一种多肽、采用其体外激活的树突状细胞及其用途.pdf

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1、10申请公布号CN104072599A43申请公布日20141001CN104072599A21申请号201410250727522申请日20140606C07K14/47200601C12N5/0784201001A61K35/14200601A61P35/0020060171申请人深圳市阳溪生物科技有限公司地址518102广东省深圳市宝安西乡水库路桃花源科技创新园A栋20172发明人张国际郑意端廖冬宁檀东安宋芸娟莫方正74专利代理机构北京瑞恒信达知识产权代理事务所普通合伙11382代理人李渤张伟54发明名称一种多肽、采用其体外激活的树突状细胞及其用途57摘要本发明公开了HLAA02/03限。

2、制性癌胚抗原CEA抗原多肽及其多聚体和采用其体外激活的树突状细胞DC。本发明还公开了所述树突状细胞以及其联合细胞因子诱导杀伤细胞CIK在结肠癌治疗中的应用。本发明提供的多肽、制备的致敏DC以及CIK细胞可用于肿瘤的生物治疗。51INTCL权利要求书2页说明书7页序列表3页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书7页序列表3页附图1页10申请公布号CN104072599ACN104072599A1/2页21一种用于体外激活树突状细胞的多肽，其特征在于，所述多肽包含示于SEQIDNO1的氨基酸序列。2根据权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列示于。

3、SEQIDNO1；或者所述多肽包含彼此之间由连接肽连接的N个示于SEQIDNO1的氨基酸序列，其中N为24，优选为2；优选地，所述连接肽为LLL；更优选地，所述多肽的氨基酸序列示于SEQIDNO2、SEQIDNO3、或SEQIDNO4。3一种由根据权利要求1或2所述的多肽体外激活的树突状细胞，其特征在于，所述树突状细胞通过包括以下步骤的方法制备获取外周血单个核细胞，在含有GMCSF和IL4的培养基中培养，之后用根据权利要求1或2所述的多肽刺激，从而获得致敏的树突状细胞。4根据权利要求3所述的树突状细胞，其特征在于，所述方法包括以下步骤1获取外周血单个核细胞后，将单个核细胞置于容器中，静置使之形。

4、成两部分细胞，一部分贴附在容器壁上，一部分为悬浮细胞，分离其中的贴壁细胞；2使步骤1中得到的贴壁细胞在含有GMCSF和IL4的LONZA无血清培养基中培养59天、优选7天后，加入根据权利要求1或2所述的多肽共孵育210小时即可收获致敏的DC。5根据权利要求3或4所述的树突状细胞，其特征在于，所述方法的步骤2中，所述培养基含有200800IU/ML、优选500IU/MLGMCSF，以及8001500IU/ML、优选1000IU/MLIL4；优选地，共孵育时，将所述多肽加入培养基中并使之浓度为50200G/ML，优选100G/ML。6一种用于制备体外激活的树突状细胞的方法，其特征在于，所述方法包括。

5、以下步骤获取外周血单个核细胞，在含有GMCSF和IL4的培养基中培养，之后用根据权利要求1或2所述的多肽刺激，从而获得致敏的树突状细胞。7根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤1获取外周血单个核细胞后，将单个核细胞置于容器中，静置使之形成两部分细胞，一部分贴附在容器壁上，一部分为悬浮细胞，分离其中的贴壁细胞；2使步骤1中得到的贴壁细胞在含有GMCSF和IL4的LONZA无血清培养基中培养59天、优选7天后，加入根据权利要求1或2所述的多肽共孵育210小时即可收获致敏的DC。8根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法的步骤2中，所述培养基含有200800IU/ML、。

6、优选500IU/MLGMCSF，以及8001500IU/ML、优选1000IU/MLIL4；优选地，共孵育时，将所述多肽加入培养基中并使之浓度为50200G/ML，优选100G/ML。9一种用于治疗结肠癌的组合物，其特征在于，所述组合物包含根据权利要求35中任一项所述的树突状细胞，或者包含根据权利要求68中任一项所述的方法制得的树突状权利要求书CN104072599A2/2页3细胞。10根据权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含CIK细胞；优选地，所述CIK细胞通过包括以下步骤的方法制备获取外周血单个核细胞，在含有IFN的培养基培养，之后向培养基中加入抗人CD3抗体和IL2，培养。

