诊断和区分中风的方法 【发明背景】
本发明涉及诊断受治疗者是否患有中风，以及区分中风患者中风的类型的方法。更具体地，该方法包括分析受治疗者体液中的至少四种选择的中风标志。本发明还描述了本方法使用的诊断装置和试剂盒。
当考虑到其致命性时，中风对人类健康的损害非常大，当考虑到其致残性时，损害更大。例如，中风是美国成人致死的第三大原因，仅次于缺血性心脏病和各种类型的癌症。对于幸存者，中风是致残的主要原因。中风带来的直接医疗费用和失业费用每年高达数十亿美元。大约85％的中风是缺血性的(血栓性的和栓子性的)，其余为出血性的。
对治疗学和诊断技术而言，中风都是一个未充分开发的市场。仅美国每年就有超过700000人患中风。多倍于上述数目的人在诊断学上被怀疑患有中风，仅通过包括计算机辅助X线断层摄影仪(CAT)扫描和磁共振成像(MRI)地昂贵技术来证实。然而，这些复杂的技术不是在所有的医院中都能够得到的，并且它们对缺血性中风的早期诊断还不够灵敏。
中风是由神经病学家做出的临床诊断，通常是会诊。目前诊断中风的方法包括症状评估、病史、胸部X射线、心电图(ECG，与电有关的心脏活动)、脑电图(EEG，大脑神经细胞活动)、CAT扫描用来评估脑损伤以及MRI用来获取体内图象。很多血液检验用来检查体内出血，包括全血细胞计数、凝血酶原时间、部分促凝血酶原激酶时间、血清电解质和血糖。
确定中风的直接原因很困难，尤其当发病在主要依赖于成像技术诊断的部位时。大约50％的脑梗塞不能由CAT扫描看到。另外，尽管CAT扫描对出血性中风的鉴别很灵敏，但它在中风评估中对脑缺血不十分灵敏，通常在中风发作后24到36小时的时候呈阳性。结果，当现有的诊断技术确诊中风时，迅速治疗的机会已经丧失。
中风的治疗包括预防性治疗如抗高血压和抗血小板药物，该药物控制和降低血压并因此减少中风的可能。溶解血栓的药物如t-PA(组织纤溶酶原激活剂)的发展在对缺血性中风患者的治疗中也提供了显著的进步，但是，为了有效治疗并使急性中风的危害降低到最小，必须近早地开始治疗，例如，在症状出现后约三小时内开始治疗。这些药物溶解血管凝块，该凝块阻塞血液流向大脑，是引起大约80％的中风的原因。然而，这些药物也带来增大出血危险的副作用。多种神经保护剂如钙通道拮抗剂可以阻止缺血性发作对大脑造成的损伤。这些药物的治疗范围典型地宽于那些血块溶解剂，且它们不会增大出血的危险。
针对中风的早期诊断和中风类型鉴别的诊断技术需要使医生在大脑患病早期开出适当的治疗药物。中风的多种标志是已知的，用来确定这些标志的分析技术已经在本领域描述过。此处所用的术语“标志”指的是在脑缺血或出血过程中从大脑释放的蛋白或其它分子。这些标志包括大脑特有的蛋白的同种型。
文献报道，脑脊液(CSF)中髓磷脂碱性蛋白(MBP)浓度在脑组织充分损伤、脑外伤和AIDS痴呆后升高。另外，还报道，使用抗-MBP抗体的超微结构免疫细胞化学研究显示MBP仅局限于髓鞘。因此，建议将CSF或血清中的MBP水平用作急性脑血管疾病中脑损伤的标志。参见Strand，T.等的“脊髓液中大脑和血浆蛋白作为大脑损伤和中风严重程度的标志”(Brain and plasma proteins in spinal fluid as markersfor brain damage and severity of strokel)，中风(Stroke)(1984)15；138-144。CSF中MBP浓度的升高在血栓性中风发生后的约四到五天最为明显，而在脑出血中，该升高在发生后几乎立即达到最高。参见Garcia-Alex，A.等“神经元特异性烯醇酶和髓磷脂碱性蛋白：窒息的足月婴儿的脑髓液浓度和神经病症的关系”(Neuron-specific enolase and myelin basicprotein：Relationship of cerebrospinal fluid concentration to the neurologiccondition of asphyxiated full-term infants)，儿科学(Pediatrics)(1994)93；234-240。人们还发现，患有短暂性缺血性发作(TIA)的病人具有正常的对应于MBP的CSF值，而那些患有脑梗塞和脑出血的病人则具有升高的值。在脑梗塞中，CSF中的MBP浓度从第一次到第二次腰椎穿刺有显著升高，而患有脑内出血的病人则在第一次腰椎穿刺时已显著升高。据报道，MBP释放的动力学差异可用于出血性和缺血性中风的鉴别诊断中。CSF中的MBP水平也与CT扫描中脑损害的可见度并与病人的短期结果相关。另外，MBP的浓度随脑损害程度升高，高值表示对病人不良的短期预后。参见上述Strand，T.等的文献。
S100蛋白是另一种用于评估神经损伤和确定大脑损伤程度以及确定大脑损害程度的标志。因此，建议在诊断和评估由中风引起的大脑损害和神经损伤中将其用作辅剂。参见Misser，U.、Weismman，M.、Friedrich，C.和Kaps，M.的“血液中的S100蛋白和神经元特异性烯醇酶浓度在急性缺血性中风中作为血栓体积和预后的指示剂”(S100 proteinand neuron-specific enolase concentrations in blood as indicators ofinfarction volume and prognosis in acute ischemic stroke)，中风(Stroke)(1997)28；1956-60。
