一种鉴定γδT细胞杀伤的方法技术领域
本发明是细胞免疫学技术领域，具体是运用流式细胞原理检测通过双标法标记Calcein－AM和PI染色的方法鉴定γδT细胞杀伤效率。
发明背景
T淋巴细胞根据表达T细胞抗原受体（Tcellreceptor,TCR）的不同分为两类：RCRαβ细胞和TCRγδ细胞，其中γδT细胞是一个桥连接固有免疫和适应性免疫的独特的一群T淋巴细胞，γδT主要分布于皮肤和黏膜组织中，占外周淋巴细胞群的0.5－5%，这样一群细胞在机体抗感染和抗肿瘤免疫中发挥着重要的作用，目前已经临床实验证实了γδT细胞在肿瘤的生物治疗中已经得到良好的治疗效果和广泛的应用，但是如何对体外扩增培养的的γδT细胞进行功能性的检测？本发明就针对这一项进行公开的阐述，免疫细胞杀伤实验的经典的检测方法是用51Cr释放法，但是由于51Cr是放射性物质，操作起来不方便等原因限制了这一个方法的广泛应用，而MTT法和乳酸脱氢酶（LDH）释放法都存在灵敏度不高等原因也限制了其广泛应用，本发明就是运用calcein－AM和PI双标染色法结合流式细胞仪上检测免疫细胞杀伤效率。本方法优点是操作简单，准确，经济，快速，并能得到很好的稳定性。对于其他所有免疫细胞的功能性鉴定提供的十分重要的价值。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种简单快速检测γδT细胞的杀伤性功能的方法，通过流式细胞仪上可以快速检测出细胞的杀伤效率的方法，克服经典的51Cr的放射性物质的污染和MTT，LDH的方法的灵敏度低的限制条件。
本发明所采用的技术方案是：一种简单快速检测γδT细胞的杀伤性功能的方法，包括以下步骤：
（1）制备外周血单个核细胞：采取健康志愿者的外周血，肝素钠抗凝，应用淋巴细胞分离液进行密度梯度分离得到单个核细胞，用GT-T551培养基或者RPMI1640培养基重悬细胞。
（2）诱导培养γδT细胞:重悬好的细胞沉淀，取少量进行细胞计数，调整浓度在(1－2)X106/ml，加入磷酸抗原HMBPP20ng/ml和rhIL-2因子1000IU/ml对细胞诱导，放37OC，5%CO2培养箱培养至10－14天。
（3）Calcein－AM标记肿瘤细胞:取对数生长期的KA562细胞，PBS洗涤1次，无血清RPMI1640培养基重悬，计数后调整细胞密度在(1－2)X106/ml，加入钙黄绿素（Calcein-AM）0.1uM，37度染色30分钟；PBS洗涤2次，离心后用无血清培养基重悬，计数后调整浓度在4X105/ml,2X105/ml，1X105/ml，备用。
（4）与γδT细胞共培养：取第10天之后的γδT,PBS洗涤1次，用无血清RPMI1640培养基重悬，计数，调整浓度在2X106/ml；铺24孔板，K562和γδT分别加入0.5ml，使得终浓度为5：1，10：1，20：1，各孔分别设置3个复孔，另外设置空白对照孔，阳性对照孔各重复3个复孔，于37度培养箱共培养24小时后，收集细胞上流式细胞仪检测细胞杀伤效率。
（5）流式检测细胞杀伤效率：共培养后24小时收集细胞到1.5mlEPPENDORF管中，1500rpm离心5分钟，沉淀用100ulPBS重悬起来，加入PI（1mg/ml）2ul到100ul体系中，混匀，室温放置15分钟；上BDAccuriC6流式细胞仪检测γδT细胞对K562的杀伤效率，设定空白管γδT对照孔和K562阳性对照孔，对K562对照孔进行圈门，再打开另一窗口，FL-1和FL-2进行作图，可直观得到杀伤率Ratio＝UR%
（6）根据本发明，所述的培养基为GT-T551免疫细胞专用培养基，RPMI－1640用于肿瘤细胞培养的培养基，Calcein－AM购于Invitrogen公司，碘化丙锭（PI）购于Sigma公司。流式细胞仪AccuriTMC6购于BD公司,Z2全自动细胞计数仪购于BeckmanCoulter公司。
