地枫皮的质量控制方法技术领域
本发明涉及地枫皮的质量控制方法，属于药物质量控制技术领域。
背景技术
中药地枫皮为八角属植物地枫皮IlliciumdifengpiK.I.BetK.I.M.的干燥树
皮，为中国药典收录品种(原属壮药品种)，具有祛风除湿，行气止痛的疗效，
在广西民间地枫皮主要用于治疗风湿关节炎、腰肌劳损和跌打损伤等症。该
植物生长于石灰岩地区，是广西岩溶石山上一种特有中药材，属于国家Ⅱ级
重点保护野生植物，自然分布于广西的西南部、中部和西北部的岩溶地区，
其中以龙州、靖西、都安、马山分布最多。据文献报道，目前从地枫皮中分
离得到的化学成分主要有苯丙素、木脂素、黄酮、酚酸、萜类、甾醇等结构
类型，其中以苯丙素、木脂素和黄酮为主，并且这些类型化合物在药理实验
中表现出较好的抗炎活性。鉴于民间用药疗效及现代物质基础和药理等方面
的研究结果，已研制出多种以地枫皮为主药或辅以相关药材制成的制剂，如：
风湿关节炎片、桂龙药膏、风寒双离拐片、风湿安泰片、追风舒经活血片等
等，可见中药地枫皮在医药领域上具有广阔的应用前景。但地枫皮因特殊的
生长环境持续恶化，连年无序采挖，致使地枫皮面临着严峻的资源问题，因
此造成药材来源混乱，以次充好现象时有发生，以致曾出现“桂林地枫皮”
的伪品，在临床使用中发生中毒事故。造成目前这种局面，主要原因是缺少
药材质量控制方法和模式，在2010版《中国药典》对地枫皮也只作形态观察
和化学鉴别的要求。为了解决这一问题，就是建立一种简单、快速、有效的
分析方法，实现区别中药地枫皮的真伪和评价质量的好坏。
中药的本质是多种化学物质按照特定的相对含量比例组合而成的复杂体
系，若在规范的操作程序下，采用适当的提取分离方法将获得化学成分具体
的，特征的和含量相对稳定的中药特征性化学成分总提取物，同时利用现代
分析手段去表征其相对组成和结构，这种具有高度的重现性和特征性的分析
方法非常适用于药材的质量控制。目前尚未见有通过高压液相色谱法对中药
地枫皮多指标性成分的分析以实现其药材质量的检测方法的相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种准确度高、稳定性和重复性好的地
枫皮的质量控制方法。
本发明提供的地枫皮的质量控制方法，是以槲皮苷、芦丁、S1-3[4-O-(2
'-hydroxy-l'-hydroxymethylethyl)dihydroconiferylalcoholp-hydroxybenzoyl-gl
ucoside]和厚朴酚作为指标性成分，采用高效液相色谱法对地枫皮中上述指标
性成分进行分析从而实现对地枫皮质量的检测，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
以槲皮苷、芦丁、S1-3和厚朴酚为对照品，用体积分数为60～80％乙醇
或体积分数为60～80％甲醇溶解配制得到混合对照品溶液，其中，混合对照
品溶液中槲皮苷的浓度为2.00×10-2～6.00×10-1mg/ml，芦丁的浓度为
6.60×10-3～1.98×10-1mg/ml，S1-3的浓度为4.10×10-3～1.23×10-1mg/ml，厚朴
酚的浓度为6.00×10-3～1.80×10-1mg/ml；
(2)供试品溶液的制备
取地枫皮，粉碎，以体积分数为60～80％乙醇或体积分数为60～80％甲
醇为提取溶剂进行提取，所述地枫皮与提取溶剂的用量比为：1g：35～45ml，
提取完成后，冷却，当所得提取物的重量少于提取前地枫皮与提取溶剂的总
重量时，补加提取溶剂直至重量刚好与提取前地枫皮与提取溶剂的总重量相
等，过滤，得到供试品溶液；
(3)色谱条件
C18色谱柱，流速：0.5～1ml/min，柱温：20～30℃，波长：254nm或
280nm，流动相由A液和B液组成，其中A液为乙腈或甲醇，B液为体积分
数为0.1％甲酸水溶液或体积分数为0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序如
下：
0min时，A液：B液＝5～10％：95～90％；
30min时，A液：B液＝15～20％：85～80％；
40min时，A液：B液＝20～25％：80～75％；
