一种食用菌液体菌种深层发酵工艺 【技术领域】
本发明涉及一种食用菌液体菌种深层发酵工艺，所述工艺使用复合培养基及深层发酵进行菌种培养。
背景技术
在已有技术中，食用菌液体菌种的生产有多种形式，中国专利00123385.8公开了一种生产食用、药用真菌液体菌种的方法，该方法主要是利用酒精废糟液加入淀粉、蔗糖、酵母粉配制成培养基，先制备一级液体菌种，然后利用该培养基，采用深层发酵工艺，生产食、药用真菌菌种，实现菌种的工厂化生产，既解决了酒精厂排放废水的污染，又使生产菌种的成本大大降低，菌种转代次数减少，菌种质量好，适应食用菌的产业化发展。中国专利01114001.1公开了一种食用菌液体菌种生产方法，该方法的培养基是土豆汁、红糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸锌、VB1、琼脂等，该方法的培养器是在罐体内有空气提升管，提升管下面是空气喷嘴，罐体内有电加热捧。经3-5天培养，生产出合格的菌种。使用上述方法生产的菌种不够理想。因此，需要提出一种新的食用菌液体菌种深层发酵工艺。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种食用菌液体菌种深层发酵工艺，该发酵工艺可实现液体菌种的工业化快速生产，并且菌种无杂菌污染，菌种质量较高。
本发明的目的是由下述技术方案实现的：一种食用菌液体菌种深层发酵工艺，使用母种培养基进行母种制备，将获得的母种植入一级摇瓶中的摇瓶培养基中进行菌种制备，将获得的菌种接种到种子罐内的一级发酵培养基中进行一级发酵培养，然后将一级发酵培养后获得的一级菌种接种到深层发酵罐内地深层发酵培养基中进行深层发酵培养，最终获得食用菌液体菌种；
在所述的母种制备过程中选用母种培养基A或母种培养基B或母种培养基C中的一种进行母种制备；
所述母种培养基A由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 2
酵母膏 0.5
磷酸二氢钾 0.1
硫酸镁 0.1
琼脂 2
水 100；
所述母种培养基B由下述原料的重量比调配而成：
棉子皮细粉 50
玉米粉 49.5
蛋白胨 0.5
水 100；
所述母种培养基C由下述原料的重量比调配而成：
麸皮 38
阔叶木屑 60
葡萄糖 1.5
蛋白胨 0.5
水 100；
所述母种制备步骤如下：
A、将上述母种培养基原料精确称重，充分溶解，搅拌均匀，采用氢氧化钠或盐酸液调节PH至6.5，配制成母种培养基；
B、将所述母种培养基装入制备试管，每支试管装量为8～10克；
C、将所述制备试管放入手提高压锅内加热，经排汽后达到0.108Mpa时维持30分钟灭菌；
D、当温度降至60℃时，将制备试管内的母种培养基调整成斜面，该斜面长度为80～100毫米，逐渐冷却至室温；
E、采用无菌操作，将子实体组织分离后移植到所述试管内的母种培养基斜面上，于25℃-26℃闭光培养7～10天，选取生长健壮正常的尖端纯菌丝进行再次无菌操作移植，将该纯菌丝移植到另一试管内的所述母种培养基斜面上，经25℃～27℃培养7-10天，即成母代专用母种；
在所述的菌种制备过程中选用摇瓶培养基A或摇瓶培养基B或摇瓶培养基C中的一种进行菌种制备；
所述摇瓶培养基A由下述原料的重量比调配而成：
马铃薯 20
葡萄糖 2
蛋白胨 0.2
酵母粉 0.5
磷酸二氢钾 0.1
硫酸镁 0.06
琼脂 0.1
水 100；
所述摇瓶培养基B由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 3
玉米粉 1
豆饼粉 2
酵母粉 1
磷酸二氢钾 0.1
硫酸镁 0.05
琼脂 0.1
水 100；
所述摇瓶培养基C由下述原料的重量比调配而成：
马铃薯 20
麸皮 5
蛋白胨 0.5
蔗糖 1
葡萄糖 1
磷酸二氢钾 0.2
硫酸镁 0.06
维生素B1 0.01
水 100；
所述菌种制备步骤如下：
