减少电渗流的表面 本发明所属技术领域
本发明一般地涉及有效地暴露于流动溶质的固体表面，尤其涉及毛细管或微型薄片等表面吸附有聚合物的制品，当这些制品用于电泳分离时，可有效地减少电渗流。
与本发明相关的背景技术
电泳是一种众所周知的分离带电物质的技术，其原理是利用电场影响下带电物质在迁移速率上的差别。毛细管电泳的优点有许多，用非常小的样本量就可以获得定量信息，并且凝胶或缓冲剂的消耗量很小。伴随毛细管电泳会产生某些现象，这些现象在传统的平板凝胶电泳中并不存在。其中之一是现在熟知的电渗流现象，电渗流现象的特征是大量缓冲溶液向某一电极移动。
对许多电泳应用来说，并不希望有电渗流，而希望消除或显著减少大量流动。一般而言，当电渗流被减少到最低限度时，电泳的试样组分仅借助于电泳迁移而移动，这改善了分析再现性和试样组分的物质回收。
Jorgenson和Lukacs已经注意到，用未处理过的熔凝氧化硅毛细管及pH值为7的磷酸盐缓冲溶液对模型蛋白质，如细胞色素、溶菌酶和核糖核酸酶A进行分离时，伴随着很强的谱尾。他们认为，这种现象可能是由带正电荷蛋白质和带负电荷毛细管壁之间的库仑力相互作用所引起。(Jorgenson等，Science,222,1983,pp.266-272)作者报告了对聚四氟乙烯毛细管的研究，研究发现聚四氟乙烯毛细管对蛋白质也显示出显著的吸附性。他们试图用三甲基硅烷、八癸基硅烷、氨基丙基硅烷和交联的甲基纤维素之类的基团来钝化熔凝氧化硅的表面，但明显地并不成功。然后他们转向于把含有乙二醇的基团结合到表面上。
Lauer和McManigill(Analytical Chemistry,58,1986,p.166)报道说，蛋白质和硅石毛细管壁之间的库仑排斥力可以克服蛋白质与毛细管壁的吸附倾向。他们说明了通过改变与蛋白质的等电点(pI)有关地溶液pH值来改变其净电荷，从而分离模型蛋白质(分子量范围是从13,000到77,000)。然而，这种方法的缺点是，当pH值高于7时，硅石开始溶解，这会缩短柱体寿命和降低性能，并且仅能分析等电点小于缓冲溶液pH值的蛋白质。
美国专利4,680,201(发明者是Hjerten,1987年7月14日发布)描述了另一种方法，来解决不希望发生的蛋白质与毛细管壁之间的相互作用问题。该专利提供了一种方法，用于制备电泳分离所需的薄壁、小直径毛细管。具体做法是，利用二官能化合物，该二官能化合物的一个基团特定地和玻璃壁起反应，而另一个基团和参与聚合过程的单体起反应。自由基过程导致聚合物涂层，如聚丙烯酰胺涂层。另有其他被建议采用的涂覆聚合物，如聚乙烯醇和聚乙烯基吡咯烷酮。
其后描述了其他以共价键结合的物质。美国专利5,605,613(1997年2月25日发布，发明者是Shiel)披露了在内壁表面具有中性交联亲水性涂层的毛细管柱，据说它减少了与内表面的分析物相互作用。涂层柱包括一种以共价键结合到内表面的聚合物。
美国专利5,840,388(1998年11月24日发布，发明者是Karger等)，描述了一种用于高性能电泳的涂层微毛细管柱，通过使一种有机化合物(如聚乙烯醇)与柱表面聚合，从而形成聚合物涂层。美国专利5,792,331(1998年8月11日发布，发明者是Srinivasan等)，披露了一种涂覆毛细管或层析衬垫的方法，即把一种聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮(“PVP”)，共价结合到毛细管壁上。
虽然涉及到化学键结合(即共价结合)的毛细管处理能减少电渗流，但其处理过程相对而言是费时和昂贵的，并且也倾向于在毛细管柱的内部产生相对较厚的涂层。用于毛细管电泳的毛细管柱，其内径通常在25μm至200μm的数量级，因而共价连结涂层会显著增加完成电泳分离的时间。
