下孵育5至30分钟。在490nm
处测量样品的光密度(OD)(OD490)。使用下式确定各样品的百分比特
异性裂解：百分比特异性裂解＝(样品值-自发释放)/(最大释放-自发释
放)*100。
图12示出与chKTI抗体的ADCC活性相比的huML66抗体的代
表性ADCC活性。huML66抗体以剂量依赖性方式诱导了靶细胞的
NK细胞介导的杀伤，最大特异性杀伤达到了50％以上。相比之下，
未结合到靶细胞的chKTI抗体未能介导ADCC。
实施例12
huML66-SMCC-DM1的制备
将(琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯
(SMCC,PierceBiotechnology,Inc)连接基溶于二甲基乙酰胺(DMA)。
通过将50mM磷酸钾、50mMNaCl、2mMEDTA,pH6.5中5mg/mL
的抗体用10摩尔过量的SMCC孵育，将huEGFR抗体用SMCC修饰
以将马来酰亚胺引入抗体。在环境温度下约100分钟后，将反应混合
物用通过相同的磷酸钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25柱纯化。将
含有抗体的馏分合并，用于后续步骤。
使SMCC修饰的抗体与相对于马来酰亚胺连接基1.7摩尔过量的
10mM的DM1溶液反应。将反应物在环境温度下搅拌大约18个小
时。将偶联反应混合物通过用1×PBS(pH6.5)平衡的SEPHADEXTM
G25凝胶过滤柱过滤。然后将huEGFR抗体-SMCC-DM1偶联物渗析
到含有10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖的缓冲液(pH5.5)中。
使用之前报道的抗体和DM1的消光系数(Liu等.,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA,93,8618-8623(1996))确定每个抗体分子连接的DM1分子
的数量。通过将20-50μg偶联物进样到用100mM醋酸铵缓冲液(pH
7.0)中的25％乙腈平衡的HiSep柱上，并用乙腈洗脱而测定偶联反应
后存在的游离美登木素的百分比。使用设置到252nm波长的吸光度
检测器测量了总游离美登木素物质(梯度洗脱并通过与已知标准品比
较洗脱时间而鉴定)的峰面积，并与结合的美登木素(在穿柱馏分的
偶联物峰中洗脱)的相关峰面积进行比较，以计算总游离美登木素物
质的百分比。得到了每个huEGFR抗体具有3.5-4个DM1分子的偶
联物，其中<1％作为未偶联的美登木素存在。
huML66-SPDB-DM4的制备
将示例性N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)连
接基溶于乙醇中。在含有50mMNaCl、2mMEDTA和3％乙醇的50
mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，将huEGFR抗体以8mg/mL用5.5-5
倍摩尔过量的SPDB连接基在室温下孵育大约2小时。将SPDB修饰
的抗体在PBS(pH6.5)中稀释2倍，通过添加DM4的二甲基乙酰胺
(DMA)浓缩溶液(15-30mM)用1.5倍摩尔过量的美登木素DM4修饰。
在室温下过夜孵育后，将偶联的抗体在用10mM组氨酸、250mM甘
氨酸、1％蔗糖(pH5.5)平衡的SEPHADEXTMG25F*上通过层析纯化。
使用之前报道的抗体和美登木素的消光系数(WiddisonWC等JMed
Chem,49:4392-4408(2006))确定每个抗体分子连接的DM4分子的数
量。如上所述确定总游离美登木素物质的百分比。得到每个huEGFR
抗体具有3.5-4个DM4分子的偶联物，其中<1％作为未偶联的美登木
素存在。
实施例13
美登木素偶联物的结合亲和力
如实施例2中所述，使用MDA-MB468细胞或A431细胞，将
huML66和muEGFR-8抗体美登木素偶联物的结合亲和力与裸抗体的
结合亲和力进行比较。从huML66抗体和偶联物的结合曲线(图13A)
计算的Kd对于裸huML66抗体为1.12nM，对于huML66-SMCC-DM1
偶联物为2.33nM，以及对于huML66-SPDB-DM4偶联物为2.93nM。
从muEGFR-8抗体和偶联物的结合曲线(图13B)计算的Kd对于裸
muEGFR-8抗体为1.43nM，对于muEGFR-8-SMCC-DM1偶联物为
4.54nM。该数据表明DM偶联不显著改变huML66和muEGFR-8抗
体对huEGFR的结合亲和力。
实施例14
体外细胞毒性测定
使用体外细胞毒性测定法测量了EGFR抗体美登木素偶联物抑
制肿瘤细胞生长的能力。简而言之，将靶细胞以1,500至3,000个细