A、按以上配方精确称量，将马铃薯去皮切片，玉米粉、麸皮、豆饼粉搅拌均匀加五倍水加热至95～100℃浸提30～45分钟，用纱布过滤取滤液加入其它成份不断搅拌使其溶解，并调节PH至6.5，制成摇瓶培养基；
B、取500毫升规格的三角瓶作一级摇瓶，该摇瓶内装入所述摇瓶培养基，每瓶装量100毫升，另取5000毫升规格的三角瓶作二级摇瓶，该摇瓶内装入所述摇瓶培养基，每瓶装量1000毫升；
C、将所述摇瓶置于高压锅内加热，经排汽定压0.108Mpa时维持30分钟灭菌；
D、取20毫升无菌水无菌操作注入所述制备试管中的专用母种中并捣碎，置于无菌匀浆机内以5000转/分钟转速匀浆4分钟，制成匀浆菌种；
E、将所述匀浆菌种10毫升无菌操作接入一级摇瓶；
F、将所述一级摇瓶置于往复式摇瓶机上，在25℃～27℃条件下，以90～100次/分钟频率往复振荡培养5～7天；
G、由一级摇瓶无菌接入二级摇瓶，将所述二级摇瓶置于往复式摇瓶机上，在25℃～27℃条件下，以100～120次/分钟频率往复振荡培养5～7天，制备成菌种；
在所述的一级发酵培养过程中选用一级发酵培养基A或一级发酵培养基B或一级发酵培养基C中的一种进行一级发酵培养；
所述一级发酵培养基A由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 2
土豆淀粉 2
酵母粉 1
奶粉 2
蛋白胨 0.12
磷酸二氢钾 0.15
硫酸镁 0.01
氯化钠 0.1
硫酸锌 0.017
氯化钙 0.004
琼脂 0.1
植物油 0.15
维生素B1 0.005
维生素B2 0.005
水 100；
所述一级发酵培养基B由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 1
蛋白胨 0.5
酵母粉 0.12
磷酸二氢钾 0.15
硫酸镁 0.05
琼脂 0.1
植物油 0.1
微量元素液 0.1
水 100；
所述一级发酵培养基C由下述原料的重量比调配而成：
土豆 10
葡萄糖 1.2
麦麸 4
蛋白胨 0.2
蔗糖 1
磷酸二氢钾 0.15
硫酸镁 0.05
泡敌 0.03
维生素B1 10.01
水 100；
所述一级发酵培养步骤如下：
A、使用深层发酵培养机，检查该培养机的各管道是否严密完好；
B、调定汽压0.14Mpa，活蒸汽消毒灭菌2小时，密闭阀门；
C、将所述一级发酵培养基按配方加热溶解或浸提，经过滤后加入一级发酵罐内，加水定容至标定液位，取样检测并调节PH至6.5；
D、加热消毒灭菌，维持压力0.1Mpa(温度121℃)，35分钟后，降压冷却；
E、一级发酵罐通入无菌空气，维持罐压≥0.02Mpa；
F、罐温降至28℃时，无菌操作，接入所述二级摇瓶制备成的菌种；
G、在温度25℃下培养36小时，加大通气量培养48～60小时，取样检测合格后备用，完成菌种的一级发酵培养；
在所述的深层发酵培养过程中选用深层发酵培养基A或深层发酵培养基B或深层发酵培养基C中的一种进行深层发酵培养；
所述深层发酵培养基A由下述原料的重量比调配而成：
麸皮 5
葡萄糖 3
蛋白胨 0.2
磷酸二氢钾 0.03
硫酸镁 0.05
植物油 0.15
水 100；
所述深层发酵培养基B由下述原料的重量比调配而成：
玉米粉 2
酵母膏 0.2
葡萄糖 1
磷酸二氢钾 0.1
硫酸镁 0.05
氯化钠 0.05
琼脂 0.1
植物油 0.15
水 100；
所述深层发酵培养基C由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 1.2
土豆 10
麦麸 4
蛋白胨 0.2
蔗糖 1
磷酸二氢钾 0.15
硫酸镁 0.05
维生素B1 0.01
泡敌 0.03
水 100；
所述深层发酵培养步骤如下：
A、使用深层发酵培养机，检查该培养机的各管道是否严密完好；
B、启动加热按扭，蒸汽压力至0.14Mpa时活蒸汽消毒灭菌2小时后关闭阀门；
C、按上述培养基配方称取物料，其中固形物料加水后加热浸提，过滤取汁，其中可溶性物料用热水溶解与所述滤汁合并后加入培养机的深层发酵罐内，加水定容，调节PH至6.5；