美国专利5,552,028(1996年9月3日发布，发明者是Madabhushi等)，披露了一种分离多核苷酸混合物的方法，其中分离介质的一种组分，包括一种吸附硅石的聚合物。美国专利5,567,292(1996年10月22日发布，发明者是Madabhushi等)，披露了一种能抑制电渗流的方法，用这种方法提供一种分离介质，该分离介质含有吸附硅石的聚合物，浓度大约占分离介质的0.001％到10％重量/体积(wt./v)。Madabhushi等人的两个专利，披露了一种动态涂覆方法，此方法中洗提液或分离介质自身含有在分离期间所需涂覆添加剂，从而屏蔽表面电荷。然而，这些添加剂可能会与分析物相互作用，导致不可预料和不期望的结果，因而，理想方案被限制于使用某些特定的分离基质。
发明简述
本发明的目标是提供有利于电泳分离的固体表面，如毛细管。这种表面相当程度上减少了与流经表面的溶质间的相互作用，而这种表面的制备是简便、快捷和相对便宜的，并且具有长期的稳定性。
在阅读了本发明的说明书和权利要求之后，本领域技术人员会明白本发明的进一步目标和优越之处，及如何运用本发明。
本发明的目的之，是提供一种制造成品，该成品在电泳分离期间暴露于溶质流时，有利于区分溶质。所述溶质包括带电物质，如蛋白质和低聚核苷酸。本发明特别优选的成品是毛细管，在DNA序列分析、DNA片断分析和筛分，以及蛋白质分离和分析中，这种毛细管非常有用。本发明的成品具有带聚合物的固体表面。聚合物被吸附到表面，其作用是减少溶质与表面的相互作用。所述的聚合物，优选的是聚乳胺(polylactam)，最好是聚乙烯基吡咯烷酮，也称为PVP；其分子量最好是大于1,000,000道尔顿(平均重量)。在引入分离介质之前，通过吸附，这种聚合物已被简便、快速地涂覆到毛细管的内壁上。
依据本发明进行处理过的表面，减少了电渗流，并实际上可以应用于任何毛细管电泳分离，消除其电渗流，或把电渗流降至最小程度。本发明的表面，特别适用于作为电泳分离系统的涂覆的毛细管柱，如CEQ 2000、P/ACE MDQ和Paragon CZE 1000电泳分离系统。这些电泳分离系统由Beckman Coulter公司(Fullerton,Califomiia)制造和出售，它们应用于DNA序列分析、DNA片断分析和筛分，以及蛋白质的分离和分析等。
附图简要描述
图1比较了未涂层的(在先技术)毛细管与发明的具体成品的电渗流，其中画出了pH值对电渗流的关系曲线；
图2A说明了用于DNA分离时的未涂层的(在先技术)毛细管；
图2B是利用本发明实施例的DNA序列分离的电泳图。
优选实施例的详细描述
在本发明的一个优选实施例中，对由熔凝硅石制成的毛细管的处理是把聚合物(最好是聚乳胺)吸附到内孔上。依据特定的分析应用，被处理的毛细管在长度和直径上可以变化。相信其他不是由硅石制成的成品材料，也可按照本发明进行适当处理。
在本发明的另一个优选实施例中，用于小型仪器或装在小型仪器上的微孔道(如微薄片)的处理，是把聚合物吸附到孔道上。微薄片在微量分析系统中很有用。例如，在《化学和工程新闻》1999年2月22目的一篇文章中，描述了典型的用于小型化学系统的微薄片，在这里对2或3平方厘米的硅、玻璃、石英或塑料进行蚀刻或用容器对其进行模塑，孔道的横截面可以低到50μm。在色层分析、电泳分离柱、聚合链反应容器、泵和阀门等方面，小型部件很有用，所有这些都使用厘米大小的微薄片。
柱子(如毛细管或小型孔道)的长度可以是从大约5cm至2000cm，而内径(如使用孔道则是宽度)可以是从大约5μm至大约200μm。虽然是在小型仪器中使用，薄片通常是大约2至3cm2。
虽然微薄片上的毛细管柱和微孔道适用于电泳分离样品，特别适用于生命分子组分(如蛋白质和低聚核苷酸)，但对其他在使用中暴露于溶质，对流动溶质起分离作用的物品，如微珠和其他层析填充材料，也可依据本发明进行涂覆。
用于进行毛细管电泳的仪器是众所周知的，特别期待创新的涂覆毛细管柱应用于电泳分离系统，如CEQ 2000、P/ACE MD Q和Paragon CZE 1000系统。这些系统由Beckman Coulter公司(Fullerton,Califomia)制造和出售，它们应用于如DNA序列分析、DNA片断分析和筛分以及蛋白质分离和分析。
