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1、10申请公布号CN104059940A43申请公布日20140924CN104059940A21申请号201410278312922申请日20140620C12N15/84200601A01H5/0020060171申请人赵燕地址410128湖南省长沙市芙蓉区农大路1号湖南农业大学生物科学技术学院72发明人赵燕荆风雪张学文傅瑶宋南刘爱云54发明名称一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法57摘要本发明公开了一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，构建IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体，利用根癌农杆菌介导法转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株。对转基因黄花蒿植株进。
2、行PCR基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。本发明获得的转基因黄花蒿中青蒿素含量显著提高，最高可达非转化黄花蒿含量的15倍，本发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。51INTCL权利要求书2页说明书8页序列表3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书8页序列表3页10申请公布号CN104059940ACN104059940A1/2页21一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤步骤。
3、1、构建IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体将IAAM基因与GL2基因启动子重组，克隆到TI质粒的TDNA区PBI121质粒的HINDIII及PSTI位点，以NPTII基因为选择标记基因，载体以PBI121作为出发载体进行改造和载体构建，获得PBI121GL2IAAM的重组TI质粒，提取重组TI质粒做PCR检测和酶切验证；步骤2、工程化根癌农杆菌菌株的制备构建的重组TI质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌，转化后的根癌农杆菌经过筛选、培养至对数生长后期，所述的根癌农杆菌为LBA4404；步骤3、利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株，具体包括以下步骤1）外植。
4、体预培养黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至46CM时剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化；2）黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化将黄花蒿幼苗子叶在培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡30MIN；3）诱导愈伤组织将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转接到MS16BA005NAA30G/L蔗糖7G/L琼脂500MG/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS1固体培养基上培养2D进行诱导抗性愈伤组织；4）抗性再生植株的筛选抗性愈伤组织团生长至34MM大小，取出叶盘采用无菌吸水纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS15MG/L6BA005MG/LNAA500MG。
5、/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温度控制在2224之间，16H/8H进行光暗交替培养；2835D后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至35CM后，将其从愈伤组织基部切下，并将其移入1/2MS05MG/LNAA05MG/LIAA30G/L蔗糖7G/L琼脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在2224之间，16H/8H进行光暗交替培养；根诱导分化14D后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7D，然后移栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株；步骤4、。
6、转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析；步骤5、建立转基因黄花蒿品系筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。2根据权利要求1所述的一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤1中GL2基因启动子获得途径为从GENBANK中的NUCLEOTIDE数据库中获得拟南芥GL2基因核心序列，根据其核苷酸序列设计两条特异性引物，对拟南芥基因组DNA扩增，获得GL2基因启动子。3根据权利要求1所述的一种转IA。
7、AM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤2中电激转化法过程为制备的重组TI质粒DNA01UG与1ML感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。4根据权利要求1所述的一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在权利要求书CN104059940A2/2页3于，所述步骤2中根癌农杆菌筛选与培养过程为将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50UG/ML和利福平20UG/ML的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基2830摇瓶培养过夜至对数生长后期，按110接种到扩大的培养体系继续摇瓶4H。5根据权利要求1所述的一种转IAAM基。