本发明所用的原料和试剂除有特殊说明外，均市售可得。
具体实施方式
下面用实例具体说明本发明，但是本发明并不受其限制。下面实例中凡为注明具体条件的实验方法，均为遵循常规方法和厂家提供的操作说明执行。
实施例1
本实施例1是用外周血提取PBMC制备γδT细胞，包括以下步骤：
1.采取健康志愿者外周血，肝素纳抗凝，用人淋巴细胞分离液Ficoll进行密度梯度分离获得单个核细胞。具体步骤：510g/分，离心7分钟，降速为2，离心完毕后，吸取上层血浆层，56度灭活30分钟，510g/分，离心7分钟，取上层血浆层转到干净的离心管备用。沉淀的血细胞用生理盐水稀释后，将Ficoll分离液与稀释血液按照1：2的比例缓慢加入离心管中，转到离心机上离心，680g/分，离心20分钟，升降速度都调为1，离心完毕后，小心吸取白膜层，用生理盐水洗涤2次，510g/分，离心7分钟。最后沉淀用GT-T551培养基重悬沉淀，即可得到PBMC细胞。
2.将上述的PBMC细胞，取少量进行细胞计数，并用GT-T551培养基调整细胞浓度在（1－2）X106/ml，5ml/瓶种于Corning的T25培养瓶中，加入磷酸抗原激活剂和rhIL-2因子诱导γδT细胞，于37度培养箱培养，每隔2－3天进行半量补加培养基，计数并维持细胞密度在（1－2）X106/ml，显微镜观察细胞生长状态，培养至10－15天，即可以进行细胞杀伤实验的检测。
实施例2
本实施例2利用上述的γδT细胞检测悬浮的肿瘤细胞K562的杀伤作用，具体步骤如下：
取对数生长期的K562细胞作为靶细胞，PBS洗涤1次，PBS重悬细胞沉淀，调整细胞浓度在（1－2）X106/ml，加入活细胞染色标记物钙黄绿素（Calcein－AM）0.1uM于37度培养箱孵育30分钟，染色结束后用PBS洗涤细胞2次，1000rpm离心5分钟，最后一次离心，用无血清RPMI1640培养基重悬沉淀，计数后调整浓度为4X105，2X105，1X105,铺板于24孔板里，每个孔对应添加500ul，使得每个孔的细胞浓度为2X105，1X105，5X104/ml。取γδT细胞为效应细胞，PBS洗涤1次，用无血清RPMI1640培养基重悬细胞，计数，并调整细胞浓度在2X106/ml，铺板于24孔板，每个孔添加500ul，使得最后的效靶比为5：1，10：1，20：1，每孔重复3个复孔，并设置好对照孔，单效应细胞孔和单K562细胞孔，各重复3个复孔，于37度培养箱培养24小时，24小时后，收集细胞，PBS洗涤2次，加入PI染色15分钟，上流式细胞仪检测细胞杀伤活率。结果显示本发明制备的γδT对K562具有高效的杀伤活性，杀伤率平均为85%。
实施例3
本实施例3利用上述的γδT细胞检测贴壁的肿瘤细胞A549的杀伤作用，具体步骤如下：
取对数生长期的A549细胞作为靶细胞，PBS洗涤1次，PBS重悬细胞沉淀，调整细胞浓度在（1－2）X106/ml，加入活细胞染色标记物钙黄绿素（Calcein－AM）1uM于37度培养箱孵育30分钟，染色结束后用PBS洗涤细胞2次，1000rpm离心5分钟，最后一次离心，用无血清RPMI1640培养基重悬沉淀，计数后调整浓度为4X105，2X105，1X105,铺板于24孔板里，每个孔对应添加500ul，使得每个孔的细胞浓度为2X105，1X105，5X104/ml。取γδT细胞为效应细胞，PBS洗涤1次，用无血清RPMI1640培养基重悬细胞，计数，并调整细胞浓度在2X106/ml，铺板于24孔板，每个孔添加500ul，使得最后的效靶比为5：1，10：1，20：1，每孔重复3个复孔，并设置好对照孔，单效应细胞孔和单A549细胞孔，各重复3个复孔，于37度培养箱培养24小时，24小时后，收集细胞，仍有贴壁的细胞加入少量胰酶进行消化下来，离心收集细胞沉淀，PBS洗涤2次，加入PI染色15分钟，上流式细胞仪检测细胞杀伤活率。结果显示本发明制备的γδT对A549具有高效的杀伤活性，杀伤率平均为60%。