依据本发明，一种有效降低表面或内表面(如毛细管的孔)相互作用的聚合物被吸附到表面。依据本发明，聚合物最好是聚乳胺。在表面暴露于样品之前，聚乳胺被表面吸附。所述的样品流经表面(如通过分离柱)以便电泳分离样品中的组分。合适的聚乳胺包括PVP和取代的PVP(如在环上有取代基)。尤其是，吸附到制品上的聚合物最好基本上由聚乙烯基吡咯烷酮，或“PVP”所组成，其分子量(平均重量)大于1,000,000道尔顿，最好大约为1,300,000。分子量的上限可以相当程度上进行变化。实际上，人们通常使用分子量在1,300,000和4,000,000道尔顿之间的聚合物。
聚合物的硅石吸附特性可用许多熟悉的方法进行测量，如椭圆对称法(ellipsometry)，测定吸附测验颗粒流体性能的变化、测定吸附等温线，或类似的方法。Malmsten(Macromolecules,25,pp.2474-2481,1992)、Rob和Smith(European Polymer Journal,10,Pp.1005-1010,1974)、Vincent(Surf.Colloid Sci.,12,PP.1-117,1982)、Takahashi(Advanced in Polymer Science,46,PP.1-66,1982)和类似的参考文献描述了这种技术。通过在一套标准数值下观察电内渗流的减少，也可以间接测量吸附程度。
对多核苷酸的分离来说，吸附的聚乳胺最好用分辨率和在标准条件下选定的多核苷酸的“阶梯”的多核苷酸的长度之间的关系来表征。分辨率可方便地用试验系统的理论平板的数目(N)来表示。N=(L/σ)2其中L是在一个波峰下从注入口到检测器(通常波峰最大值的位置)的测试分析物的平均路径长度，而σ是波峰的偏差。
商业途径可获得试剂盒中，有上述大小范围内的不同大小聚核苷酸的典型阶梯，如从BRL-GIB公司可获得100碱基对双链DNA阶梯，从Applied Biosystems公司可获得Taq DNA序列标准，以及从Beckman Coulter公司和类似的公司获得CEQ DNA试验样品。
我们发现已吸附聚乳胺的发明的成品在准备使用前最好保存在贮藏凝胶中。特别优选的贮藏凝胶是使用线性聚丙烯酰胺作为胶化组分(虽然其它凝胶作为贮藏凝胶无疑是可能的)。贮藏凝胶的制备，是把3％(w/v)的聚丙烯酰胺(特别是具有2,000,000至10,000,000平均分子量)溶解在缓冲溶液中。缓冲溶液由100毫克分子的Taps、20毫克分子的三羟甲基氨基甲烷(Tris)和1毫克分子的EDTA所组成。使用前，依据特定应用的认可，贮藏凝胶可以或无须除去。凝胶的pH值大约是7.8。聚乳胺，如优选的PVP，最好溶解在缓冲溶液中(我们称为“重建缓冲溶液”)。该优选的重建缓冲溶液可由100毫克分子的Taps、20毫克分子的Tris、7克分子的尿素和1毫克分子的EDTA制备而成。缓冲溶液的pH值大约是8.2。
概略说来，聚乳胺处理溶液的制备，是把选择的聚合物(最好是在12％至20％w/v的范围内)溶解于适当的凝胶缓冲溶液中。形成的聚合物溶液被注入毛细管内进行处理，使其停留在毛细管内足够的时间，通常至少大约2小时，最好12小时或一个晚上，然后用适当的贮藏凝胶或在毛细管电泳系统中使用的特定凝胶取代之。聚合物处理溶液的粘度值倾向于相对较高，因优选的、有用的聚合物的分子量是或大于1,000,000。
在制备本发明的成品时，如毛细管具体成品，我们相信在暴露阶段后，最好用具有相当高粘度的凝胶(如被称作贮藏凝胶的线性聚丙烯酰胺)来排出未吸附的PVP。排出过程可这样进行，即用聚丙烯酰胺来机械地替代未吸附的PVP。所述“排出”过程，是实践本发明的优选方式，并且似乎能提供更好的涂层。
实施例1描述了优选实施例的制备。实施例1
用PVP涂层溶液，充满预切割未涂层熔凝硅石毛细管。其方法是，用一个机械泵把溶液推入毛细管大约5分钟。PVP涂层溶液按下述方法制备。
通过溶解于重建缓冲溶液中来配制分子量为1,300,000、浓度为20％(w/v)、在25℃时粘度为3,240cP的PVP聚合物，并使其流过毛细管5分钟，然后在室温(20至25℃)条件下让其滞留在毛细管内大约16小时。涂层溶液是透明的，这表明完全溶解。
上述特定优选的贮藏凝胶被用来替代(推出)PVP涂层溶液。在使用前，贮藏凝胶本身又被分离基质排出和替代。(分离基质是用来分离DNA片断的溶液)。