8、因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述步骤4中转基因黄花蒿植株腺毛发育细胞情况及青蒿素含量观察与分析过程为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况。权利要求书CN104059940A1/8页4一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法技术领域0001本发明涉及属于生物技术领域的提高青蒿素含量的方法，特别涉及一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法。背景技术0002青蒿素是从植物黄花蒿中提取的含过氧基团的倍半萜内酯药物，是当今疟疾治疗的最理想药物，能有效治疗对传统药物氯奎产生。
9、抗药性的疟原虫感染。青蒿素主要从黄花蒿中直接提取得到，或提取黄花蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成而成。目前除黄花蒿、青蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。因此黄花蒿仍是青蒿素药物生产的惟一药源。0003虽然黄花蒿系世界广泛分布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。研究证实黄花蒿中合成青蒿素的主要部位是其叶片表面的腺毛细胞。由于其合成部位的特异性，黄花蒿中青蒿素的含量仅占叶片干重的0814，因而使其分离成本高、产量低、废弃物多。野生黄花蒿中青蒿素含量很低，仅为0108。通过杂交和定向育种开展了大量提高黄花蒿中青蒿素含量的尝试，但目前报道的最高青蒿素含量也未超过14，说明了常规选育方法的局。
10、限性。本发明提供一种采用基因工程的植物遗传转化法提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，涉及到生长素合成酶基因在其腺毛细胞中特异表达，是一种运用现代生物技术开展的黄花蒿育种新方法。0004本发明采用的IAAM基因是植物通过色氨酸途径合成生长素IAA的关键酶，该基因最初来自于感染植物的土壤细菌根癌农杆菌，为编码色氨酸单加氧酶的基因，在植物中表达后能利用色氨酸合成吲哚乙酸，即生长素。因此转化IAAM基因后的植物细胞由于能过量合成生长素，使其分裂和分化不受植株整体控制，出现如冠瘿瘤的恶性生长现象。但若使用特异性启动子使IAAM基因在特定的组织或细胞中表达，就有可能促进特定细胞和组织的生长。本发明使用腺毛细胞特。
11、异性启动子，该启动子是来自于拟南芥表皮毛细胞特异性表达的GL2基因启动子，能在黄花蒿中有效作用，保证IAAM基因仅在腺毛细胞中表达，从而不影响植株的整体发育，提高其青蒿素含量。0005根据本发明要解决的技术问题和本发明采用的技术方案进行专利检索，其检索结果如下。0006专利1专利权人为上海交通大学，申请号为2007101704238。本发明是一种生物技术领域的转ADS基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆紫穗槐二烯合成酶ADS基因，构建含ADS基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS基因转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因ADS的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检。
12、测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿泰的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的23倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。说明书CN104059940A2/8页50007专利2专利权人为上海交通大学，申请号为2007101704276。本发明是一种生物技术领域的用RNA干扰提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆鲨烯合酶SQS基因SQS片段，构建含SQSHAIRPIN的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将SQSHAIRPIN基因转入青蒿中获得再生植株，PCR和RTPCR检测目。
13、的基因SQSHAIRPIN的整合和表达情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素合量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，最高达到非转化对照植株的28倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。0008专利3专利权人为上海交通大学，申请号为2011100994117。本发明是一种生物技术领域的转AOC基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本发明从青蒿中克隆丙二烯氧化环化酶AOC基因，构建含AOC基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将AOC基因转入青蒿并再生出植株，PCR检测外源目的基因AO。