在中风的研究中，神经元特异性烯醇酶(NES)也被建议作为神经损伤的有用的标志，特别应用于治疗和评估中。参见Teasdale，G.和Jennett，B的“昏迷和受损害的意识的评估”(Assessment of coma andimpaired consciousness)，柳叶刀(Lancet)(1974)2；81-84。
仍然需要那些可以及时提供关于病人所患中风的类型、发病的开始、疾病的位置、对适合的病人(受益于用适当药物的治疗)的鉴别和对因治疗带来出血危险的病人的鉴别的信息的诊断技术。这些技术可以提供数据使医生快速确定病人所需的适当治疗，并允许及早介入。
因此，本发明的一个目的在于提供一种迅速诊断和区分中风的方法。
本发明的另一个目的在于提供一种区分血栓性中风和出血性中风的方法。
本发明的另一个目的在于提供一种包括分析病人体液的至少四种中风标志的方法。
本发明的另一个目的在于提供一种可提供关于中风发作时间的信息的方法。
本发明的另一个目的在于提供一种用于该方法的诊断测定装置。
发明概述
根据本发明，通过提供一种能够确定病人是否患有中风以及当该病人患有中风时，确定其病症是血栓性的还是出血性的方法，来实现这些和其它目的和优点。根据该方法，分析病人体液的四种细胞类型特异性的分子，其中三个是特异性的缺血性标志，即S100蛋白、髓磷脂碱性蛋白(MBP)和神经元特异性烯醇酶(NSE)，以及一种大脑内皮膜蛋白，例如，凝血调节蛋白(Tm)。该方法分析了大脑特有的标志蛋白的同种型。
这些标志的分析可以在相同的体液样本上进行，也可以在不同的体液样本上进行。在后面的实施方案中，不同的体液样本可以同时采集，也可以在不同时间段采集。
根据本发明的方法得到的信息可以在中风紧要的早期阶段提供，例如在症状出现后3到6小时内提供，因为病人体液的分析可以在体液采集后约45到50分钟内进行。这些数据对医生极端重要，它们可以协助医生确定如何治疗呈现中风症状或怀疑患有中风的病人。这些数据可以确定是否中风，并区别缺血性和出血性中风，从而将出血性中风病人排除在给以溶栓治疗之外，因为这种治疗增大了出血的危险。这些数据还可以鉴别因治疗导致出血危险的病人，即具有妥协性的大脑脉管系统的病人。另外，本方法可以在早期提供有关于可以提高病人对适当的治疗法和干预的选择的干预结果的预后信息。本发明的方法可以在成像技术之前很好地用于诊断。另外，这些数据可以指示中风在大脑中的位置和对大脑损伤的程度，以及确定中风的程度是否增加。伴随有中风的脑梗塞造成死亡和脑组织死亡，这是因为在缺血发生后的急性发作阶段供氧不足普遍增加造成的。通过测量不同时间点采集的体液样本中的标志，可以确定中风的进展。
附图的简要说明
现在，就不同的优选实施方案，结合附图进一步详细地描述本发明，其中：
图1是指示大脑病症或状态的两种标志蛋白的浓度-时间(分钟)图。
图2是说明如何将根据本发明的一个实施方案获得的数据用于大脑病症或状态的诊断的流程图。
图3-10是根据本发明的一个实施方案分析四种标志蛋白的浓度-时间(天)图。
优选实施方案的描述
根据本发明的方法分析的标志被释放到循环系统，并出现在血液和其它体液中。根据本发明，优选分析血液或任何包括例如血浆、血清、细胞溶解的血液(例如，经低渗性缓冲液或去污剂处理)和稀释的血液产物以及其制品。在另一优选实施方案中测量CSF中标志的浓度。
此处所用的术语“在正常之上”和“在阈值之上”是指标志的水平大于在正常个体(也就是那些没有患大脑疾病，即出血性、机械性或感染性大脑损伤的个体)中观察到的标志的水平。对于一些标志，正常出现在个体中的水平为零或极小，而根据本发明分析的其它标志可以以可检测的水平正常出现在血液中，因此，这些术语表示一个水平，它显著地高于在个体中发现的正常水平。术语“显著地”是指统计学意义上的显著，通常指出现高于正常或更高的标志浓度的两个标准偏差(SD)。用于分析任何特殊标志蛋白的测定方法必须灵敏到能检测在目的浓度范围之内的标志的水平，而且必须高度特异。
根据本方法测量的四种主要的标志是在大脑疾病中受损的特定的大脑细胞释放的蛋白。这些蛋白可以是其天然形式，也可以是免疫学可检测的蛋白片段，例如，通过酶的作用由蛋白水解得到的免疫学可检测的蛋白片段。在本申请包括权利要求书中提到的这四种主要的特定标志意味着包括可免疫学检测的蛋白片段。“免疫学可检测”是指蛋白片段包含被关连抗体特异性识别的表位。
如前所提及的，根据本发明分析的标志具有细胞类型特异性。髓磷脂碱性蛋白(MBP)是强碱性蛋白，位于髓鞘中，占人脑中髓磷脂蛋白总量的约30％。这种蛋白以170个氨基酸残基的多肽单链形式存在，该链具有棒状结构，大小为1.5×150nm，分子量约为18500道尔顿。它是柔性蛋白，以缺乏α螺旋β构象的无规卷曲形式存在。
血液和CSF中MBP浓度的升高在缺血性中风发作后的约4到5天最为明显，而在脑出血中，该升高在发作后几乎立即升到最高值。另外，患有TIA的病人具有正常的MBP值，而那些患有脑梗塞和脑内出血的病人则具有升高的值。对于未患大脑疾病的人来说，其正常值为0.00到约0.016ng/mL。MBP在血清中具有大约1小时的半衰期，是用于大脑出血的灵敏的标志。
