外周血中肝细胞的检测方法 本发明涉及到有关临床肝癌诊断中采用的检测方法，尤其是关于外周血中肝细胞的检测新方法。
肝癌是遍及全球的死亡率高的癌症之一。尽管目前对肝癌相关的一些病理学因素有了较好的认识，但引起肝癌的分子机理仍不清楚。肝胆切除术仅是肝癌形成期的有效治疗，而不适合于肝外转移的肝癌患者。外周恶性细胞的检测对证明癌微小的转移、设计治疗策略、估价治疗效果和预见外科手术后复发的可能性很有帮助(AkriviadisEA.et al.，Br J Surg 1998；1319-1331)。
α-白蛋白(ALF)与肝癌的一种广泛应用的诊断指标α-甲胎蛋白(AFP)具有高度同源性，但它与肝癌的关系仍没有报道。白蛋白基因家族由四个基因编码的白蛋白、ALF、AFP和维生素D粘合蛋白组成，它们连续排列在4号染色体短臂亚着丝粒位点(Lichenstein HS.et al.，J Biol Chem1994；269：18149-18154.；Nishio H.Et al.，J Mol Biol 1996；259：113-119)。在这些蛋白基因中，AFP选择性地在胎儿的肝中表达，而ALF和维生素D粘合蛋白的表达限制于新生儿和成人地肝中。然而，在60-70％的肝癌细胞中AFP表达出现再活化，且刺激肝癌细胞生长是AFP的生物学功能之一。由于AFP基因的异常表达是肝癌患者的主要特征之一，所以血清AFP被作为肝癌的一种诊断指标。从肝癌原发灶释放的外周血肝癌细胞通常用来检测肝癌患者不同时期的肝外转移。尽管外周血中，AFP信使RNA(mRNA)表达通常作为血源性脱落的肝癌细胞的一种指标，但在肝硬化患者检测中AFP mRNA表达的假阳性结果占相对高的百分比(达30％)(Funaki NO.Et al.，Life Sci 1998；62：1973-1984.；Matsumura M.et al.，hepatology 1994；20：1418-1425)。
AFP被广泛地研究，但ALF和肝癌的关系已知的很少。AFP mRNA表达作为血源性脱落的肝细胞的一种指标检测灵敏度不高，而白蛋白mRNA在正常人外周血中也表达，因而没有特异性(Muller C.Hepatology1997；25(4)：896-9.)。因此，研究ALF mRNA表达与肝脏疾病之间的关系是一个新的课题。
为此，本发明的目的是提供一种外周血中肝细胞检测的新方法，作为检测肝癌的一个辅助手段。通过检测外周血中肝细胞ALF mRNA表达和AFPmRNA表达，区别正常肝细胞和恶性肝细胞，从而为临床诊断肝脏疾病提供更可靠、有力的证据，降低肝硬化所造成的假阳性结果，以利于临床诊断治疗肝癌。
本发明一种外周血中肝细胞检测的新方法是采用外周血取样、巢式PCR技术，检测外周血中肝细胞ALF mRNA表达，结合检测外周血中肝细胞AFPmRNA表达，从而提供一种外周血中肝细胞检测的新指标，它包括以下步骤：
1.外周血取样，RNA提取及反转录成cDNA
从肝癌患者取外周血样品，肝素化。对照的外周血样品从正常人身上获得。血样立即用于RNA提取。然后进行反转录，加入RNA，随机引物，核糖核酸酶抑制剂，dNTPs，反转录缓冲液及反转录酶，使mRNA反转录成cDNA。
2.外周血肝细胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR扩增
外周血肝细胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR扩增按下列两引物进行，ALF的PCR引物用GGTTTCTACAAAGATGAAACTAC和CATTTCTCTTCGGGATCCAG作外引物，用TGAAACTACTAAAACTTACAGG和GCAGAAATCCCACATCAGATT作内引物。AFP的PCR引物用CTGCAAACTGACCACGCTG和TGCTTGGCTCTCCTGGATG作外引物，用GGTCAATGTATAATTCATGCAG和ATTTCTGTAATTCTTCTTCTCC作内引物。
3、PCR产物分别于2％琼脂糖凝胶上进行电泳分析
由统计结果可以看出，正常人外周血中ALF mRNA和AFP mRNA都不表达；肝癌患者AFP mRNA检出率为93％，ALF mRNA检出率为10％。因而可以把外周血中ALF mRNA表达作为检测肝癌的一个辅助指标。即外周血中ALF mRNA和AFP mRNA的阴性结果作为良性肝细胞的指标，AFPmRNA的阳性结果而ALF mRNA的阴性结果作为恶性肝细胞的指标。
因此，检测个别患者外周血中肝细胞时通过下列步骤进行：外周血取样，提取RNA及反转录成cDNA；外周血肝细胞中ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR，PCR产物的凝胶电泳分析。然后，根据结果及其它临床资料对患者作出比较准确的诊断。图1、图2所示是实施例3对肝癌患者进行检测的结果，由图1、图2可以看出，正常人外周血中ALF mRNA和AFP mRNA都不表达；肝癌患者ALF mRNA不表达，AFP mRNA表达。