7、获得CIK细胞；更优选地，所述方法包括以下步骤1获取外周血单个核细胞后，将该单个核细胞置于容器中，静置使之形成两部分细胞，一部分贴附在容器壁上，一部分为悬浮细胞，分离其中的悬浮细胞；2使步骤1中得到的悬浮细胞在含有IFN的LONZA无血清培养基中培养1624小时、优选24小时后，加入抗CD3抗体，细胞每13天半量换液，换液时补充IL2，培养59天、优选7天。11根据权利要求9或10所述的组合物，其特征在于，所述方法的步骤2中，所述培养基含有500U/MLIFN，之后加入10NG/ML的抗CD3抗体，每23天换液，换液时补充300U/MLIL2；优选地，培养7天后，细胞浓度为110810个细胞/。

8、ML；优选地，所述组合物由所述树突状细胞和CIK细胞以1101100、优选110的细胞数比率混合后培养制得。12根据权利要求1或2所述的多肽和/或根据权利要求35中任一项所述的树突状细胞和/或根据权利要求68中任一项所述的方法制得的树突状细胞和/或根据权利要求911中任一项所述的组合物在制备用于治疗结肠癌的药物中的用途。权利要求书CN104072599A1/7页4一种多肽、采用其体外激活的树突状细胞及其用途技术领域0001本发明涉及生物医学领域。具体而言，本发明涉及一种源于癌胚抗原的抗原多肽、其多聚体、采用其体外激活的树突状细胞、包含所述树突状细胞的药物组合物以及它们的临床应用。背景技术000。

9、2统计数据显示，我国已进入结直肠癌高发地区的行列。中国年均新发大肠癌病例13万，在癌症发病排名中，大肠癌已由第6位上升至第2位，并仍以年均45的增幅在不断攀升，远高于国外2的增幅水平。中国发达地区的大肠癌发病率较三十年前增长了两倍多，已经接近西方发达国家。2020年，中国可能有550万人罹患该病。0003结肠癌起病隐匿，早期常无明显的临床表现，病情发展较慢，出现明显的症状时大多已到中晚期，死亡率仅次于肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤第三位。结肠癌根治术后五年存活率可达50以上，早期病人的五年存活率可达到80以上，而晚期只有30左右。直肠癌五年生存率约652，各期的五年生存率如下0期932；I期914。

10、；II期764；III期58；IV期146。0004近年来，生物治疗越来越发挥出重要的作用。上世纪80年代起，免疫学与肿瘤学的迅速发展，1982年出现淋巴因子活化的杀伤细胞LAK疗法，随后相继出现肿瘤浸润淋巴细胞TIL疗法，细胞因子诱导的杀伤细胞CIK疗法和树突状细胞联合细胞因子诱导杀伤细胞DCCIK疗法。0005树突状细胞DENDRITICCELLS，DC是目前发现的人体内功能最强大的专职抗原提呈细胞APC，抗原提呈效率是其它APC的1001000倍，DC能提取、处理并递呈不同类型的抗原，激活初始T淋巴细胞，引发抗原特异性的免疫应答。未成熟的DC广泛分布于外周非淋巴组织中除脑外，其细胞表面高。

11、表达甘露醇受体、DEC205，FC受体CD16，CD32、补体受体CD35及脂多糖受体CD1LB，CDLLC，而成熟的DC则高表达MHCI、MHCII类分子、共刺激分子，激活效应细胞从而发挥抗肿瘤的作用。0006目前认为DC抗肿瘤机制主要有以下几点一、成熟的DC能够捕获不同类型的抗原，加工处理后，通过细胞表面表达的MHCI、MHCII类分子及表面标志白细胞分化抗原CD1分子途径启动T细胞的能力，从而有效地抵制肿瘤细胞的免疫逃逸反应。同时DC还可分泌辅助性T细胞LTH1型细胞因子IL12而启动CD4TH免疫应答，而活化的TH细胞也能正反馈上调DC分泌IL12，以此循环产生大量效应T细胞。二、DC。