S100蛋白是细胞质酸性钙结合蛋白，绝大多数发现于大脑的灰质中，主要在神经胶质和神经膜细胞中。这种蛋白以多个包含两种免疫学不同的亚基即α(MW＝10400道尔顿)和β(MW＝10500道尔顿)的同-或异二聚体的同种型形式存在。S100a σ是同二聚体αα，主要发现于横纹肌、心脏和肾，而S100b同种型是21000道尔顿的同二聚体ββ，以高浓度出现于神经胶质细胞和神经膜细胞中，从而具有组织特异性。它在中枢神经系统急性损伤时被释放，是用于脑梗塞的灵敏的标志。根据本发明的方法，该测定法对于S100蛋白的β-亚基是特异性的。
S100b同种型是中枢神经系统急性损伤时被释放的特异性的大脑标志。它经肾消除，且在人血清中具有约2小时的半衰期。重复测量S100血清水平，有助于跟踪神经损伤过程。另外，结合中风症状，CSF或血清中升高的S100水平的出现有助于鉴别诊断中风，可能是有价值的脑梗塞指示剂。
烯醇酶(EC4.2.1.11)促进2-磷酸甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸在糖酵解途径中的相互转化。这种酶存在于各自为一独立基因的产物的三个同工蛋白中。将基因位点指定为ENO1、ENO2和ENO3。ENO1的基因产物是非神经元烯醇酶(NNE或α)，其广泛分布于多种哺乳动物的组织内。ENO2的基因产物是肌肉特异性烯醇酶(MSE或β)，主要位于心脏和横纹肌中。而ENO3的基因产物是神经元特异性烯醇酶(NES或γ)，被大量发现于神经元和神经内分泌细胞中。天然的酶是以由三种免疫学不同的亚基：α、β和γ组成的同-或异二聚体的同种型形式发现的，每个亚基具有大约39000道尔顿的分子量。
被指定为神经元特异性烯醇酶(NES)的αγ和γγ烯醇酶同种型，每个都有大约80000道尔顿的分子量。据显示，CSF中的NSE浓度在实验性的病灶性缺血后升高，并且NSE由受损脑组织释放到CSF中反映出梗塞的发展程度和大小。NSE具有约48小时的血清半衰期，它的峰值浓度出现在脑动脉(MCA)闭塞之后。在急性和/或扩散性疾病包括蛛网膜下出血和急性脑梗塞中，发现CSF中的NSE水平有所升高。
根据本发明测量的第四种标志蛋白是大脑内皮膜蛋白。沿大脑的小血管排列的内皮细胞具有独特的细胞表面表达、受体、转运蛋白和用于紧密地调节血液和大脑实质之间的溶质交换的胞内酶。大脑内皮膜蛋白包括：凝血调节蛋白(Tm)(涉及血管内凝结的调节的105000道尔顿的表面糖蛋白)、葡萄糖转运蛋白(Gluc1，以二聚体或四聚体的形式存在的55000道尔顿的细胞表面跨膜蛋白)、Neurothelin/HT7(整合于细胞质膜转运蛋白中的43000道尔顿的蛋白)、血清γ谷氨酰转肽酶(一种以由22000和25000道尔顿的亚基组成的异二聚体同种型形式出现，并且涉及将γ-谷氨酰残基从谷胱甘肽转移至氨基酸的蛋白)和P-糖蛋白(多抗药性跨膜蛋白)。在本发明方法的一个优选实施方案中，Tm是被测量的大脑内皮膜蛋白，是用于腔隙梗塞的灵敏的标志。
根据本发明方法得到的数据指示中风是否发生，以及如果发生中风，其类型、损伤的位置和损伤的蔓延。如果四种标志的水平都呈阴性，即在正常范围内，则没有脑部损伤。当只有大脑内皮膜蛋白如Tm升高或呈阳性，即其水平至少高于正常水平2SD时，中风是出现于大脑基底神经节和深层白质的腔隙梗塞。当NSE水平呈阳性且S100和/或MBP水平呈阴性(大脑内皮膜蛋白标志呈阳性或阴性)时，病人则患了TIA。
根据另一优选实施方案，测量来自根据本发明的方法分析的三种缺血性标志之一的特定细胞类型的第五种标志，以获得关于中风发作的时间的信息。人们认识到，中风症状的出现通常是不知道的，特别当病人是无意识的或是老年人，并且通常不能得到可靠的临床史。依靠具有不同分子量的大脑标志的不同的释放动力学，可以得到中风发作时间的指示。脑损伤后大脑标志释放到循环系统的时间取决于标志的大小，较小的标志趋向于较早释放，而较大的标志趋向于较晚释放。图1描述了根据本发明的方法分析的两种标志蛋白即MBP和S100的释放动力学。这些数据从采集自进行了冠状动脉搭桥手术的猪的大脑组织的流体获得。这些样本在对象离开搭桥机后的0、30、120、180和240分钟采集。浓度值以基准值(时间为零时的浓度)的倍数表达。这些数据显示，MBP(MW＝18500)的释放在缺血性发作后约120分钟达到最大，而S100(MW＝21000)的释放在发作后约180分钟达到最大。因此，通过测量来自用于本发明方法的三种缺血性标志之一的特定细胞类型的附加蛋白标志，可以得到关于发作时间的数据。发作时间被定义为中风临床症状出现的一刻。在该优选实施方案中，第二标志蛋白比相同细胞类型的基本标志大，即具有较大的分子量。