14、C的整合情况，高效液相色谱法及蒸发光散射检测器测定转基因青蒿中青蒿素的含量，筛选获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。本发明获得的转基因青蒿中青蒿素的含量显著提高，在非转化普通青蒿含量为153MG/GDW时，同时期转AOC基因青蒿中青蒿素的含量最高达到1017MG/GDW，其含量是非转化青蒿含量的665倍，从而提供了一种提高青蒿中青蒿素含量的方法，为利用转基因青蒿大规模生产青蒿素打下了基础。0009专利4专利权人为中国科学院研究生院，申请号为201110344258X。本发明公开了青蒿BHLH转录因子及其编码基因与应用。本发明所提供的青蒿BHLH转录因子，是如下A）或B）的蛋白质A）由序列表中序。
15、列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；B）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与青蒿素合成相关的由A）衍生的蛋白质。本发明将BHLH转录因子瞬时转化到青蒿植株内过表达，其所调控的青蒿素生物合成代谢中的关键酶表达量大幅度提高，可以用来生产青蒿素。本发明调控青蒿素合成的方法解决了原料的限制问题，且生产工艺简单，有利于青蒿素的大规模工业生产。0010专利5专利权人为上海交通大学，申请号为2011104308107。本发明涉及一种生物技术领域的高青蒿素含量转基因青蒿植株的生产方法，包括如下步骤从青蒿中克隆ADS，CYP71AV1和CPR三个基因，构建含ADS。
16、，CYP71AV1和CPR三基因的植物表达载体，用根癌农杆菌介导，将ADS，CYP71AV1和CPR三基因转入青蒿并再生出植株，筛选，获得青蒿素含量提高的转基因青蒿植株。在非转化普通青蒿含量为643MG/GDW时，本发明得到的转基因青蒿株系中青蒿素的含量最高达到1509MG/GDW，其含量是非转化青蒿含量的235倍，本发明的方法对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。0011通过专利文件的检索，没有发现能够破坏本发明专利新颖性的现有技术，也不存在相互结合能破坏本发明创造性的文件。说明书CN104059940A3/8页6发明内容0012本发明提供一种转IAAM基因提高黄花蒿中青。
17、蒿素含量的方法，通过转基因技术，将生长素合成酶IAAM基因转入黄花蒿，利用特异性GL2基因启动子保证IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞中特异表达，促进黄花蒿腺毛细胞发育和代谢，从而提高其青蒿素含量。本发明建立了稳定提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，为利用黄花蒿大规模生产青蒿素奠定坚实的基础。0013实现以上目的，本发明所采用的技术方案为一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，其包括以下步骤步骤1、构建IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体将IAAM基因与GL2基因启动子重组，克隆到TI质粒的TDNA区PBI121质粒的HINDIII及PSTI位点，以NPTII基因为选择标记基因，。
18、载体以PBI121作为出发载体进行改造和载体构建，获得PBI121GL2IAAM的重组TI质粒，提取重组TI质粒做PRC检测和酶切验证；步骤2、工程化根癌农杆菌菌株的制备构建的重组TI质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌，转化后的根癌农杆菌经过筛选、培养至对数生长后期，所述的根癌农杆菌为LBA4404；步骤3、利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株，具体包括以下步骤1）外植体预培养黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至46CM时剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化；2）黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化将黄花蒿幼苗子叶在培养至对数生长后期的根癌农杆菌。
19、液中侵泡30MIN；3）诱导愈伤组织将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转接到MS16BA005NAA30G/L蔗糖7G/L琼脂500MG/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS1固体培养基上培养2D进行诱导抗性愈伤组织；4）抗性再生植株的筛选抗性愈伤组织团生长至34MM大小，取出叶盘采用无菌吸水纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS15MG/L6BA005MG/LNAA500MG/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温度控制在2224之间，16H/8H进行光暗交替培养；2835D后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤。
20、部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至35CM后，将其从愈伤组织基部切下，并将其移入1/2MS05MG/LNAA05MG/LIAA30G/L蔗糖7G/L琼脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在2224之间，16H/8H进行光暗交替培养；根诱导分化14D后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7D，然后移栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株；步骤4、转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测，并对转基因黄花蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析；步骤5、建立转基因黄花蒿品系筛。