12、通过分泌细胞因子和趋化因子选择性地趋化T细胞，并将趋化的T细胞定向迁徙至肿瘤部位。三、在肿瘤周围，DC与T细胞之间会相互产生作用，同时滤泡型DC会保留一些抗原，可使DC分泌一些生存因子而促进T细胞的生长增殖，维持T细胞免疫反应，从而延长效应T细胞在肿瘤部位的杀伤时间。四、DC可分泌细胞因子如IL12等从而抑制肿瘤血管的形成。0007癌胚抗原CEA是一种糖蛋白，主要存在于胎儿消化道上皮组织、胰脏和肝脏，正常成人鲜有表达。结直肠癌患者7090显示CEA强阳性；血清CEA水平变化与结肠癌说明书CN104072599A2/7页5DUKE分期密切相关。升高时主要见于中晚期肿瘤，进展期结肠癌DUKE分期C。

13、、D期时阳性率可达70以上，而DUKEA、B期其敏感性只有30左右。对于CEA水平升高的结肠癌患者，血清CEA水平与癌肿大小、有无转移存在一定关系，发生肝转移时，CEA升高更为明显。妊娠、大量吸烟以及肠道炎症、肾功能不全、结肠息肉、肝硬化、慢性肝炎、闭锁性黄疸等也可导致CEA水平增高。0008因此，可以考虑开发基于CEA的抗原多肽，应用于活化免疫细胞治疗结肠癌。发明内容0009HLAA2与HLAA3超型在中国人中的总平均分布频率超过85，因此使用CEA的HLAA2/A3限制性CTL表位激活的DC，将可以适用于大部分国人的结肠癌的生物治疗。因此，发明人通过研究，获得CEA的HLAA2/A3限制性。

14、CTL表位多肽，通过采用该多肽体外激活DC，可以活化免疫细胞，以治疗结肠癌。0010因此，本发明涉及采用HLAA02/03限制性癌胚抗原CEA抗原多肽或多肽多聚体，在体外激活树突状细胞，并将其用于结肠癌治疗。0011具体而言，本发明的一个目的在于提供一种用于体外激活树突状细胞的多肽，所述多肽源自HLAA02/03限制性CEA。所述多肽可以为特定序列的单体，也可以是通过连接肽形成的多聚体形式。0012本发明的另一个目的在于提供一种由所述多肽体外激活的树突状细胞及其制备方法。0013本发明的又一个目的在于提供包含所述树突状细胞与CIK细胞的细胞组合物。0014本发明的再一个目的在于提供所述多肽、树。

15、突状细胞以及细胞组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。0015本发明的技术方案如下0016一方面，本发明提供一种用于体外激活树突状细胞的多肽，所述多肽包含示于SEQIDNO1的氨基酸序列。此氨基酸序列源自癌胚抗原，发现其是CEA的HLAA2/A3限制性CTL表位多肽。0017根据一个具体实施方案，本发明提供的多肽可以是单体形式，其氨基酸序列示于0018SEQIDNO1KITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGV。0019或者，本发明提供的多肽可以是多聚体形式，其包含彼此之间由连接肽连接的N个示于SEQIDNO1的氨基酸序列，其中N为24，优选为2。0020优选地，所述连接肽为LLL。002。

16、1根据具体实施方案，所述多肽的氨基酸序列示于0022SEQIDNO2KITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGVLLLKITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGV；0023SEQIDNO3KITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGVLLLKITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGVLLLKITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGV；或0024SEQIDNO4KITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGVLLLKITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGVLLLKITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGVLLLKITPNNNGTYLLLGIMIGVLVGV。说明书CN10407259。

17、9A3/7页60025上述序列中加粗并带下划线的部分为连接肽。这些序列均可以由商业公司采用本领域中肽合成的常规方法制备获得。0026另一方面，本发明提供一种由所述多肽体外激活的树突状细胞，所述树突状细胞通过包括以下步骤的方法制备0027获取外周血单个核细胞，在含有GMCSF和IL4的培养基中培养，之后用所述多肽刺激，从而获得致敏的树突状细胞。0028具体而言，所述方法包括以下步骤00291获取外周血单个核细胞后，将单个核细胞置于容器中，静置使之形成两部分细胞，一部分贴附在容器壁上，一部分为悬浮细胞，分离其中的贴壁细胞；00302使步骤1中得到的贴壁细胞在含有GMCSF和IL4的LONZA无血清。