表1显示了本发明所用的三种缺血性标志和多种其它来自相同的特定细胞类型的大分子量标志。 表1标志 大小(D)最小的片段(D)特异性的神经胶质标志：S100 21,000 10,500成长相关蛋白43(GAP-43) 43,000 43,000谷氨酰胺合成酶(GS) 400,000 44,000神经胶质纤丝酸性蛋白(GFAP) 51,000 51,000甘氨酸转运蛋白(GLYT1) 50-70,000 50-70,000甘氨酸转运蛋白(GLYT2) 90-110,000 90-110,000特异性的神经元标志：神经元特异性烯醇酶(NSE) 78,000 39,000神经元特异性糖蛋白(GP50) 42,000 42,000钙激活中性蛋白酶 80,000 55,000神经纤丝蛋白(NF) 68,000 68,000热休克蛋白72(HSP-72) 72,000 72,000β淀粉样前体蛋白(βAPP) 250,000 125,000特异性的轴突标志：髓磷脂碱性蛋白(MBP) 18,500 18,500钙结合蛋白D-28K 28,000 28,000蛋白脂质蛋白(PLP) 23-30,000 23-30,000髓磷脂相关糖蛋白(MAG) 90-100,000 58,000神经丝H(HFN) 200,000 200,000
在本发明的一个优选实施方案中，分析在不同的时间点从病人采集的体液。通常地，第一个体液样本采集自呈现中风症状的病人，并根据本发明进行分析。随后，发病后一段时间，例如发作后约2小时，采集第二个体液样本并根据本发明分析。参见图2，显示一个说明如何由根据本发明分析的四种标志蛋白(实施方案中说明的NSE、S100、MBP和Tm)获得的数据按不同情况用于病人的流程图。这些数据可以诊断中风、排除中风、区分血栓性和出血性中风、鉴别适用于溶栓治疗的适合病人和确定中风如何发展。
如前所述，病人体液中的四种特异性标志的每一种的水平可以由一个单独的样本测量，或一种或多种个别标志可在一个样本中测量，和至少一种标志在一个或多个附加样本中测量。“样本”是指一定量的在一个时间点获得的体液，如血液或CSF。另外，如下面将详细讨论的，所有的标志可以用一台测定装置测量，也可以使用不同的装置测量每一种标志(在这种情况下，可以使用等分的同一液体样本，也可以使用不同的液体样本)。很显然，分析应当在样本采集后短时间内进行，如在约一个半小时内，这样可以尽快地将数据用于指示治疗。优选在同一单独的样本中测量四种标志的每一种，而不考虑分析是在一台测定装置进行还是在不同的装置进行，这样，在一个单独的样本中同时得到每一种标志的水平，由其提供有意义的数据。
通常地，使用每种标志的特异性抗体以及检测每种抗体对其各自的关连标志的免疫特异性结合，来确定每种标志的存在。可以使用任何适当的免疫测定方法，包括那些可商购的，来确定根据本发明测量的每种特异性标志的水平。这里不需要广泛讨论已知的免疫测定技术，因为这些技术都是本领域的技术人员所公知的。典型的适当的免疫测定技术包括夹心酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定、均相测定、非均相测定等。多种已知的免疫测定方法参见：酶学方法(Methods in Enzymology)，70，pp.30-70和166-198(1980)。在免疫测定中可使用直接和间接标记。直接标记可以被限定为一实体，在其天然状态下，它对于裸眼是可见的，或者借助光学滤光片和/或应用刺激作用如紫外线来激发荧光而可见。可用的有色标记的例子包括金属溶胶颗粒、金溶胶颗粒、染料溶胶颗粒、被染色的乳胶颗粒或包封在脂质体中的染料。其它的直接标记包括放射性核素和荧光或发光的部分。根据本发明可使用如酶的间接标记。已知多种酶可用作标记，例如，碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、溶菌酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乳酸脱氢酶和脲酶。对于免疫测定中的酶的详细的讨论参见Engvall的“酶免疫测定ELISA和EMIT”(EnzymeImmunoassay ELISA and EMIT)酶学方法(Methods of Enzymology)，70，419-439(1980)。
根据本发明优选使用的免疫测定方法是用于测量病人体液的标志蛋白的水平的双抗体技术。根据该方法，一种抗体是“捕获”抗体，另一种是“探测器”抗体。捕获抗体固定在固相载体上，该载体可以是任何一种本领域已知的类型，例如，微量滴定板孔、珠、管和多孔材料如尼龙、玻璃纤维和其它聚合材料。在该方法中，将固相载体如微量滴定板孔包被有捕获抗体，优选对抗所关注的特殊标志蛋白的单克隆抗体，从而构成固相。加入稀释的病人体液如血清或血浆(通常为约25μl)、标准品和对照以分离固相载体，并且保温。当标志蛋白存在于体液中时，它就会被对该蛋白特异的固定化抗体捕获。经保温和洗涤后，向固相载体中加入抗-标志蛋白探测器抗体，如多克隆的兔抗-标志蛋白抗体。探测器抗体和结合了捕获抗体的标志蛋白结合，形成夹心结构。经保温和洗涤后，向固相载体中加入抗-IgG抗体如多克隆的山羊抗-兔IgG抗体，其用酶如辣根过氧化物酶(HRP)标记。经保温和洗涤后，向固相载体中加入酶的底物，然后保温并加入酸性溶液终止酶的反应。
固定化的酶的酶活性程度通过测量适当波长(例如，对于HRP为450nm)下固相载体上的已氧化的酶产物的光密度来确定。在该波长的吸光度与液体样本中标志蛋白的量成比例。使用一组标志蛋白标准品来作成吸光度对标志蛋白浓度的标准曲线。优选该方法是因为试验结果可以在45到50分钟内提供，而且该方法在每种标志的目标浓度范围内都很灵敏，并且是高度特异的。