65min时，A液：B液＝45～50％：55～50％；
85min时，A液：B液＝75～80％：25～20％；
(4)测定
精密吸取一定量上述混合对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相
色谱仪，按照上述色谱条件进行测定。
上述质量控制方法的步骤(1)中，优选采用体积分数为65～75％乙醇或
体积分数为65～75％甲醇溶解配制得到混合对照品溶液，更优选采用用体积
分数为70％乙醇或体积分数为70％甲醇溶解配制得到混合对照品溶液。
上述质量控制方法的步骤(1)中，配制的混合对照品溶液中槲皮苷的浓
度优选控制在8.00×10-2～4.00×10-1mg/ml，更优选为2.00×10-1mg/ml；芦丁的
浓度优选控制在1.32×10-2～1.32×10-1mg/ml，更优选为6.60×10-2mg/ml；S1-3
的浓度优选控制在8.20×10-3～6.56×10-2mg/ml，更优选为4.10×10-2mg/ml；厚
朴酚的浓度优选控制在6.00×10-3～1.5×10-1mg/ml，更优选为7.20×10-2mg/ml。
上述质量控制方法的步骤(2)中，提取溶剂优选为体积分数为65～75％
乙醇或体积分数为65～75％甲醇，更优选为体积分数为70％乙醇或体积分数
为70％甲醇。该步骤中的提取溶剂最好是与步骤(1)中配制混合对照品溶液
的溶剂相同。
上述质量控制方法的步骤(2)中，在对地枫皮提取时，提取的方式可以
是现有技术中的常规提取方式，如浸提、加热提取、回流提取、超声提取等。
优选采用超声提取(工作频率优选为30～100KHz)，提取的时间通常为0.5～
2h，通常选择1h。
上述质量控制方法的步骤(3)中，在梯度洗脱时，优选的洗脱程序如下：
0min时，A液：B液＝10％：90％；
30min时，A液：B液＝18％：82％；
40min时，A液：B液＝24％：76％；
65min时，A液：B液＝45％：55％；
85min时，A液：B液＝75％：25％。
上述质量控制方法的步骤(3)中，进样量根据需要确定，通常为10μL或
20μL。
按上述方法进行检测，测定结果中，地枫皮药材按干燥品计算，含槲皮
苷不低于0.2％，含芦丁不低于0.018％，含S1-3不低于0.017％，含厚朴酚不
低于0.007％。
在上述研究的基础上，还可以进一步制定标准指纹图谱，之后将地枫皮
待测样品指纹图谱与制定的标准指纹图谱进行比较，通过计算相似度，识别
两者所具有的共同吸收峰的数量来鉴别地枫皮的质量，其中待测样品指纹图
谱与制定的标准指纹图谱比对，其相似度应为0.88以上，通常为0.9～1.0。
与现有技术相比，本发明以槲皮苷、芦丁、S1-3和厚朴酚作为指标性成
分，利用高效液相色谱法建立对地枫皮质量的检测方法和质量鉴别方法，各
成分含量检测结果准确，检测方法的精密度高、稳定性及重复性好，对保证
药材的质量更为有效，能有效确保中药地枫皮质量的均一稳定。
以下是申请人确定最优色谱条件的实验部分：
1.仪器、试剂药品：
Agilent1200型高效液相色谱仪(真空在线脱气系统、四元泵、自动进样
器、VWD检测器，美国安捷伦公司)；LC/MS-IT-TOFSystem质谱仪，
(Shimadzu,Tokyo,Japan)；XS205型电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海
有限公司)；KQ-300E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
对照品槲皮苷、芦丁、S1-3[4-O-(2'-hydroxy-l'-hydroxymethylethyl)
dihydroconiferylalcoholp-hydroxybenzoyl-glucoside]、厚朴酚均为广西壮族自
治区中国科学院广西植物研究所分离得到(纯度大于98％，HPLC检测，用
面积归一化法计算)；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂(如甲醇、乙醇、
甲酸等)均为分析纯。
2实验方法
2.1色谱条件