18、培养基中培养59天、优选7天后，与所述多肽共孵育210小时即可收获致敏的DC。0031在所述方法的步骤2中，所述培养基优选含有200800IU/ML、优选500IU/MLGMCSF和8001500IU/ML、优选1000IU/MLIL4；并且0032优选地，共孵育时，将所述多肽加入培养基中并使之浓度为50200G/ML，优选100G/ML。0033又一方面，本发明提供一种用于制备体外激活的树突状细胞的方法，所述方法包括以下步骤0034获取外周血单个核细胞，在含有GMCSF和IL4的培养基中培养，之后用所述多肽刺激，从而获得致敏的树突状细胞。0035具体而言，所述方法包括以下步骤00361获取外。

19、周血单个核细胞后，将单个核细胞置于容器中，静置使之形成两部分细胞，一部分贴附在容器壁上，一部分为悬浮细胞，分离其中的贴壁细胞；00372使步骤1中得到的贴壁细胞在含有GMCSF和IL4的LONZA无血清培养基中培养59天、优选7天后，与所述多肽共孵育210小时即可收获致敏的DC。0038所述方法的步骤2中，所述培养基优选含有200800IU/ML、优选500IU/MLGMCSF和8001500IU/ML、优选1000IU/MLIL4；并且0039优选地，共孵育时，将所述多肽加入培养基中并使之浓度为50200G/ML，优选100G/ML。0040又一方面，本发明提供一种用于治疗结肠癌的组合物，所。

20、述组合物包含所述树突状细胞，或者包含根据所述方法制得的树突状细胞。0041优选地，所述组合物还包含CIK细胞；0042其中优选地，所述树突状细胞通过包括以下步骤的方法制备0043获取外周血单个核细胞，在含有IFN的培养基培养，之后向培养基中加入抗人CD3抗体和IL2，培养获得CIK细胞。0044制备所述CIK细胞的方法包括以下步骤00451获取外周血单个核细胞后，将单个核细胞置于容器中，静置使之形成两部分细胞，一部分贴附在容器壁上，一部分为悬浮细胞，分离其中的悬浮细胞；00462使步骤1中得到的悬浮细胞在含有IFN的LONZA无血清培养基中培养1624小时、优选24小时后，加入抗CD3抗体，细。

21、胞每13天半量换液，换液时补充IL2，培说明书CN104072599A4/7页7养59天、优选7天。0047在所述方法的步骤2中，所述培养基优选含有500U/MLIFN，之后加入10NG/ML的抗CD3抗体，每23天换液，换液时补充300U/MLIL2；0048优选地，培养7天后，细胞浓度为110810个细胞/ML。0049优选地，所述组合物由所述树突状细胞和CIK细胞以1101100、优选110的细胞数比率混合后培养制得。0050还一方面，本发明还提供所述多肽和/或所述树突状细胞和/或根据本发明提供的方法制得的树突状细胞和/或所述组合物在制备用于治疗结肠癌的药物中的用途。0051本发明的其它。

22、方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。0052以下是对本发明的各个方面的更为详细的说明。0053一分离外周血单个核细胞PBMC0054外周血单个核细胞来源于自体或同种异体，细胞采集可以通过单采机，也可以通过外周静脉血管穿刺的方式获得。通常将血标本缓慢加入离心管中；水平离心后，吸取白膜层；洗涤后，计数细胞，调整细胞浓度在108/ML左右，放入10CM培养皿。0055二单个核细胞分离0056根据血细胞不同的生长方式，分离贴壁细胞，得到样本1；同时保留悬浮细胞，得到样本2。0057三抗原刺激DC0058经过长期和大量的研究工作，获得CEA的HLAA2/A3限制性CTL表位多肽S。

23、EQIDNO1，使用这一多肽或其多聚体致敏DC，获得的致敏DC能够高效地诱导保护性免疫反应。0059本文所述的多聚体是指二聚体至四聚体，其中二聚体为优选的。0060作为本发明的优选实施方案，所述的致敏DC制备方法如下0061获取外周血单个核细胞，贴壁培养，在贴壁细胞中加入细胞因子GMCSF和IL4，两种因子有利于促进DC的成熟及其状态维持；用SEQIDNO1所示氨基酸序列的单聚体或其经由连接肽连接的多聚体、优选二聚体多肽刺激，获得致敏DC。0062四CIK细胞培养0063CIK是体外应用抗CD3单抗刺激淋巴细胞产生的。CIK具有广谱的抗肿瘤作用。第0天在样本2中加入细胞因子IFN，置37、5C。