用于测量标志蛋白的测定方法应当具备足够的灵敏度，以能够测量从健康人的正常值到升高的水平(即在正常之上2SD和更高)的浓度范围内的每种蛋白。当然，标志蛋白的正常值范围可以通过分析健康人的体液得到。对于S100b同种型，+2SD＝0.02ng/mL，测定范围的上限优选约5.0ng/mL。对于NSE，+2SD＝9.9ng/mL，测定范围的上限优选约60ng/mL。对于MBP具有升高水平截止值0.02ng/mL，测定范围的上限优选约5.0ng/mL。对于Tm，具有升高水平截止值约73ng/mL，测定范围的上限优选约500ng/mL。
测定可以在多种形式的测定装置中进行，包括授权给PBDiagnostic Systems，Inc.的美国专利4906439、5051237和5147609中描述的装置。
根据本发明所用的测定装置可以用来提供半定量的或定量的结果。术语“半定量”是指辨别高于升高的标志蛋白值的水平和不高于阈值的水平的能力。
测定可以在多种形式的装置中进行，包括如前所讨论的微量滴定板规格(优选用于以成批的模式进行测定)。测定也可以在自动免疫测定分析仪(是本领域公知的，并且可以在很多不同的样本上进行测定)中进行。这些自动分析仪包括连续/随机通道类型。授权给PB DiagnosticSystems，Inc.的美国专利5207987和5518688中描述了这种系统的例子。多种自动分析仪是可商购的，包括OPUS和OPUS MAGNUM分析仪。
根据本发明可使用的另一种测定形式是快速手工试验，它可以在任何位置的关注位点(point-of-care)给药。通常，这种关注位点测定装置可以提供高于或低于阈值的结果，即如前所述的半定量结果。
还应当认识到，根据本发明使用的测定装置可以对一种特殊的标志蛋白进行一次单独测定，或对相应数目的不同的标志蛋白，从一单独量的体液，进行多元测定。后一类型的测定装置优选可以是一对根据本发明测量的四种主要标志蛋白(即S100b、NSE、MBP和大脑内皮标志蛋白如Tm)提供半定量结果的测定装置。这些装置通常适于在特定位置提供一明显的视觉上易看见的有色带，其中该位置是当标志蛋白的浓度高于阈值水平时对应特殊的标志蛋白的捕获抗体所处的位置。关于根据本发明可使用的测定类型以及多种测定形式和自动分析仪的详细的讨论参见授权给Jackowski的美国专利5747274。
现在，对应具体的优选实施方案进一步详细描述本发明，可以理解，这些仅为了说明本发明，本发明并不局限于此处引用的材料、步骤等。
实施例
在两个三级医院进行了预期观察试验研究。本研究评估了经过临床和计算机X射线断层造影术(CT)诊断为急性缺血性中风的33个病人。中风病人的平均年龄大约为66岁(66.4±16.4)，年龄范围为27到90岁。症状出现到送到医院之间的耽搁平均为22小时，范围为1到72小时。记录国家保健研究院中风等级入院表(Admission NationalInstitutes of Health Stroke Scale)和改进的Rankin级别出院评分图表(Discharge modified Rankin scale scores)。在一个医院，在发病的第1、3、5和7天获取血样，在第二个医院在第1、2和3天获取血样，将所有的血样离心分离，将等分的血清冷藏在-80℃直到用于分析S100、NSE、MBP和Tm。
对照对象包括103个健康供血者(年龄范围为18到78岁，平均年龄54.6±15.2岁)，他们的血样用于确定对应于S100和NSE的浓度的参考值；和24个健康供血者，他们提供用于MBP和Tm浓度的参考测量的样本。
除非另有说明，所有的参考值报告为平均+2SD。血清中S100的参考值为0.0067ng/mL，具有0.020ng/mL的第98百分位数值。升高的S100值被认为是任何大于正常值(正常+2SD＝0.02ng/mL)的第98百分位数值(0.02ng/mL)的浓度。
血清中NSE的参考值为5.03±2.40ng/mL。升高的NSE值是任何大于在正常之上2SD即9.85ng/mL的浓度。
血清中MBP的参考值为0.0162±0.0019ng/mL。升高的MBP值是任何大于在正常之上2SD即0.02ng/mL的浓度。
血清中Tm的参考值为50.52±13.62ng/mL。升高的Tm值是任何大于在正常之上+2SD即76.14ng/mL的浓度。
分别使用得自Skye PharmaTech Inc.，Mississauga，Canada的ExactS100和Exact NSE Elisa测定试剂盒分析S100和NSE的水平。用得自Diagnostica Stago，9 rue des Freres Chausson，92600 Asneres Sur Seine，France的ELISA测定分析Tm的水平。用得自Diagnostic SystemsLaboratories，Webster，Texas，United States的ELISA免疫测定分析MBP的浓度。
