抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列及其重组载体与应用.pdf

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以抑制I型糖尿病特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。本发明将构建的重组载体转染小鼠T淋巴细胞，可影响Th1/Th2细胞因子的分泌，在糖尿病前期的胰岛炎中起重要作用，阻止I型糖尿病的进程。本发明为I型糖尿病的治疗提供了新的手段。

1.  一种抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列，其RNA序列如SEQ ID NO:3或4所示。

2.  一种含有如权利要求1所述的抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列的重组载体。

3.  根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，该重组载体采用GFP标记的U6启动子的质粒载体pGenesil－1。

4.  根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，构建方法如下：
A、合成CCR5-shRNA-1片段：
选择合适的酶切位点BamH I和EcoR I，根据靶序列序列，设计其shRNA序列如下，
正义链如SEQ ID NO:3所示；
反义链如SEQ ID NO:4所示；
B、构建到真核表达载体pGenesil－1siRNA，获得pGenesil－1-CCR5-shRNA1重组表达载体。

5.  一种抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。

6.  一种如权利要求2至4任一所述的重组载体在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。

抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列及其重组载体与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种可以抑制I型糖尿病特异性相关基因表达的干扰序列及其重组载体，以及在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。
背景技术
在机体的免疫反应和疾病的发生发展过程中，一类免疫调节因子系统-趋化因子及其受体起着重要的作用。趋化因子通过与细胞表面的受体结合而产生效应，其特异性受体属于7次跨膜结构域G蛋白偶联受体(GPCRS)目前已发现近20种。趋化因子及其受体参与广泛的病理、生理过程。
趋化因子受体5(CC-cheokine receptor5，CCR5)是CC亚族趋化因子的特异性受体。CCR5基因位于3p21.3上，长1.9kb,编码352个氨基酸，具有G蛋白偶联受体家族(G－protein coupled receptors，GPCRs)所特有的七个跨膜区(transmembrine domains，TM)，呈α螺旋。自1996年人们克隆该基因并发现CCR5可以作为HIV的共受体(coreceptor)参与HIV的感染，CCR5就引起人们极大的兴趣并一直是科学研究的热点之一，后来又陆续发现在一些自身免疫性疾病如类风湿关节炎，多发性硬化、恶性肿瘤等的病程中CCR5可能起着关键作用。
I型糖尿病(type1diabetes mellitus，T1DM)是一种严重威胁人类健康的常见代谢性疾病，I型糖尿病患者大约占总糖尿病患者的5％－10％。目前认为I型糖尿病是T细胞介导的自身免疫性疾病，具体机制尚不清楚。遗传学的研究发现NOD鼠的致病基因位于11号染色体上一个叫idd4的区域，而该区域恰恰也是CC亚家族基因所在位点。有人研究了Th1细胞和Th2细胞膜表面分子后指出，CCR5可以认为是Th1细胞特异的表面标志之一(Loetscher P,Uguccioni M,Bordoli L,et al.CCR5is characteristic of Th1lymphocytes.[J]Nature,1998,391(6665):344-345)。而目前公认Th1细胞分泌的多种细胞因子(IL-2、INF-γ)可加重胰岛炎症反应；而Th2细胞分泌的细胞因子(IL-4、IL-6、IL-10) 则是I型糖尿病的保护因素。2000年Cameron等人研究发现，CCR5mRNA在糖尿病NOD小鼠的脾脏和胰腺中均有表达，且MIP-1α表达明显上升；用IL-4治疗后小鼠MIP-1α和CCR5的表达下调。表明CCR5与MIP-1α参与了I型糖尿病的病理过程。