Agilent1200型高压液相色谱仪，AgilentZORBAXSB-C18(5μm,4.6x
250mm)，流速：1ml/min，柱温：30℃，波长：254nm，进样量：20μL，流
动相：体积分数为0.1％的甲酸(B液)-乙腈(A液)，梯度洗脱，梯度洗脱程
序如表1所示。
表1：梯度洗脱条件
2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备
精密称取对照品槲皮苷20mg、芦丁6.6mg、S1-34.1mg和厚朴酚6.0mg，
置于10ml容量瓶中，加入适量体积分数70％的乙醇超声溶解，定容，摇匀即
得到混合对照品溶液，其中槲皮苷的浓度为2.00mg/ml，芦丁的浓度为0.66
mg/ml，S1-3的浓度为0.41mg/ml，厚朴酚的浓度为0.60mg/ml。
2.2.2供试品溶液的制备
干燥的地枫皮(经广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所唐辉研究
员鉴定，确定为八角属植物地枫皮IlliciumdifengpiK.I.BetK.I.M.)，粉碎过
40目筛网。
精密称取0.5g粉末转入置塞锥形瓶中，加入体积分数70％的乙醇溶液
20ml，称重，超声提取1h，冷却后向其中补加体积分数70％的乙醇，直至整
个体系的重量与进行提取前体系的重量相等，过滤，即得供试品溶液。
3.色谱条件的建立及优化：
3.1指标性成分的选定及波长的选择
指标性成分的选定应具有代表性，在供试液中含量较高，紫外区吸较强，
且分离度较好易于识别。在前期中药地枫皮LC/MS分析和化学成分的分离纯
化以及结构鉴定工作基础上，选定槲皮苷、芦丁、S1-3和厚朴酚作为指标性
成分(MS数据如下述表2所示)，理由有以下三点：(1)选定的4个化合物
结构中，槲皮苷和芦丁为黄酮苷类，S1-3为苯丙苷类，厚朴酚则为木脂素类，
均是中药地枫皮中的特征性成分，并且具有抗炎活性。(2)指标性成分结构
中含有紫外吸收基团。(3)在供试品溶液中含量较高且分离度较好，易于识
别(如图1所示)。
通过DAD(二极管阵列检测器)检测器记录供试品溶液在195～400nm
范围内的三维图分析，确定选定的指标性成分在254nm和280nm均具有较好
的吸收，选择以254nm作为色谱条件的检测波长。
表2：指标性成分MS数据
3.2洗脱溶剂及色谱柱的选择
通过文献调研及指标性成分结构分析，在反相高效液相色谱中，含有酚
羟基的化合物，在水中会部分解离，而未解离的羟基与固定相作用较强，从
而导致拖尾，因此需要加入缓冲液来克服拖尾现象，故选用体积分数0.1％甲
酸作为缓冲液，实验结果表明体积分数0.1％甲酸/乙腈作为流动相对供试品中
的成分具有较好分离度。
试验选用了AgilentZORBAXSB-C18(5μm,4.6x250mm)、phenomenex
LunaC18(5μm,4.6x250mm)和Reprosil-purBasicC18(5μm,4.6x250mm)
色谱柱，以体积分数0.1％甲酸/乙腈作为流动相对指标性成分均能得到较好分
离，表明C18填料的色谱柱对供试品溶液有较好的分离度。
3.3供试品提取溶液的选择
本试验优选选用体积分数为70％的乙醇作为提取溶剂基于以下两个方
面：一方面，甲醇和乙醇的性质相似，均能有效地提取中药地枫皮中的物质，
且乙醇无毒副作用；另一方面，4个指标性成分中厚朴酚属于苷元成分，极
性较小，其他三个属于苷类成分，极性较大。为了能同时将指标性成分尽可
能提取完全，考察体积分数分别为50％，70％，90％，100％乙醇作为提取溶
剂的提取效果，结果表明体积分数70％乙醇溶液提取的供试品溶液中4个指
标性成分含量最高，结果如下述表3所示。
表3：不同体积分数乙醇对4种指标成分峰面积的影响
3.4提取时间的考察
分别精密称取0.5g上述经鉴定的中药地枫皮粉末3份，分别转入置塞锥
形瓶中，分别加入体积分数为70％的乙醇溶液20ml，称重，分别超声提取0.5h、
1h、2h，冷却后向其中补加体积分数70％的乙醇，直至整个体系的重量与进
行提取前体系的重量相等，过滤，分别注入高效液相色谱仪进行分析，结果
如下述表4所示。结果表明2h以后4个指标性成分变化不大，综合考虑提取