21、选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。0014所述步骤1中GL2基因启动子获得途径为从GENBANK中的NUCLEOTIDE数据库中说明书CN104059940A4/8页7获得拟南芥GL2基因核心序列，根据其核苷酸序列设计两条特异性引物，对拟南芥基因组DNA扩增，获得GL2基因启动子。0015所述步骤2中电激转化法过程为制备的重组TI质粒DNA01UG与1ML感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。0016所述步骤2中根癌农杆菌筛选与培养过程为将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50UG/ML和利福平20UG/。
22、ML的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基2830摇瓶培养过夜至对数生长后期，按110接种到扩大的培养体系继续摇瓶4H。0017所述步骤4中转基因黄花蒿植株腺毛发育细胞情况及青蒿素含量观察与分析过程为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况。0018综上所述，本发明的有益效果如下本发明提供的一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法，通过转基因技术，将生长素合成酶IAAM基因转入黄花蒿，利用特异性GL2基因启动子保证IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞中特异表达，促进黄花蒿腺。
23、毛细胞发育和代谢，从而提高其青蒿素含量。在普通非转化黄花蒿含量为1053MG/GDW时，转IAAM基因黄花蒿植株中青蒿素的含量最高达到158MG/GDW，其含量是非转化黄花蒿含量的15倍，该发明对于为青蒿素的规模化生产提供高产、稳定新药源具有重要意义。具体实施方式0019为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。0020下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等分子克隆实验室手册（NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。00。
24、21实施例1IAAM基因的获取从GENBANK中的NUCLEOTIDE数据库中获得编码色氨酸单加氧酶的IAAM基因序列（登录号为U839871），送深圳华大基因公司合成该基因PMD18IAAM，并将该基因PMD18IAAM转化至ECOLIDH5中保存。0022具体操作步骤为1）通过设计引入BAMHI和PSTI酶切位点的IAAM基因特异性引物上游引物IAAMUP5GCGGATCCATGTCAGCCTCATCTCTTCT3下游引物IAAMDN5AACTGCAGTTAATTTCTATTGCGGTAGTTATATC32）以PMD18IAAM为模板，IAAMUP和IAAMDN为引物，利用PCR技术扩增I。
25、AAM基因。PCR反应体系为PMDIAAM质粒（约100NG）1UL，10BUFFER25UL，DNTPS（10MMOL/L）1UL，MGCL2（25MMOL/L）15UL，IAAMUP（10UMOL/L）1UL，IAAMDN（10UMOL/L）1UL，TAQDNA聚合酶（1U/UL）1UL，补DDH2O至25UL。反应程序为95预变性4MIN，94变性1MIN、62退火1MIN、72延伸25MIN、共35个循环，最后72延伸10MIN。00233）PCR产物经1琼脂糖凝胶电泳检测、切胶回收后，用BAMHI和PSTI双酶切，酶说明书CN104059940A5/8页8切体系为IAAM基因10UL。
26、，10BUFFERTANGO2UL，BAMHI（10U/UL）1UL，PSTI（10U/UL）1UL，补DDH2O至20UL。37酶切12H，1琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段。0024本实施例合成的IAAM基因为通过转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量提供了一个重要关键酶基因。0025实施例2构建IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体从GENBANK中的NUCLEOTIDE数据库中获得拟南芥GL2基因核心序列（登录号L328731）根据其核苷酸序列设计以下两条特异性引物上游引物为1GL25CCCAAGCTTTTTCCTTCACTATACGTCTTCG3下游引物为2GL25CGCGGATC。
27、CCAAATCCTGTCCCTAGCTAG3对拟南芥基因组DNA扩增，获得GL2启动子片段。将IAAM基因与GL2基因启动子重组，克隆到TI质粒的TDNA区PBI121质粒的HINDIII及PSTI位点，以NPTII基因为选择标记基因，载体以PBI121作为出发载体进行改造和载体构建，获得PBI121GL2IAAM的重组TI质粒，提取质粒做PRC检测和酶切验证。0026本实施例获得了GL2启动子片段，将IAAM基因与GL2基因启动子重组，构建了IAAM基因在腺毛细胞特异表达的载体，保证IAAM基因仅在黄花蒿腺毛细胞中表达，从而不影响植株的整体发育，提高其青蒿素含量。0027实施例31工程化根癌。
28、农杆菌菌株的制备构建的重组TI质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404，电激转化法过程为制备的重组TI质粒DNA01UG与1ML感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50UG/ML和利福平20UG/ML的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基28摇瓶培养过夜至对数生长后期，按110接种到扩大的培养体系继续摇瓶4H。结果表明，构建的IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。00282利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株1）外植体预培养黄花。