此外有报道称CCR5-delta32突变的人群的I型糖尿病的发病率降低,或者发病时间推迟，但亦有报道称CCR5-delta32突变与TIDM的发病无关。(Maier-Moore J S,C A,Tobón G,et al.The CCR5delta32polymorphism(rs333)is not associated withsyndrome or Type1Diabetes in Colombians.Clin Immunol.2013；148(2):206-8.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列(SiRNA、ShRNA)，并构建含有I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列的重组载体。本发明的另一目的是提供该干扰序列和重组载体在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。
本发明人研究发现：
一、在糖尿病NOD鼠T细胞CCR5的阳性率为10.46％，高于糖尿病前NOD鼠4.9％(p<0.05)，见图1。
二、RNAi抑制CCR5后T细胞分泌的细胞因子向Th2方向偏移，提示CCR5可以直接调节T细胞细胞因子的分泌和Th1/Th2平衡即GFP+细胞IL－2、IFN－γ和IL－4分别为6.13±1.02ng/ml、8.45±1.09ng/ml和1.23±0.25ng/ml,GFP－细胞IL－2、IFN－γ和IL－4分别为10.95±1.24ng/ml、0.40±0.08ng/ml和14.38±0.87ng/ml(n＝4,p<0.05)即抑制CCR5使得T细胞分泌IL－2、IFN－γ减少而IL－4分泌增加，见图8。
三、RNAi抑制CCR5后T细胞的细胞周期无明显变化，见图7。
四、通过NOD.scid鼠过继实验，实验表明RNAi抑制CCR5后的T细胞在过继5周后血糖值为7.2±1.2mmol/l,明显低于对照组10.7±1.8mmol/l(p<0.05)和空载体组11.2±2.1mmol/l(p<0.05)；10周后血糖值为12.3±2.9mmol/l，明显低于对照组18.8±3.4mmol/l(p<0.05)和空载体组19.7±3.1mmol/l，(p<0.05)。RNAi抑制CCR5后的T细胞在过继1周后,胰岛炎评分为0.31±0.46(n＝90,p<0.01),显著低于对照组1.56±0.15，和空载体组1.428±0.04，表明CCR5RNAi后抑制T细胞早期趋化至胰岛，说明其在糖尿病前期 的胰岛炎中起重要作用，见图9、表1。
本发明人的研究发现表明，CCR5可能主要通过影响Th1/Th2细胞因子的分泌和参与早期的胰岛炎而影响I型糖尿病的进程，CCR5可能作为I型糖尿病潜在的治疗靶点。
基于以上研究，本发明人设想在I型糖尿病早期应用针对CCR5的ShRNA(慢病毒载体或腺相关病毒构建的CCR5-ShRNA以及直接合成的CCR5RNAi片段)，下调CCR5的表达，从而达到减缓I型糖尿病进程的目的。
本发明的第一方面，是提供一种抑制I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列(SiRNA、ShRNA)。
本发明设计针对hCCR5(GenBank Accession No.U57840)为靶点设计RNAi，靶序列分别为
1.GAGCGTGACTGATATCTAC(186-204)(SEQ ID NO:1)
2.AGCTTCATAAGGCGCATGC(390-408)(SEQ ID NO:2)
针对上述靶点，本发明设计、合成并筛选SiRNA，选择LOOP连接成短发夹ShRNA。
CCR5－shRNA－1
5’-GATCCGAGCGTGACTGATATCTACTTCAAGACGGTAGATATCAGTCACGCTCTTTTTTGTCGACA-3’(SEQ ID NO:3)
3’-GCTCGCACTGACTATAGATGAAGTTCTGCCATCTATAGTCAGTGCGAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’(SEQ ID NO:4)
转录合成的ShRNA：

CCR5－shRNA－2
5’-GATCCGAGCTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGCTCTTTTTTGTCGACA-3’(SEQ ID NO:5)
3’-GCTCGAAGTATTCCGCGTACGAAGTTCTGCCGTACGCGGAATACTTCGAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’(SEQ ID NO:6)
转录合成的ShRNA：