D、启动加热按扭进行蒸汽消毒灭菌，维持罐压0.108Mpa35分钟，冷却；
E、罐温降至28℃～30℃，关闭冷却水阀，开启接种阀门，用压差法接入经一级发酵培养的菌种；
F、调节深层发酵罐温度至26℃，培养36小时后加大通气量培养36～48小时，获得食用菌液体菌种。
本发明与现有技术相比有如下优点：
1、由于本发明采用液体发酵工艺和工业化生产方式，菌种的生产周期大大缩短。
2、由于本发明的培养基含有多中营养物质，生产的菌种活力强。
3、使用本发明生产的液体菌种，其菌球直径小，单位容积中的菌球密度大。
【具体实施方式】
实施例一：
一种食用菌液体菌种深层发酵工艺，使用母种培养基进行母种制备，将获得的母种植入一级摇瓶中的摇瓶培养基中进行菌种制备，将获得的菌种接种到种子罐内的一级发酵培养基中进行一级发酵培养，然后将一级发酵培养后获得的一级菌种接种到深层发酵罐内的深层发酵培养基中进行深层发酵培养，最终获得食用菌液体菌种；
在所述的母种制备过程中选用母种培养基A或母种培养基B或母种培养基C中的一种进行母种制备；
所述母种培养基A由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 2
酵母膏 0.5
磷酸二氢钾 0.1
硫酸镁 0.1
琼脂 2
水 100；
所述母种培养基B由下述原料的重量比调配而成：
棉子皮细粉 50
玉米粉 49.5
蛋白胨 0.5
水 100；
所述母种培养基C由下述原料的重量比调配而成：
麸皮 38
阔叶木屑 60
葡萄糖 1.5
蛋白胨 0.5
水 100；
本实施例使用母种培养基A，所述母种制备步骤如下：
A、将上述母种培养基原料精确称重，充分溶解，搅拌均匀，采用氢氧化钠或盐酸液调节PH至6.5，配制成母种培养基；
B、将所述母种培养基装入制备试管，该试管直径为20毫米，每支试管装量为8～10克，按常规方法塞棉塞，外包牛皮纸，每10支一捆包扎；
C、将所述制备试管放入手提高压锅内加热，经排汽后达到0.108Mpa时维持30分钟灭菌，然后停止加热，自然降压至大气压时排汽，并用余热烘干棉塞；
D、当温度降至60℃时，将制备试管内的母种培养基调整成斜面，该斜面长度为80～100毫米，逐渐冷却至室温，并防止冷凝水产生；
E、采用无菌操作，将子实体组织分离后移植到所述试管内的母种培养基斜面上，于25℃-26℃闭光培养7～10天，选取生长健壮正常的尖端纯菌丝进行再次无菌操作移植，将该纯菌丝移植到另一试管内的所述母种培养基斜面上，经25℃～27℃培养7-10天，即成母代专用母种；
在所述的菌种制备过程中选用摇瓶培养基A或摇瓶培养基B或摇瓶培养基C中的一种进行菌种制备；
所述摇瓶培养基A由下述原料的重量比调配而成：
马铃薯 20
葡萄糖 2
蛋白胨 0.2
酵母粉 0.5
磷酸二氢钾 0.1
硫酸镁 0.06
琼脂 0.1
水 100；
所述摇瓶培养基B由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 3
玉米粉 1
豆饼粉 2
酵母粉 1
磷酸二氢钾 0.1
硫酸镁 0.05
琼脂 0.1
水 100；
所述摇瓶培养基C由下述原料的重量比调配而成：
马铃薯 20
麸皮 5
蛋白胨 0.5
蔗糖 1
葡萄糖 1
磷酸二氢钾 0.2
硫酸镁 0.06
维生素B1 0.01
水 100；
本实施例使用摇瓶培养基A，所述菌种制备步骤如下：
A、按以上配方精确称量，将马铃薯去皮切片，玉米粉、麸皮、豆饼粉搅拌均匀加五倍水加热至95～100℃浸提30～45分钟，用纱布过滤取滤液加入其它成份不断搅拌使其溶解，并调节PH至6.5，制成摇瓶培养基；
B、取500毫升规格的三角瓶作一级摇瓶，该摇瓶内装入所述摇瓶培养基，每瓶装量100毫升，另取5000毫升规格的三角瓶作二级摇瓶，该摇瓶内装入所述摇瓶培养基，每瓶装量1000毫升，棉塞封口，牛皮纸包扎；
C、将所述摇瓶置于高压锅内加热，经排汽定压0.108Mpa时维持30分钟灭菌，然后停止加热，自然降压至大气压时排汽；