24、O2孵箱中培养24H后，添加抗CD3抗体和IL2继续培养；第7天收获并计数细胞。CIK细胞可以在体外通过流式细胞仪鉴定其表型，CD3CD56双阳性的CIK超过50才被认为具有杀伤活性。0064五DCCIK细胞混和培养0065成熟DC和CIK联合能够互相改变彼此的细胞表面分子，导致IL12的分泌，提高杀伤作用。在第8天将DC和CIK按110混匀，离心，弃上清，吹打混匀后，置二氧化碳培养箱37，5CO2中培养至第14天；半量换液离心收集细胞后，使用生理盐水制备成细胞悬液。0066本发明提供的抗原多肽可以在体外有效激活树突状细胞。实验证明，该抗原多肽激活的树突状细胞可以诱导T细胞中CEA特异性CTL。

25、的产生。0067此外，本发明还提供了天然的高效的激活T细胞双信号。DC是公认的体内功能最说明书CN104072599A5/7页8强的专职抗原提呈细胞，本发明选择抗原肽负载DC作为致敏原，提供最接近人体免疫应答过程中的MHC多肽复合物结构，为T细胞活化提供特异性信号。DC同时表达丰富的共刺激分子，为T细胞活化提供天然的第二信号。另外，联合CIK的广谱抗肿瘤作用，使得DCCIK成为一种新型的肿瘤治疗手段。0068实验证明，本发明提供的包含致敏DC和CIK的细胞组合物可以杀灭肿瘤细胞，因此致敏DC以及CIK可以联合用于治疗癌症或制备治疗癌症的药物，特别可应用于治疗结肠癌。从外周血中获取单个核细胞后，。

26、分别制备致敏DC以及CIK，回输给患者，可以缓解或治疗结肠癌。附图说明0069以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中0070图1显示了本发明的细胞组合物DCCIK对三种细胞的杀伤作用，其中靶细胞1为COLO205，靶细胞2为K562NK敏感细胞株，靶细胞3为自体PBMC，作为阴性对照。效靶比分别为101和301。具体实施方式0071以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。0072下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。0073。

27、实施例中采用的序列由深圳翰宇药业股份有限公司合成；LONZA无血清培养基购自LONZAINCXVIVO15O4418Q；血标本来自志愿者供血；MTS溶液购自PROMEGACORPORATION,CATG3582。0074实施例1成熟DC的制备0075本实施例采用氨基酸序列示于SEQIDNO1和SEQIDNO2的多肽来体外激活树突状细胞。0076一分离外周血单个核细胞PBMC0077将血标本缓慢加入离心管中；水平离心后，吸取白膜层；洗涤后，计数细胞，使用LONZA无血清培养基调整细胞浓度在108个细胞/ML左右，放入10CM培养皿，后置二氧化碳培养箱37；5CO2中培养。0078二单核细胞分离和。

28、抗原刺激DC0079分离并获得贴壁细胞，向LONZA无血清培养基中添加细胞因子GMCSF终浓度500IU/ML和IL4终浓度1000IU/ML，然后置二氧化碳培养箱37；5CO2中培养。0080培养第7天，向培养基中加入不同终浓度的多肽见下表2，共孵育210小时。0081三收获DC0082收获DC后，计数细胞并检测其成熟情况。采用氨基酸序列示于SEQIDNO2的多肽的激活结果见下表1和表2。表型测定方法参见免疫学技术及其应用第二章第三节“树突状细胞表型和功能检测”，对照细胞未成熟DC为未使用细胞因子刺激的贴壁细胞，采用025胰酶消化细胞后洗涤并收集细胞备用。说明书CN104072599A6/7。

29、页90083表1采用SEQIDNO2的多肽体外激活的DC的表型测定结果0084表型分子未成熟DC体外激活的DCCD807424329182CD83392015585CD864542564602270085P0050086不同浓度的抗原多肽对DC成熟的影响见下表2。0087表2不同浓度的SEQIDNO2的多肽对体外激活DC的影响0088多肽浓度G/MLCD80CD83CD86074243920454256502521411236747020210032918215585460227200331179185444501800089与0G/ML比较P0050090另外，实验发现，采用氨基酸序列示于S。