在显示所得数据的表中，“D1”表示第一天，当天在发病时采集第一个血样。随后采集样本的时日由D2、D3等表示。对于标志的浓度值，+2SD是高于正常范围的值，“ND”表示没有获得数据。 表II 临床血清样本中NSE、S100、MBP和Tm的浓度 编码#年龄性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL) +2SD＝73 SM-1D1 42 女 8.342 0.028 0.000 43.535 SM-1D3 13.300 1.098 ND 61.946 SM-1D5 9.622 0.060 0.238 65.859 SM-1D7 10.710 0.066 1.725 62.177 诊断左内颈动脉。脑梗塞(动脉栓子性)。症状出现后5小时。 结果好。较度失语SM-2D1 55 女 9.420 0.053 0.032 NDSM-2D3 5.430 0.015 0.105 NDSM-2D5 7.360 0.011 0.341 NDSM-2D7 9.906 0.008 0.124 ND诊断脑梗塞。后循环梗塞(机理不明)。症状出现后20小时。结果中等。讷吃和轻偏瘫SM-3D1 78 男 12.670 0.112 0.000 92.324SM-3D3 14.980 0.719 1.420 101.990SM-3D5 28.570 1.301 4.845 119.251诊断脑梗塞。整个前循环梗塞(心脏栓子性)结果死亡SM-4D1 58 男 8.520 0.008 0.000 73.913SM-4D3 4.406 0.028 0.147 78.286SM-4D5 4.888 0.024 0.265 85.881诊断脑梗塞。腔隙循环梗塞(腔隙)结果好。中度共济失调的轻偏瘫 表II 临床血清样本中NSE、S100、MBP和Tm的浓度 编码#年龄 性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL) +2SD＝73 SM-5D2 27 男 9.139 0.099 2.301 59.415 SM-5D3 5.492 0.000 0.090 53.892 SM-5D5 11.730 0.079 7.682 68.850 SM-5D7 11.540 0.018 10.382 68.620 诊断脑梗塞(纤维肌性的发育不良)。症状出现后48小时。 结果中等。失语和轻偏瘫 SM-6D1 63 男 7.029 0.000 0.000 56.883 SM-6D3 6.455 0.020 0.000 75.985 诊断脑梗塞(机理不明)。症状出现后22小时。 结果中等 SM-7D1 64 女 8.566 0.021 0.013 105.212 SM-7D3 5.061 0.024 0.000 129.146 SM-7D5 6.783 0.021 0.017 129.607 SM-7D8 7.377 0.015 0.000 162.746 诊断脑梗塞。腔隙循环梗塞(腔隙)。 结果中等。轻偏瘫。 SM-8D1 45 男 15.740 0.053 0.009 37.092 SM-8D3 21.010 0.112 0.082 35.711 SM-8D5 15.060 0.095 0.112 38.703 诊断脑梗塞(右脊柱裂开) 结果好。最小的缺损。 表II 临床血清样本中NSE、S100、MBP和Tm的浓度 编码# 年龄 性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL) +2SD＝73SM-9D1 35 男 11.530 0.015 0.101 NDSM-9D5 8.033 0.021 0.040 NDSM-9D7 7.336 0.002 0.000 ND诊断脑梗塞(机理不明)。结果好。最小的缺损。 表III编码# 年龄性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL) +2SD＝73SJ-01D1 83 男 6.803 0.091 0.000 185.760SJ-01D2 8.566 0.235 0.000 166.659SJ-01D3 8.689 1.143 0.000 209.234诊断脑梗塞(复发)。↑BP，肾功能不全，MI结果第二天发展为严重损伤SJ-02D1 61 男 14.040 0.054 0.433 476.193SJ-02D2 13.430 0.110 1.199 403.010SJ-02D3 12.890 0.247 2.625 501.739诊断脑梗塞(体壁梗塞)，肾衰竭，MI，CA。症状出现后48小时结果第一次CT阳性。第二次CT阳性(第3天)。死亡(第5天)SJ-03D1 83 男 10.700 0.000 0.000 75.064SJ-03D2 8.926 0.000 0.000 81.968SJ-03D3 9.000 0.000 0.000 89.793诊断脑梗塞(腔隙)。↑BP，DM结果CT阳性(第2天) 表III 编码#年龄 性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL) +2SD＝73SJ-04D1 70 女 10.270 0.000 0.000 134.209诊断TIA.↑BP，DM结果SJ-05D1 72 男 6.639 0.000 0.326 185.760SJ-05D2 10.870 0.000 0.219 136.281SJ-05D3 8.197 0.000 0.387 132.598诊断脑梗塞(腔隙)，肾损伤结果第一次CT阴性SJ-06D1 81 女 10.440 0.001 0.086 ND诊断脑梗塞(腔隙)。肾损伤(透析)。症状出现后36小时。