29、蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至4CM时剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化；2）黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化将黄花蒿幼苗子叶在实施例3中得到的培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡30MIN；3）诱导愈伤组织将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转接到MS16BA005NAA30G/L蔗糖7G/L琼脂500MG/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS1固体培养基上培养2D进行诱导抗性愈伤组织；4）抗性再生植株的筛选抗性愈伤组织团生长至3MM大小，取出叶盘采用无菌吸水纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS15MG/L6BA005MG/LNAA500MG。
30、/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温度控制在22之间，16H/8H进行光暗交替培养；35D后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至5CM后，将其从愈伤组织基说明书CN104059940A6/8页9部切下，并将其移入1/2MS05MG/LNAA05MG/LIAA30G/L蔗糖7G/L琼脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在22之间，16H/8H进行光暗交替培养；根诱导分化14D后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7D，然后移栽至营养土中生长得到。
31、转基因黄花蒿植株。00293转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测；并对转基因青蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，具体操作为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况。00304建立转基因黄花蒿品系筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。0031实施例41工程化根癌农杆菌菌株的制备构建的重组TI质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404，电激转化法过程为制备的重组。
32、TI质粒DNA01UG与1ML感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50UG/ML和利福平20UG/ML的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基30摇瓶培养过夜至对数生长后期，按110接种到扩大的培养体系继续摇瓶4H。结果表明，构建的IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。00322利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株1）外植体预培养黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至6CM时剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化；2）黄花蒿幼苗子。
33、叶与根癌农杆菌的共培侵染转化将黄花蒿幼苗子叶在实施例3中得到的培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡30MIN；3）诱导愈伤组织将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转接到MS16BA005NAA30G/L蔗糖7G/L琼脂500MG/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS1固体培养基上培养2D进行诱导抗性愈伤组织；4）抗性再生植株的筛选抗性愈伤组织团生长至4MM大小，取出叶盘采用无菌吸水纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS15MG/L6BA005MG/LNAA500MG/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温度控。
34、制在24之间，16H/8H进行光暗交替培养；28D后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤部分，插入MS2培养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至5CM后，将其从愈伤组织基部切下，并将其移入1/2MS05MG/LNAA05MG/LIAA30G/L蔗糖7G/L琼脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在24之间，16H/8H进行光暗交替培养；根诱导分化14D后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7D，然后移栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株。00333转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察说明书CN104059940A7/8页10提取转基因黄花蒿植株叶片DN。