30、EQIDNO1的多肽单体与上述采用氨基酸序列示于SEQIDNO2的多肽二聚体在DC致敏效果方面的差别无统计学意义。0091激活的DC将递呈抗原，激活CD8T细胞，使之成为特异性的细胞毒性T淋巴细胞CTL。将本发明激活的DC与自体T细胞按120的比率混合培养7天后，用四聚体实验参见WJOOSTLESTERHUIS,GERTYSCHREIBELT,NICOLEMSCHARENBORG等人WILDTYPEANDMODIEDGP100PEPTIDEPULSEDDENDRITICCELLVACCINATIONOFADVANCEDMELANOMAPATIENTSCANLEADTOLONGTERMCLINI。

31、CALRESPONSESINDEPENDENTOFTHEPEPTIDEUSEDCANCERIMMUNOLIMMUNOTHER201160249260检测T细胞中CEA特异性CD8T细胞的比例，三次检测结果显示，与未刺激T细胞阴性对照组即培养基自体T细胞培养组比较，特异性CTL的比例由001分别上升至47、53和48。因此，证明本发明的抗原多肽激活的DC可以诱导T细胞中CEA特异性CTL的产生。0092实施例2组合物DCCIK的制备0093本实施例采用实施例1制得的成熟DC与CIK混合制备细胞组合物。0094一分离外周血单个核细胞PBMC0095同实施例1的步骤一。0096二单个核细胞分离和抗原。

32、刺激DC0097分离并获得贴壁细胞，得到样本1；同时保留悬浮细胞，得到样本2，计数样本2细说明书CN104072599A7/7页10胞备用。0098采用实施例1的步骤二制备成熟DC。0099三CIK细胞培养0100第0天在样本2通常为107108个细胞/ML的LONZA无血清培养基中加入细胞因子IFN500U/ML，置二氧化碳培养箱37；5CO2培养24H后，添加抗CD3抗体终浓度10NG/ML，每23天换液，换液时补充300U/MLIL2；第7天收获并计数细胞。0101四DCCIK混和培养0102第8天将成熟DC和CIK按110细胞数混匀，离心，弃上清，吹打混匀后，置二氧化碳培养箱37；5C。

33、O2中培养至第14天；半量换液离心收集细胞后，使用生理盐水制备成细胞悬液。0103实施例3DCCIK对肿瘤细胞的杀伤作用0104本实施例采用实施例2制备的组合物与不同靶细胞混合，通过MTS法检测CTL杀伤活性。0105靶细胞1为COLO205，靶细胞2为K562NK敏感细胞株，靶细胞3为自体PBMC，作为阴性对照细胞。0106实施例2制备的细胞组合物DCCIK经历14天左右的培养周期后，DC完成APC作用，多降解消失，培养基中绝大多数是激活的CIK细胞。计数CIK细胞数。将制备的DCCIK分别与上述3种靶细胞混合，采用下述MTS法检测CTL杀伤活性01071使用LONZA无血清培养基调整靶细胞。

34、的细胞密度为105个细胞/ML，并按照100L/孔的细胞量接种到96孔培养板中，同时设立空白对照LONZA无血清培养基和阴性对照不加入DCCIK；01082根据效靶比效应细胞/靶细胞101和301的比例添加DCCIK细胞效应细胞数量按CIK细胞数计，37下共孵育6小时后，离心后弃去培养基，每孔添加100LLONZA无血清培养基；01093每孔加入MTS溶液20L，于37，5CO2条件下避光培养14小时；01104采用酶标仪在波长490NM处测定吸光度，记录测定结果；01115计算不同效靶比的靶细胞存活率并作图，其中存活率为DCCIK杀伤后肿瘤细胞数与不使用DCCIK时阴性对照靶细胞数的比值。0112结果显示，本发明制备的DCCIK对COLO205和K562细胞均有明显的杀伤作用，与对照组比较，差别具有统计学意义P005，具体结果见图1。0113以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。说明书CN104072599A101/3页1100010002序列表CN104072599A112/3页120003序列表CN104072599A123/3页13序列表CN104072599A131/1页14图1说明书附图CN104072599A14。