CCR5特异性的高效干扰序列shRNA1～2，分别转染进入小鼠脾脏T细胞，结果发现CCR5－shRNA－1抑制CCR5表达的干扰效果最佳，见图5。
本发明的第二方面，是提供一种构建含有上述的I型糖尿病CCR5基因表达的干扰序列的重组载体，该重组载体采用GFP标记的U6启动子的质粒载体pGenesil－1，由武汉晶赛公司提供，见图2。
构建方法如下：
1.合成CCR5-shRNA-1片段：
选择合适的酶切位点BamH I和EcoR I，根据靶序列序列，设计其shRNA序列1如下，
正义链
5’-GATCCGAGCGTGACTGATATCTACTTCAAGACGGTAGATATCAGTCACGCTCTTTTTTGTCGACA-3’(SEQ ID NO:3)
反义链
3’-GCTCGCACTGACTATAGATGAAGTTCTGCCATCTATAGTCAGTGCGAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’(SEQ ID NO:4)
2.构建到真核表达载体pGenesil－1siRNA，获得pGenesil－1-CCR5-shRNA1重组表达载体。
该载体启动子为鼠源的U6启动子，属于RNA聚合酶III启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达，通过添加一串(3到6个)U来终止转录。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。
本发明的第三方面，是提供了该干扰序列和重组载体在制备治疗I型糖尿病药物中的应用。
本发明将构建的重组载体转染小鼠T淋巴细胞，可影响Th1/Th2细胞因子的分泌，从而阻止I型糖尿病的进程。
一、体外实验：
方法：将pGenesil－1-CCR5-shRNA1用DEAE－dextran转染到糖尿病NOD鼠T细胞，应用流式细胞仪检测CCR5的表达，确定干扰效果；利用流式细胞仪将转染与未转染质粒的T细胞分选、收集，分别用RT－PCR方法检测CCR5 mRNA，进一步确定干扰效果，PI标记流式细胞仪检测细胞周期；ELISA检测细胞因子IL－2、IFN－γ和IL－4的含量；
结果：DEAE-dextran法转染CCR5－shRNA-1后(见图3)，流式细胞仪检测下调CCR5表达77％(见图4)，而对照两条质粒均无作用；流式细胞仪分选GFP+和GFP－细胞的纯度达到95％以上，RT－PCR亦证明CCR5－shRNA-1质粒可显著降低CCR5mRNA的表达(见图5、6)；流式细胞仪分析表明，抑制CCR5对T细胞细胞周期无明显影响(见图7)；ELISA检测发现可以改变Th1/Th2细胞因子的分泌：GFP+细胞IL－2、IFN－γ和IL－4分别为6.13±1.02ng/ml、8.45±1.09ng/ml和1.23±0.25ng/ml,GFP－细胞IL－2、IFN－γ和IL－4分别为10.95±1.24ng/ml、0.40±0.08ng/ml和14.38±0.87ng/ml(n＝4,p<0.05)即抑制CCR5使得T细胞分泌IL－2、IFN－γ减少而IL－4分泌增加；(见图8)。
二、体内试验：
方法：雌性NOD.Scid小鼠，30只，8-10周龄,血糖5.6±0.8mmol/l；购自中国科学院上海实验动物中心。NOD.scid小鼠随机分成三组(10，10，10)，将转染有CCR5－shRNA-1糖尿病NOD鼠T细胞，转染有pGenesil－1空载体糖尿病NOD鼠T细胞，及未处理的的糖尿病NOD鼠T细胞分别过继给NOD.Scid鼠，即RNAi组、空载体组、对照组，各组小鼠分别做标记并测基础体重、血糖(1-10周)。过继1周后，取胰岛，做组织切片，进行胰岛炎评分。