胞/孔铺到含有10％FBS的100μL完整RPMI培养基中。使用5倍稀
释序列将偶联物稀释到完整RPMI培养基中，向每个孔加入100μL。
最终浓度通常在3×10-8M至8×10-14M的范围内。将细胞在37℃下在
潮湿的5％CO2培养箱中孵育5天。通过比色WST-8测定法测定了
剩余细胞的活力，在多孔酶标仪中测量了450nm处的吸光度(A450)。
通过将各处理样品的值除以未处理对照的平均值而计算存活分率。在
各处理的半对数图中，针对抗体-偶联物浓度绘制了存活分率值。
在图14中，将huML66-SMCC-DM1和huML66-SPDB-DM4偶
联物的体外细胞毒性与非特异性美登木素偶联物诸如
chKTI-SMCC-DM1和chKTI-SPDB-DM4偶联物的活性进行了比较。
得自典型细胞毒性测定的结果分别针对NCI-H226(ATCC)、NCI-H292
(ATCC)和NCI-H322Mcells(NCI)在图13A、B和C中示出。huML66
Ab偶联物在三种EGFR表达肿瘤细胞系中表现出了强且特异性的细
胞毒性，EC50范围为3nM至0.1nM。
在图15中，在KB细胞系中测试了嵌合ML66-SMCC-DM1
(chML66-SMCC-DM1)的特异性毒性。在该实验中，将靶细胞在具有
或不具有过量的裸chML66抗体(1μM)的情况下用chML66偶联物孵
育。裸chML66抗体阻断了ML66偶联物的结合，从而抑制了偶联物
的特异性细胞毒性。在有和无裸ML66抗体阻断的情况下，
ML66-SMCC-DM1的EC50分别为30nM和3nM。因此，对于ML66
偶联物，存在一个对数特异性窗口。
在图16中，将muEGFR-8-SMCC-DM1的体外细胞毒性与非特
异性chKTI-SMCC-DM1偶联物的活性进行比较。得自典型细胞毒性
测定的结果分别针对NCI-H226(ATCC)、NCI-H292(ATCC)和
NCI-H322Mcells(NCI)在图16A、B和C中示出。
muEGFR-8-SMCC-DM1偶联物在三种EGFR表达肿瘤细胞系中表现
出强且特异性的细胞毒性，EC50在NCI-H226、NCI-H292和
NCI-H322M中分别为0.68nM、0.43nM和3.07nM。相比之下，
chKTI-SMCC-DM1具有很小的影响，裸muEGFR-8抗体在所有三种
细胞系中均未表现出任何毒性。这些数据表明：DMx偶联使得本发
明的非拮抗性EGFR抗体变成高细胞毒性的。
实施例15
chML66抗体美登木素偶联物在KB肿瘤模型中的体内功效研究
使用皮下植入SCID小鼠中的EGFR表达KB细胞，在建立的肿
瘤异种移植模型中测试了chML66抗体-美登木素偶联物的活性。在
平均肿瘤体积达到约115mm3时将动物按肿瘤体积随机分成处理组，
并注射一次20或10mg/kg的chML66-SMCC-DM1偶联物或者5或
2.5mg/kg的chML66-SPDB-DM4偶联物。针对肿瘤细胞接种后的时
间绘制各处理组的中位肿瘤体积(图17)。显然的是，用chML66-DM
偶联物处理显著延迟了肿瘤生长。具体地讲，5mg/kg剂量的
chML66-SPDB-DM4处理导致了6只小鼠中有3只无肿瘤，而所有6
只小鼠都具有完全反应(无可触摸的肿瘤)。较低剂量的
chML66-SPDB-DM4也导致了6只小鼠中有4只出现完全反应。
chML66-SMCC-DM1处理的小鼠均未出现完全反应，然而该偶联物
处理显著抑制了肿瘤生长。肿瘤生长抑制百分比(％T/C)对应于当对
照组的肿瘤体积达到预定大小时各处理组的肿瘤体积的中值除以对
照组的中位肿瘤体积。将％T/C值低于42％的处理视为具有活性，而％
T/C值低于12％的处理则视为具有高度活性。细胞接种后第20天时
的％T/C值对于10mg/kgchML66-SMCC-DM1、20mg/kg
chML66-SMCC-DM1、2.5mg/kgchML66-SPDB-DM4和5mg/kg
chML66-SPDB-DM4分别应于23％、6％、0％或0％。结果表明，chML66
美登木素偶联物在KB肿瘤异种移植物中具有高度活性。
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上文对具体实施方案的描述将全面揭示本发明的一般性质，使得
他人可通过应用本技术领域内的知识不用过度实验在不脱离本发明
的一般理念的情况下容易地对此类具体实施方案进行修改和/或使其
适应于各种应用。因此，根据本文提供的教导和指导，此类适应和修
改旨在落在所公开的实施方案的等同形式的含义和范围内。应当理
解，本文的用语或术语是用于说明性目的而非限制性目的，使得本说
明书的术语或用语将由技术人员按照教导和指导进行解读。
本发明的广度和范围不应由任何上述示例性实施方案限制，而是
应当根据以下权利要求及其等同形式加以限定。