实施例2
利用CEQ2000 DNA定序器，进行创新处理过的毛细管的不同试验间的稳定性试验。分离条件是8.2kV、40℃、时间为105分钟，分离长度为50cm(总长度为52.8cm)。样品是DNA序列片断，利用pUC-18模板和花青染料标记的二脱氧核苷酸终止剂制成的。表1试验号毛细管实施例98％碱基引入准确截断328个碱基的迁移时间(分钟)多达500碱基时总的截断错误 1 1 561 70.4 1 1 2 564 69.9 1 50 1 574 69 1 50 2 577 68.7 3 100 1 526 72.3 0 100 2 533 71 0
接续上页 150 1 526 71.1 0 150 2 547 79.6 2 200 1 550 68.2 2 200 2 575 66.9 3
用类似于实施例1的方式制备毛细管成品1和成品2。正如数据表明的，两种毛细管表现出良好的涂层稳定性和分离速度。
实施例3
图1是未涂层毛细管和本发明的成品(以类似于实施例1的方式制备而成的)上的pH值与电渗流的关系曲线图。用具有不同pH值的水溶液来注满毛细管，从而测量电渗流。正如图1所示，用本发明方法处理过的毛细管，大大地减少了电渗流。
用p/ACE 2200毛细管电泳系统(Beckman Coulter公司，Fullerton,California)进行实验。毛细管的尺寸如下：总长26cm，分离长度20cm，内径100μm，外径200μm。电渗流(EOF)信号，1％(v/v)的二甲基亚砜(DMSO)水溶液，被电动方式注入毛细管，在2kV条件下10秒钟，然后置于8.1kV作用下测量电渗流。用在线UV检测器在214nm处探测信号。
实施例4
如图2A所示，当用未涂层毛细管及Beckman CEQ 2000 DNA定序器来进行DNA分离时，观察不到任何DNA波峰，因在未涂层毛细管中的强电渗流阻碍DNA分子进入毛细管。然而，从图2B可以看到，当使用本发明方法处理过的成品(以类似于实施例1的方式制备)时，可以观察到DNA序列片断的明显的探测信号。分离条件是8.2kV、40℃、时间为105分钟，分离长度为53.5cm(总长度为56.3cm)。样品是利用pUC-18模板和花青染料标记的二脱氧核苷酸终止剂制成的DNA序列片断。
实施例5
已经证明，本发明的涂层毛细管在pH值为8.2时，至少达到400小时的长期稳定性，运用于DNA序列分离达200次，试验说明了这一点。每次试验的分离时间为2小时。表2给出了稳定性数据。表2
基于CEQ 20001系统，PVA涂层毛细管系统用于染料标记pUCl8片断的DNA序列分离时的长期稳定性研究系统#试验#碱基2,3数为500时，通过碱基准确性标准的百分率 1 376 97.6％ 2 336 99.5％ 3 192 99.5％1 分离时间为104分钟，包括数据分析、填充凝胶、光学校直，每次试验
的总循环时间是2小时。2 毛细管稳定性的规定是，基数为500时，≥95％的试验通过碱基引入准
确性标准。3 基数为500时，碱基引入准确性的标准是≥98％。
实施例6
在制造发明的具体成品期间，如果愿意的话，制品可以更新，这由下述实验说明。首先用DMSO冲洗涂层过的毛细管2小时，然后用去离子水冲洗1小时以除掉涂层。对除掉涂层的毛细管的电渗流进行了试验，试验结果表明毛细管的行为和未涂层的毛细管一样。然后，如以前描述的那样，用PVP溶液重新涂覆毛细管。进行电渗流测量和DNA分离，对重新涂覆的毛细管进行试验。两种结果表明重新涂覆的毛细管与初次涂覆的毛细管的性能一样。
当更换制品相对昂贵时，依据本发明进行重涂或更新是其特别优越之处。例如，在小型仪器中(以前已提供这方面的参考文献)，微薄片可能包括另外的功能，如集成电路等。当愿意时，它们的微孔道(即涂层)可以依据本发明更新。相对于替换整个仪器来说，更新会极大降低成本。
本领域技术人员可以容易地对上述实施方案进行多种修改和改进，或应用于其它领域。本发明申请包括法律允许的各种实施方案与应用。尽管本发明申请按照某些优选实施方案的内容进行描述，本发明的范围不受此限制，而是按照下面权利要求的范围。