结果：分别记录各组过继后1－10周的血糖值，发现第五周对照组的血糖为10.7±2.1mmol/l,空载体组11.2±1.3mmol/l和RNAi组7.2±1.1mmol/l，至第10周各组血糖分别为对照组18.8±3.1mmol/l、空载体组19.7±2.4mmol/l和RNAi组12.3±2.1mmol/l；RNAi组明显低于其他2两组(见图9)。RNAi抑制CCR5后的T细胞在过继1周后，胰岛炎评分为0.31±0.46(n＝90,p<0.01),显著低于对照组1.56±0.15，和空载体组1.42±0.04，(见表1)表明CCR5RNAi后抑制T细胞早期趋化至胰岛，说明其在糖尿病前期的胰岛炎中起重要作用。
本发明为I型糖尿病的治疗提供了新的手段。
附图说明
图1：CCR5在糖尿病NOD鼠和糖尿病前NOD鼠的阳性率。
图2：GFP标记的U6启动子的质粒载体pGenesil－1-CCR5-shRNA重组质粒及插入酶切位点示意图。
图3：pGenesil－1-CCR5－shRNA-1质粒转染的T细胞
图4：流式细胞术筛选CCR5特异性干扰序列shRNA1-2最佳干扰效果，其中A为CCR5－shRNA－1；B为CCR5－shRNA－2；C为阴性对照质粒。
图5：CCR5特异性干扰序列shRNA1-2最佳干扰效果的筛选。
图6：RT-PCR进一步验证CCR5特异性干扰序列shRNA1-2的干扰效果。
图7：pGenesil－1-CCR5－shRNA-1质粒转染对T细胞细胞周期的影响，其中A为转染CCR5－shRNA－1质粒T细胞周期；B为未转染CCR5－shRNA－1质粒的T细胞周期。
图8：pGenesil－1-CCR5－shRNA-1质粒转染对T细胞细胞因子分泌的影响。
图9：转染pGenesil－1-CCR5－shRNA－1、空载体pGenesil－1的T细胞和对照T细胞过继NOD.scid鼠1-10周血糖的变化情况。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1：构建pGenesil－1-CCR5-shRNA1真核表达载体
1.1所需试剂
限制性内切酶BamH I和EcoR I及相应Buffer、T4连接酶及其缓冲液、PCR产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒均购于TaKaRa公司(大连宝生物工程有限公司)。真核表达载体选择常规RNAi载体
1.2设计、合成并筛选CCR5的特异性shRNA。
本实验选用的是武汉晶赛公司提供的pGenesil－1siRNA表达载体来产生shRNA，该载体启动子为鼠源的U6启动子，属于RNA聚合酶III启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)在哺乳动物细胞中的表达，通过添加一串(3到6个)U来终止转录。shRNA在细胞内会自动被加工成为siRNA，从而引发基因沉默或者表达抑制。
Human CC chemokine receptor5mRNA,complete cds(GenBank AccessionNo.U57840)序列如SEQ ID NO:7所示。
根据上述序列设计并合成特异性shRNA1-2(均由武汉晶赛公司完成)， RNAi的靶序列如下：