D、取20毫升无菌水无菌操作注入所述制备试管中的专用母种中并捣碎，置于无菌匀浆机内以5000转/分钟转速匀浆4分钟，制成匀浆菌种；
E、将所述匀浆菌种10毫升无菌操作接入一级摇瓶；
F、将所述一级摇瓶置于往复式摇瓶机上，在25℃～27℃条件下，以90～100次/分钟频率往复振荡培养5～7天，所述摇瓶机的往复行程为80毫米；
G、由一级摇瓶无菌接入二级摇瓶，将所述二级摇瓶置于往复式摇瓶机上，在25℃～27℃条件下，以100～120次/分钟频率往复振荡培养5～7天，制备成菌种；
在所述的一级发酵培养过程中选用一级发酵培养基A或一级发酵培养基B或一级发酵培养基C中的一种进行一级发酵培养；
所述一级发酵培养基A由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 2
土豆淀粉 2
酵母粉 1
奶粉 2
蛋白胨 0.12
磷酸二氢钾 0.15
硫酸镁 0.01
氯化钠 0.1
硫酸锌 0.017
氯化钙 0.004
琼脂 0.1
植物油 0.15
维生素B1 0.005
维生素B2 0.005
水 100；
所述一级发酵培养基B由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 1
蛋白胨 0.5
酵母粉 0.12
磷酸二氢钾 0.15
硫酸镁 0.05
琼脂 0.1
植物油 0.1
微量元素液 0.1
水 100；
所述一级发酵培养基C由下述原料的重量比调配而成：
土豆 10
葡萄糖 1.2
麦麸 4
蛋白胨 0.2
蔗糖 1
磷酸二氢钾 0.15
硫酸镁 0.05
泡敌 0.03
维生素B1 0.01
水 100；
本实施例采用一级发酵培养基A，所述一级发酵培养步骤如下：
A、使用深层发酵培养机，该发酵培养机的详细结构参见200420002455.9号实用新型专利说明书，或参见01114001.1号发明专利说明书，在此不详述，检查该培养机的各管道是否严密完好；
B、调定汽压0.14Mpa，活蒸汽消毒灭菌2小时，密闭阀门；
C、将所述一级发酵培养基按配方加热溶解或浸提，经过滤后加入一级发酵罐内(也可称为种子罐)，加水定容至标定液位，取样检测并调节PH至6.5；
D、对一级发酵罐加热消毒灭菌，维持压力0.1Mpa，灭菌温度121℃，灭菌时间35分钟，然后自然降压冷却或水循环冷却；
E、一级发酵罐压降至0.025Mpa时，通入无菌空气，维持罐压≥0.02Mpa；
F、一级发酵罐温度降至28℃时，无菌操作，接入所述二级摇瓶制备成的菌种；
G、调节通气量1∶0.3、温度25℃，培养36小时，通气量1∶0.5～1∶0.8培养48～60小时，取样检测合格后备用，完成菌种的一级发酵培养，其中，所述通气量的比值是指一级发酵罐的罐体容积与单位时间进入罐体的空气体积之比；
在所述的深层发酵培养过程中选用深层发酵培养基A或深层发酵培养基B或深层发酵培养基C中的一种进行深层发酵培养；
所述深层发酵培养基A由下述原料的重量比调配而成：
麸皮 5
葡萄糖 3
蛋白胨 0.2
磷酸二氢钾 0.03
硫酸镁 0.05
植物油 0.15
水 100；
所述深层发酵培养基B由下述原料的重量比调配而成：
玉米粉 2
酵母膏 0.2
葡萄糖 1
磷酸二氢钾 0.1
硫酸镁 0.05
氯化钠 0.05
琼脂 0.1
植物油 0.15
水 100；
所述深层发酵培养基C由下述原料的重量比调配而成：
葡萄糖 1.2
土豆 10
麦麸 4
蛋白胨 0.2
蔗糖 1
磷酸二氢钾 0.15
硫酸镁 0.05
维生素B1 0.01
泡敌 0.03
水 100；
在本实施例中采用深层发酵培养基A，所述深层发酵培养步骤如下：
A、使用深层发酵培养机，检查该机的深层发酵罐的各管道是否严密完好；
B、启动加热按扭，蒸汽压力至0.14Mpa时，对深层发酵罐活蒸汽消毒灭菌2小时后关闭阀门；
C、按上述培养基配方称取物料，其中固形物料加水后加热浸提，温度95～100℃，30～40分钟后以40～60目筛过滤取汁，其中可溶性物料用70-75℃热水溶解与所述滤汁合并后加入培养机的深层发酵罐内，加水定容至标定液位，取样检验，调节PH至6.5；