时间最终确定为1h。
表4：提取时间考察
4.系统适用性及方法学考察
4.1指标性成分标定及理论板数
按上述色谱条件分别将混标(即混合对照品溶液，下同)和地枫皮供试品
溶液注入高效液相色谱仪分析，色谱图如图2所示，并计算指标性成分槲皮
苷在色谱柱中的理论板数，结果如下述表5所示。
表5：指标性成分在色谱柱中的理论板数
槲皮苷(样品)
槲皮苷(混标)
|
TR(min)
36.219
36.104
W(h/2)(min)
0.43
0.45
理论板数
39304.82
35661.15
4.2精密度实验
取供试品溶液，按上述色谱条件，连续进样5次，进样量20μL，色谱图
如图3所示。结果如下述表6所示。4种指标性成分RSD<2％，表明精密度
良好。
表6：精密度实验结果
4.3稳定性实验
按上述色谱条件，供试品溶液在制备后分别于0h、3h、6h、9h、12h进
样20μL进行分析，4种指标性成分的RSD<2％，色谱图如图4所示。结果
如下述表7所示，结果表明供试品在12h内稳定。
表7：稳定性实验结果
4.4重复性实验
按供试品溶液制备方法制备5份样品，按上述色谱条件，分别进样20μL
进行分析，色谱图如图5所示。4种指标性成分RSD<4％，结果表明该方法
重现性好。结果如表8所示。
表8：重复性实验结果
4.5对照品标准曲线建立
按对照品溶液的制备方法制备混合对照品母液，用移液枪依次吸取混合
对照品溶液10、20、40、80、100、120、160、200、250、300μL，分别加入
体积分数70％的乙醇定量至1ml，摇匀即得不同浓度的混合对照品溶液，分
别注入高液液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标，进
样量为横坐标，建立对照品标准曲线，测定结果如下述表9所示。
表9对照品标准曲线
对照品
回归方程
R2
线性范围(ng)
芦丁
y＝1.2275x-13.25
0.9999
66～1980
S1-3
y＝1.3123x-13.544
0.9994
41～1230
槲皮苷
y＝4.0887x-78.441
0.9999
200～6000
厚朴酚
y＝1.3981x-1.9871
0.9999
60～1800
附图说明
图1为供试品溶液的HPLC-UV色谱图；
图2为混合对照品溶液与供试品溶液的HPLC-UV色谱图；
图3为精密度实验中供试品溶液连续进样5次的HPLC-UV色谱图；
图4为稳定性实验中供试品溶液在5个不同时间内的HPLC-UV色谱图；
图5为重复性实验中5份供试品溶液的HPLC-UV色谱图；
图6为市场上销售的地枫皮伪品及假地枫皮的HPLC-UV色谱图；
图7为10批次不同来源的地枫皮HPLC-UV色谱图；
图8为地枫皮HPLC-UV指纹图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的
内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
(1)对照品溶液的制备
精密称取对照品槲皮苷20mg、芦丁6.6mg、S1-34.1mg和厚朴酚6.0mg，
置于10ml容量瓶中，加入适量体积分数70％的乙醇超声溶解，定容，摇匀，
即得到混合对照品溶液，其中槲皮苷的浓度为2.00mg/ml，芦丁的浓度为0.66
mg/ml，S1-3的浓度为0.41mg/ml，厚朴酚的浓度为0.60mg/ml。
(2)供试品溶液的制备
取广西两个产地(广西都安县(简称广西都安)、广西河池天峨县(简称广西
天峨))的中药地枫皮，经广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所唐辉研究
员鉴定，均确定为八角属植物地枫皮IlliciumdifengpiK.I.BetK.I.M.，上述两
个产地的样品分别记为1#供试品和2#供试品，分别粉碎过40目筛网。精
密称取0.5g1#供试品粉末转入置塞锥形瓶中，加入体积分数70％的乙醇溶
液20ml，称重，超声提取1h，冷却后向其中补加体积分数70％的乙醇，直至
整个体系的重量与进行提取前体系的重量相等，过滤，即得1#供试品溶液。
按同样方法制得2#供试品溶液。