1.3真核表达载体pGenesil－1-CCR5－shRNA－1和pGenesil－1-CCR5－shRNA－2及阴性对照质粒的构建
具体流程：将1.3中CCR5-shRNA1-2的两条核苷酸链经常规退火程序(等体积混合两核苷酸链，95℃2min后在45min内冷却至25℃)后直接放入4℃保存。用BamH I和EcoR I内切酶，分别酶切以上退火产物和载体pGenesil－1(37℃过夜)。酶切产物经电泳区分条带，用胶回收试剂盒回收正确的DNA片段，然后以基因片段与载体片段摩尔比约3:1进行连接反应。反应体系(10μl)：T4连接酶缓冲液1μl，载体片段50ng，基因片段20ng，T4连接酶1μl，余用去离子水补足。16℃连接过夜后，取5μl连接产物置于80-100μl的Top10感受态细菌中，冰浴30min，42℃热休克90s，二次冰浴5min，加入LB培养基1000μl，37℃摇床上培养30min-1h(150rpm)，5000rpm离心5min，弃掉1000μl上清，将菌体均匀涂布于50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃倒置培养18h。从转化的平板中挑去若干独立菌落接种于3ml含相应抗性的LB培养基中，37℃震摇(150rpm)12-16h后送晶赛公司测序。经测序鉴定，获得pGenesil－1-CCR5－shRNA－1和pGenesil－1-CCR5－shRNA－2及阴性对照重组质粒，终浓度为1.5μg/μl。
实施例2：体外细胞试验
2.1pGenesil－1-CCR5－shRNA－1抑制效果的鉴定
将pGenesil－1-CCR5－shRNA－1和pGenesil－1-CCR5－shRNA－2及阴性对照重组质粒分别用200μg/ml DEAE-dextran转染小鼠脾脏T细胞，作用时间90分钟，T细胞数目约在10⁷左右。转染48小时后分别用流式细胞仪和RT-PCR检测CCR5的表达，从图2中看出，siRNA1可以将CCR5的表达抑制掉70％以上；siRNA2仅将CCR5的表达抑制掉20％左右；因此本发明从中筛选出干扰效果最好，即抑制CCR5表达效果最显著的pGenesil－1-CCR5－ shRNA－1。
2.2T细胞pGenesil－1-CCR5－shRNA－1抑制CCR5表达后细胞周期的检测
上述无菌条件下收集的转染10μg CCR5－shRNA－1质粒的GFP⁺T细胞及未转染的GFP－T细胞同时上流式细胞仪检测细胞周期，结果GFP⁺T细胞与GFP－T细胞相比较，G1、G2、S期细胞的比例没有明显差别，分别为84.12±4.12％、13.23±2.01％、2.65±0.36％，和82.01±5.01％、15.23±1.23％、2.76±0.54％(n＝4，P>0.05)。说明转染CCR5－shRNA－1质粒虽然可下调CCR5的表达，却不会对T细胞的细胞周期产生明显影响。
2.3转染pGenesil－1-CCR5－shRNA－1质粒对T细胞分泌细胞因子的影响
分别取上述分选的GFP⁺及GFP－T细胞各1×10⁶，置于96孔板，用10μg/mlConA刺激48h后，利用双抗体夹心ELISA法检测培养基上清中Th1和Th2细胞因子：IL－2，IL－4，IFN－γ的含量，结果发现GFP⁺T细胞与GFP－T细胞相比较IL－2(6.13±1.02ng/ml，10.95±1.24ng/ml，n＝4,P<0.05)、IFN－γ(8.45±1.09ng/ml,14.38±0.87ng/ml,n＝4,P<0.05)分泌减少而IL－4(1.23±0.25ng/ml，0.40±0.08ng/ml，n＝4,P<0.05)的量增加。说明CCR5的下调的同时也使Th1细胞因子分泌减少，而Th2细胞因子分泌增加。目前已经公认Th细胞因子在1型糖尿病中的作用，普遍认为Th1细胞因子可以促进1型糖尿病的发生、发展，而Th2细胞因子则有保护作用。表明CCR5可能通过影响细胞因子的分泌来参与1型糖尿病的进程。
实施例3：动物实验
将转染pGenesil－1-CCR5－shRNA－1和空载体pGenesil－1的T细胞利用流式细胞仪分选收集GFP阳性细胞，并以未处理的T细胞为空白对照，腹腔注射200μl PBS悬液约含1×10⁶上述各组T细胞过继NOD.scid鼠，各组NOD.scid鼠血糖变化情况，组织切片观察胰岛炎情况，。结果发现发现第五周对照组的血糖为10.7±2.1mmol/l,空载体组9.8±1.3mmol/l和RNAi组5.2±1.1mmol/l，至第10周各组血糖分别为对照组18.8±3.1mmol/l、空载体组19.7±2.4mmol/l和RNAi组9.3±2.1mmol/l；RNAi组明显低于其他2两组。过继T细胞1周后发现，CCR5RNAi T细胞组NOD.scid鼠的胰岛炎程度较轻和范围较小，胰岛炎评分为0.31±0.03，,明显低于另外对照组组1.56±0.15，空载体组1.42±0.04(n＝90，P<0.01)；上述结果表明RNAi抑制CCR5后，T 细胞迁移到胰岛并引起胰岛炎的能力明显下降。胰岛炎的发生延迟，最终可能会延迟或阻止糖尿病的发生，与我们观察到的CCR5RNAi后T细胞组NOD.scid鼠发病情况一致。
表1：转染pGenesil－1-CCR5－shRNA－1、空载体pGenesil－1的T细胞和对照T细胞过继NOD.scid鼠1周后胰岛炎的评分

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。