结果CT阳性(2天)SJ-07D1 90 女 12.540 0.001 0.162 ND诊断脑梗塞，症状出现后36小时结果SJ-08D1 81 男 12.450 0.749 0.017 82.198诊断出血。症状出现后1小时结果CT阳性。2小时后死亡SJ-09D1 46 男 4.891 0.000 0.000 88.182SJ-09D2 3.913 0.000 0.000 87.722SJ-09D3 1.848 0.000 0.000 105.903诊断中风(临床性)。症状出现后3小时内PA结果CT阴性 表III 编码#年龄 性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL) +2SD＝73SJ-10D1 69 女 8.303 0.000 0.000 79.437SJ-10D2 6.000 0.000 0.000 74.144SJ-10D3 3.939 0.000 0.000 68.850诊断症状出现生约12小时-胳膊麻木-右侧面部下垂；吞咽困难-没有过往Hx CVA-糖尿病病人；具有Hx高BP结果开始CT阴性。所有症状消失；除了病人仍无法吞咽以外。SJ-11D1 39 男 10.770 0.058 0.063 65.398SJ-11D2 12.050 0.047 0.128 69.311SJ-11D3 17.330 0.068 0.189 76.675诊断脑梗塞。症状出现后约24小时-发现无意识伴随有右侧忽略结果CT阳性(第1天)-左侧基底神经节约2cm存在3处损伤病人仍有严重的右侧虚弱伴随语言损害SJ-12D1 51 女 11.700 0.000 0.067 286.100SJ-12D2 8.788 0.000 0.055 270.911SJ-12D3 11.800 0.002 0.124 226.264诊断脑梗塞(腔隙)。症状出现后约12小时-左侧虚弱，特别是左臂-面部下垂和讲话发音含糊-左侧Bell’s麻痹-肾透析病人结果CT阳性(第1天)-第2天发展为血小板减少 表III 编码#年龄性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL) +2SD＝73SJ-13D1 78 女 10.090 0.000 0.000 46.297SJ-13D2(溶血的) 40.040 0.768 0.433 41.924SJ.13D3 4.667 0.103 0.000 36.861诊断脑梗塞(左侧MCA CVA)+CAD，+糖尿病，Hx HTN，+家族Hx CVA。症状出现后约19小时结果开始CT阴性。初始症状经48小时恶化为右侧偏瘫SJ-14D1 72 男 7.303 0.087 0.299 NCSJ-14D2 5.697 0.007 0.055 NC诊断脑梗塞(左侧CVA)。症状出现后约9小时-在前CVA 1989-Hx纹状纤维，抗凝的-MI 1997结果症状改善SJ-15D1 79 男 5.667 0.000 0.013 ND诊断脑梗塞(左侧CVA)。-症状经2周好转；在送到医院前的3天内恶化。结果第1天CT阴性-出院期间情况恶化(家人要求出院在家中治标护理)SJ-16D1 90 女 20.940 0.811 5.142 52.281SJ-16D2 12.220 0.498 5.459 55.733SJ-16D3 9.424 0.253 3.377 55.503诊断大量脑内出血，伴随较小的硬膜下血肿和心室内出血-症状出现时间不明(6到29小时之前)-以前很好；无Hx，除了20年前结肠Ca；在家未服用药物；发现虚脱结果病情继续恶化 表III 编码#年龄性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL)+2SD＝73SJ-17D1 77 男 10.660 0.042 0.002 NDSJ-17D2 8.758 0.095 0.006 NDSJ-13D3 12.510 0.261 0.417 ND诊断脑梗塞(右侧CVA)-以前左脑梗塞-突然发作；讲话含糊并有左侧虚弱症状出现后约15小时结果CT显示老的CVA和新的右侧MCA梗塞SJ-18D1 79 男 21.560 0.008 0.000 61.946SJ-18D2 14.390 0.218 0.814 48.598SJ-18D3 11.050 0.102 0.698 55.963诊断开始CT显示出血或脑部水肿。症状发生后约2小时结果失语和右侧虚弱SJ-19D1 82 女 9.948 0.000 ND 64.248SJ-19D2 9.781 0.008 ND 58.955SJ-19D3 11.720 0.023 ND 64.248诊断TIA。