D、启动加热按扭进行蒸汽消毒灭菌，维持深层发酵罐罐压0.108Mpa，温度121℃，消毒灭菌35分钟，然后开冷却水阀门冷却，待罐压降至0.025Mpa时通入无菌空气并维持罐压≥0.02Mpa；
E、深层发酵罐的罐温降至28℃～30℃，关闭冷却水阀，开启接种阀门，用压差法接入经一级发酵培养的菌种；
F、调节深层发酵罐温度至26℃，罐压0.02Mpa，通气量1∶03立方/分钟；培养36小时后调节通气量至1∶0.5～1∶0.08立方/分钟培养36～48小时，取样合格后获得食用菌液体菌种，其中，所述通气量的比值是指一级发酵罐的罐体容积与单位时间进入罐体的空气体积之比。
本实施例菌种的技术质量标准：
一级摇瓶菌种，培养液由浊变清，颜色淡黄或浅褐色；具有水果香味或杏仁味；菌球细小，颗粒状，静止后占总量30％以上；无杂菌污染；无自溶或少许自溶；PH≤4.5～5.5。
二级摇瓶菌种，培养液由浊变清，淡黄色或浅褐色；具有水果香味或杏仁味；菌球自然沉淀体积为总量50％以上；离心沉淀量≥20％；HP≤4.5～5.5；镜检无杂菌，无自溶。
一级发酵罐菌种，培养液清澈透明，呈淡黄色或浅褐色；具有杏仁香味；菌丝颗粒状，菌球≥500个/毫升，其中直径2毫米菌球占80％，均匀悬浮；离心沉淀菌泥含量≥20％，PH≤4～5.5，OD：1镜检，无杂菌，锁状联合突出，着色深；培养生长旺盛，爬壁能力强，无杂菌；残糖≤2％，碘反应“—”，干基产量：≥1％。
深层发酵罐菌种，培养液清澈透明，呈淡黄色至棕黄色；具有杏仁香味；菌丝颗粒状，菌球≥500个/毫升，菌球直径1～2毫米，均匀悬浮；离心沉淀菌泥含量≥20％；PH≤4～5.5。OD：1，镜检，无杂菌，锁状联合突出，着色深；培养活力强，无杂菌；碘反应“—”。残糖≤2，干基≥1.2％。
本实施例的检测方法：
常规取样每12小时一次；感观指标包括颜色，气味，形态，单位含量，单位体积，产量。
检测方法：颜色：目测。气味：嗅测。
单位含量：稀释法测定或显微镜血球计数法测定，表示方法：“个/毫升”。
单位体积：3000r/Min离心10Min测定，表示方法“体积百分比”。
干基产量：过滤烘干称量法测定，表示方法“克/100毫升”。
理化指标：包括PH，OD，碘反应，残糖。
检测方法：
PH：采用PH计测定。
OD：采用721型分光光度计测定。
碘反应：采用碘溶液测定。
残糖：采用手持糖量计阿贝折光仪测定。
微生物指标及检测方法：
镜检：显微镜检验，正常菌丝透明呈分枝状，锁状联合明显，有横隔。
肉汤培养法：酚红肉汤试管培养基3支，用接种针蘸取发酵液无菌接入试管，于37℃恒温培养，定时观察培养基颜色变化，如变为淡黄色，管底出现絮状沉淀即为杂菌污染，但应结合镜检及接种平皿培养判定。
平皿培养法：无菌条件下，蘸取培养液于肉汤平皿内划线接种(同时3副，并做空白对比)37℃恒温培养，定时灯下检测，其杂菌形态为绒毛状或疏松的棉絮状，孢子印有各种颜色，噬菌体会出现典型的噬菌斑。每隔6h检测一次，如果连续二次出现杂菌，同时镜检也确认具有杂菌形态，则可判定杂菌污染。
发菌试验：
取发酵36小时后的无菌检样，无菌操作接种于鉴定培养基上，经25℃恒温培养，每次不少于3瓶，于12小时内正常萌发者判定为正常。
实施例二：
在本实施例中，所述的母种制备过程中选用母种培养基B，所述的菌种制备过程中选用摇瓶培养基B，所述的一级发酵培养过程中选用一级发酵培养基B，所述的深层发酵培养过程中选用深层发酵培养基B。其它技术内容与实施例一相同。
实施例三：
在本实施例中，所述的母种制备过程中可以选用母种培养基A、母种培养基B、母种培养基C中的任意一种，所述的菌种制备过程中选用摇瓶培养基A、摇瓶培养基B、摇瓶培养基C中的任意一种，所述的一级发酵培养过程中选用一级发酵培养基A、一级发酵培养基B、一级发酵培养基C中的任意一种，所述的深层发酵培养过程中选用深层发酵培养基A、深层发酵培养基B、深层发酵培养基C中的任意一种。其它技术内容与实施例一相同。