本发明外周血中肝细胞的检测方法的优点是采用巢式PCR这一实验室常用的技术，检测外周血中肝细胞ALF mRNA表达，结合AFP mRNA表达的检测结果，对肝癌作出初步诊断。对证明癌微小的转移、设计治疗策略、估价治疗效果和预见外科手术后复发的可能性很有帮助。此方法简便，并能将肝硬化在肝癌检测中所造成的高假阳性率30％降低到10％。
附图说明：
图1是肝细胞ALF cDNA的巢式PCR产物的电泳检测图
M—肝组织细胞 N—正常人外周血
HCC—肝癌患者外周血
图2是肝细胞AFP cDNA的巢式PCR产物的电泳检测图
M—肝组织细胞 N—正常人外周血
HCC—肝癌患者外周血
本发明通过以下的实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
实施例1外周血取样，RNA提取及反转录成cDNA
从上海东方肝胆医院的30个肝外转移性肝癌患者(肝癌诊断由探针肝活性组织学检查确定，20男，10女)各取5ml外周血样品肝素化，用于作ALFmRNA和AFP mRNA表达测定。对照的外周血样品从20个正常人(12男，8女)身上获得，血样立即用于RNA提取。取5ml肝素抗凝血加入30ml NH4Cl-TRIS溶液混匀，室温静置20分钟使红细胞溶解，离心(5000RPM)5分钟，收集沉淀白细胞，加入1ml TRIZOL试剂(购自Boehringer mannheim公司)，用移液器将白细胞反复吹打彻底匀浆，室温静置5分钟，加入200μl氯仿，混匀高速离心(12000g)两分钟。将上层水相转移至离心管，加入500μl异丙醇，振荡混匀，室温放置5分钟。高速离心(12000g)5分钟，小心弃上清液，室温静置约15分钟使RNA恰好干燥，加水溶解。
然后进行反转录，于20μl反应体系中分别加入5μg mRNA，随机引物(0.1ng/μl)1.0μl，核糖核酸酶抑制剂1.0μl(10U)，2mM dNTPs 2.0μl，5X反转录缓冲液4.0μl，反转录酶1.0μl(10U)(这些均在一PCR试剂盒中，购自GIBCO公司)，于37℃反应一小时，使mRNA反转录成cDNA，95℃5分钟灭活反转录酶。
实施例2外周血中肝细胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR扩增
外周血中肝细胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR按下列两引物进行。ALF的引物按基因库中增加数字L32140排序设计，用GGTTTCTACAAAGATGAAACTAC和CATTTCTCTTCGGGATCCAG作外引物，用TGAAACTACTAAAACTTTACAGG和GCAGAAATCCCACATCAGATT作内引物。AFP的引物按基因库中增加数字V01514排序设计，用CTGCAAACTGACCACGCTG和TGCTTGGCTCTCCTGGATG作外引物，用GGTCAATGTATAATTCATGCAG和ATTTCTGTAATTCTTCTTCTCC作内引物。
ALF的PCR反应第一步(94℃，5分钟；94℃，40秒；60℃，40秒；72℃，40秒；30个循环；72℃，2分钟)在200ml容器中加入2μl cDNA液体，每种外引物10 pmol和2个单位的Taq DNA多聚酶(Life Technologies，Inc)于标准PCR缓冲液(200umol/L dNTPs，1.5mmol/LMgCl2，10mmol/L Tris-HCl，PH8.3，50mmol/L KCl)中进行。2ml第一步PCR产物和内引物进行第二步PCR反应(94℃，5分钟；94℃，40秒；58℃，40秒；72℃，30秒；30个循环；72℃，2分钟)。AFP第一步扩增(94℃，5分钟；94℃，40秒；64℃，30秒；72℃，40秒；30个循环；72℃，2分钟)，第二步扩增94℃，5分钟；94℃，30秒；60℃，1分钟；72℃，30秒；30个循环；72℃，2分钟)。PCR产物于2％葡聚糖凝胶上电泳。由统计结果可知，正常人外周血中未检测到ALF mRNA和AFP mRNA；肝癌患者AFP mRNA检出率为93％，ALF mRNA检出率为10％。
实施例3肝癌患者外周血中肝细胞的检测
取肝癌患者外周血，肝素化，并提取RNA，并反转录成cDNA(方法同实施例1)，然后进行外周血中肝细胞ALF cDNA和AFP cDNA的巢式PCR扩增(方法同实施例2)。结果见图1及图2，肝癌患者ALF mRNA不表达，AFP mRNA表达。