症状出现后约24小时结果讲话含糊，持续吞咽困难SJ-20D1 ND 男 26.400 0.122 0.000 32.719诊断出血性中风结果SJ-21D1 74 男 5.828 0.016 ND 74.374SJ-21D2 7.423 0.063 ND 75.985SJ-21D3 8.436 0.286 ND 71.382诊断脑梗塞(左侧CVA)结果右侧虚弱 表III 编码# 年龄 性别 NSE (ng/mL)+2SD＝9.9 S100 (ng/mL)+2SD＝0.02 MBP (ng/mL)+2SD＝0.02 Tm (ng/mL) +2SD＝73SJ-22D1(溶血的) 63 女 18.600 0.000 0.000 NDSJ-22D2 9.540 0.008 0.000 ND诊断脑梗塞(左CVA)，开始CT阴性结果虚弱(消失)SJ-23D1 79 男 14.530 2.009 5.478 NDSJ-23D2 23.980 ＞3.200 8.155 NDSJ-23D3 27.670 2.218 7.309 ND诊断硬梗塞，CT阳性结果CT显示多处脑梗塞SJ-24D1 73 男 20.630 0.000 0.000 74.160SJ-24D2 17.880 0.000 0.000 89.750SJ-24D3 17.880 0.000 0.000 83.290诊断TIA-活动能力突然减退，语言困难结果CT阴性-诊断为TIA，出院
健康的对照对象的血清样本中S100、NSE和MBP的水平的分析显示，这些蛋白的水平与年龄或性别没有关系。对于Tm，在健康的男性血清样本中的浓度高于女性(分别为54.62±13.62ng/mL、正常之上2SD＝81.86ng/mL和43.63±11.18ng/mL、正常之上2SD＝68.74ng/mL)。
33个中风病人中26人是梗塞(79％)，5人是腔隙梗塞(15％)，4人患出血性中风(12％)。出血性中风的病人中，3人患蛛网膜下出血，一个患脑内出血。3个病人(9％)患短暂性缺血性发作(TIA)。
44％的病人的S100水平在发病时升高，59％的病人的NSE水平升高，40％的病人的MBP水平升高和57％的病人的Tm水平升高。
数据显示，通过根据本发明测量所述四种标志蛋白，如果任何一种标志升高，94％的病人可以被断定患病。21个非腔隙性梗塞患者中19人可被断定患病(90％)。剩下的2个病人分别在症状出现后22和72小时到达医院。
图3-10的每一幅都是由所研究的不同病人获得的数据的图示。浓度水平表达为参考值的倍数，是通过实际测得的浓度值除以定义的各个标志蛋白的参考值(即2SD值)得到的。
所有腔隙性梗塞、出血和TIA病人被证实患病的准确率为100％。所有5个腔隙性梗塞的病人在发病时Tm水平都升高。一些病人中，Tm是唯一的水平升高的标志蛋白。现在参照图3，可以看出，对于病人SM7，Tm是唯一的水平升高的标志蛋白，指示患有腔隙性梗塞。
3个TIA病人具有升高的NSE水平和正常的S100和MBP水平(处于正常范围内)。一个TIA病人的Tm升高。现在参照图4，可以看出，对于病人SM-24，Tm稍有升高并且NSE升高，指示患有TIA。该病人被诊断为TIA而出院。现在参照图5，可以看出，病人SM-3的MBP和S100水平大幅升高，并且NSE和Tm水平升高，指示患有脑梗塞且损伤延及大脑基质。
4个出血性中风的病人中，3个蛛网膜下出血的病人的S100和NSE水平升高，Tm水平正常。患脑内出血性中风的病人的S100和NSE水平升高，MBP的水平升高大约250倍。图6说明了病人SJ-16发病时MBP的水平升高250倍，且S100和NSE水平升高，他患脑内出血。
图7说明病人SJ-2发病时具有升高的MBP、Tm和S100，并且MBP和S100水平随时间继续升高，指示为随时间加重的脑梗塞并伴随有中风。发病时最初的CAT扫描呈阴性，仅几天后变为阳性。
图8说明病人SJ-18患有TIA(发展为中风)。Tm在正常范围，显示大脑脉管系统不是妥协性的，从而指示病人是宜于溶栓治疗的患者。
图9说明病人SM-8患有脑梗塞且Tm在正常范围，是宜于溶栓治疗的患者，因为其内皮的脉管系统不是妥协性的。
图10说明病人SJ-1患有脑梗塞，并且由于Tm水平升高，如果给予溶栓治疗将有出血的危险，因为其内皮的脉管系统是妥协性的。
对于所得的第二个血清样本，73％的中风病人的S100水平升高，54％的中风病人的NSE水平升高，64％的中风病人的MBP水平升高和55％的中风病人的Tm水平升高。这些数据显示，通过根据本发明测量四种标志蛋白，如果任何一种标志升高，96％的病人可以由所得的第二个血清样本断定患病。
数据显示，在随后的血清样本中，蛋白标志水平的升高或降低取决于中风是恶化还是减轻。
33个中风病人中18个(54％)在发病时进行了CAT扫描。所有的4个出血性中风病人发病时CAT呈阳性。18个病人中9个(50％)发病时CAT正常，几天后变为阳性。这9个发病时CAT正常的病人中8个在发病时四种蛋白标志中的一种或多种水平升高。所有的9个发病时CAT呈阳性的病人在发病时也具有一种或多种蛋白标志水平的升高。
S100、NSE和MBP的峰值水平与入院NIHSS评分(p＜0.05)和出院改进的Rankin评分(p＜0.05)显著相关(Pearson’s)。
数据显示在急性缺血性中风的病人中可以容易并可靠地测出S100、NSE、MBP和Tm的水平，且通过根据本发明测量这四种标志蛋白，当任何一种标志蛋白升高时，在发病时对急性缺血性中风的测量灵敏度可达94％。另外，在形成中风的超急性期间，在下述损伤通过CAT检测到之前，这四种标志蛋白的一种或多种的水平升高表明发生了不可逆的组织损伤和大脑水肿。
尽管本发明关于多个优选实施方案进行了描述，但是它不意味局限于其中。本领域的技术人员会认识到在不脱离本发明的精神和所附权利要求书所述范围的前提下可进行各种改变和修正。