(3)色谱条件：
AgilentZORBAXSB-C18(5μm,4.6x250mm)，流速：1ml/min，柱温：
30℃，波长：254nm，进样量：20μL，流动相由A液和B液组成，其中A液为
乙腈，B液为体积分数为0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱，洗脱程序如下：
0min时，A液：B液＝10％：90％；
30min时，A液：B液＝18％：82％；
40min时，A液：B液＝24％：76％；
65min时，A液：B液＝45％：55％；
85min时，A液：B液＝75％：25％。
(4)测定
精密吸取20μL步骤(2)制得的1#供试品溶液和2#供试品溶液，分别
注入高效液相色谱仪，按照步骤(3)所述色谱条件进行测定，每个样平行测
定3次，测定结果如下述表10所示。
表10地枫皮含量测定结果
(5)市场上销售的标示为地枫皮的样品及假地枫皮样品分析比较
取市场购买的标示为地枫皮的样品及假地枫皮样品(各地枫皮样品产地
来源如表11所示)，按上述步骤(2)制得的供试品溶液，分别精密吸取20μL
供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照上述步骤(3)所述色谱条件进行测
定，结果见图6。通过HPLC-UV色谱图可以很清晰看出上述所购买的地枫皮
与经过鉴定的正宗地枫皮差异很大，因而可以鉴定为地枫皮伪品。可见，通
过本发明建立的HPLC色谱方法可以快速鉴别样品的真伪。
表11地枫皮(购买)来源
样品
产地
标示为地枫皮的样品
广西桂林
标示为地枫皮的样品
河北
假地枫皮样品
广西资源
地枫皮HPLC-UV指纹图谱建立及技术参数
1、特征峰的标定
精密吸取20μL按前述步骤(2)制得的不同来源的10批供试品溶液(各
种地枫皮样品来源见表12，各地枫皮样品均广西壮族自治区中国科学院广西
植物研究所唐辉研究员鉴定，均确定为八角属植物地枫皮Illiciumdifengpi
K.I.BetK.I.M.)，分别注入高效液相色谱仪，按照前述步骤(3)所述色谱条
件进行测定。根据10批次供试品HPLC-UV图谱所给出的相关参数，地枫皮
所有成分的色谱峰在85min内全部出现，其中槲皮苷为其主要成分，积分百
分比最大，因此选择槲皮苷作为参考峰。
参考峰槲皮苷标号为S，其他特征峰依次标号为1，2，…N。
表12：10批次地枫皮的来源及鉴定
采集地点
种名
编号
广西都安
Illicium difengpi
S1
广西都安
Illicium difengpi
S2
广西马山
Illicium difengpi
S3
广西马山
Illicium difengpi
S4
广西马山
Illicium difengpi
S5
广西天峨
Illicium difengpi
S6
广西天峨
Illicium difengpi
S7
广西天峨
Illicium difengpi
S8
广西忻城
Illicium difengpi
S9
广西龙州
Illicium difengpi
S10
2、特征峰相对保留时间及积分相对比值
根据10批次供试品HPLC-UV图谱给出的相关参数，比较各供试品色谱
图(见图7)，其中18个峰是10批次供试品共有的，因此确定这18个峰为
共有指纹峰。以槲皮苷为参照峰(S)，芦丁(7)、S1-3(9)和厚朴酚(16)
为特征峰，建立地枫皮HPLC-UV指纹图谱(结果如图8所示)，各共有峰的
相对保留时间和相对峰面积的比值见表13和表14。
表13：10批次地枫皮共有峰的相对保留时间
表14：10批次地枫皮共有峰的相对峰面积
3、指纹图谱相似度
应用指纹图谱相似度评价软件对各个产地的地枫皮药材指纹图谱进行相
似度计算。得到不同产地地枫皮与对照谱图的相似度。结果除9号相似度略
偏低外，其他产地的地枫皮相似度均在90％以上，结果见表15。
表15：10批次地枫皮的指纹图谱相似度计算结果
样品
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
对照指纹图谱
相似度
1
0.99
0.93
0.92
0.91
0.91
0.92
0.92
0.88
0.90
0.97