35、A，PCR法进行基因扩增检测；并对转基因青蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，具体操作为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光体视显微镜下进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况。00344建立转基因黄花蒿品系筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。0035实施例51工程化根癌农杆菌菌株的制备构建的重组TI质粒通过电激转化法转化根癌农杆菌LBA4404，电激转化法过程为制备的重组TI质粒DNA01UG与1ML感受态根癌农杆菌混合后置于电激杯，电激转化仪以细菌转化模式进行电激转化。。
36、将转化后的根癌农杆菌铺于含卡那霉素50UG/ML和利福平20UG/ML的YEB培养基上筛选，筛选得到的根癌农杆菌在YEB液体培养基29摇瓶培养过夜至对数生长后期，按110接种到扩大的培养体系继续摇瓶4H。结果表明，构建的IAAM基因在黄花蒿腺毛细胞特异表达的载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。00362利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株1）外植体预培养黄花蒿种子经消毒后在1/2MS培养基上发芽成苗，待苗长至5CM时剪取黄花蒿幼苗子叶用于转化；2）黄花蒿幼苗子叶与根癌农杆菌的共培侵染转化将黄花蒿幼苗子叶在实施例3中得到的培养至对数生长后期的根癌农杆菌液中侵泡3。
37、0MIN；3）诱导愈伤组织将共培侵染转化后的黄花蒿子叶以消毒后的MS培养液冲洗3遍，转接到MS16BA005NAA30G/L蔗糖7G/L琼脂500MG/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS1固体培养基上培养2D进行诱导抗性愈伤组织；4）抗性再生植株的筛选抗性愈伤组织团生长至35MM大小，取出叶盘采用无菌吸水纸吸干其表面多余水分，将叶盘平放到MS15MG/L6BA005MG/LNAA500MG/L羧苄青霉素20MG/L卡那霉素的MS2培养基上诱导分化出芽，具体过程为愈伤组织稍微压入培养基，温度控制在23之间，16H/8H进行光暗交替培养；32D后诱导出抗性丛生芽，切下带芽愈伤部分，插入MS2培。
38、养基继续培养至茎分化和长高，待抗性芽生长至4CM后，将其从愈伤组织基部切下，并将其移入1/2MS05MG/LNAA05MG/LIAA30G/L蔗糖7G/L琼脂的MS3生根培养基中诱导其生根，此时对每一颗阳性苗进行编号，温度控制在23之间，16H/8H进行光暗交替培养；根诱导分化14D后，将分化苗移至消毒蛭石中，培养室内炼苗7D，然后移栽至营养土中生长得到转基因黄花蒿植株。00373转基因黄花蒿植株的PCR检测和腺毛细胞发育观察提取转基因黄花蒿植株叶片DNA，PCR法进行基因扩增检测；并对转基因青蒿腺毛发育细胞情况及青蒿素含量进行观察与分析，具体操作为取转基因黄花蒿幼嫩叶片，置于荧光体视显微镜下。
39、进行荧光显微观察，统计单位叶面积的腺毛细胞数，与对照非转基因黄花蒿比较，可以估测青蒿素含量提高情况。00384建立转基因黄花蒿品系说明书CN104059940A108/8页11筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，通过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系。0039以上实施例利用所构建的根癌农杆菌菌株转化黄花蒿，获得经PCR检测的转基因黄花蒿植株。并通过对黄花蒿腺毛细胞发育情况进行观察，结果表明本发明中转IAAM基因显著提高了黄花蒿中青蒿素的含量，转IAAM基因黄花蒿中青蒿素的含量最高可达158MG/GDW，是非转化黄花蒿含量的15倍。通过筛选青蒿素含量显著提高的转基因黄花蒿植株，。
40、经过组织培养繁殖建立转基因高青蒿素含量的黄花蒿品系，为规模化生产青蒿素提供了一种可行方法。0040以上对本发明所提供的一种转IAAM基因提高黄花蒿中青蒿素含量的方法进行了详细介绍，本文中对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。说明书CN104059940A111/3页12赵燕一种转IAAM基因提高青蒿中青蒿素含量的方法1PATENTINVERSION3312268DNA根癌农杆菌（AGROBACTERI。
41、UMTUMEFACIENS）1ATGTCAGCCTCATCTCTTCTTGATAAACAATGCGATCATTTCTCTACCAAAATTGTGGAT60CTGATAATGGTCGACAAGGCTGATGAGTTGGACCGCCGCGTTGCCGCAGCCTTCTCAGAA120CGAGAAGCTTCGAGGGAAAGAAGAATTAGTCAAATTTCCGGCGAGTGCAACGCTGGGTTA180GCTTGCAAAAGGCTGGCCGACGGTCGCTTTCCGGAGATATCAGCCGGTCAGAGGGTCGCA240GTCCTCTCCGCTTACATCTATGTTGGCGAGGAAA。
42、TTCTGAGGTGGATACTCGAACCAGAA300GCTTCGGTGCGAACAAGAGTGAGTGGTCTCGTTGCCATCGACCTTGCACCATCTTGCATG360GATATTTCCAGAGCTCAACTTCTCCAAACCATGAATTTGCTGAGTGGTAAAAGATGTGCA420CCCAGCGACCTTAGTCATTTCGTGGCCATTTCAATCTCTGAGACTGCCCGCTCCCGAACC480CTGCAAATGGCGCCGTACGAAGAAGGCTCGTTGAAAAGCGTTACCGGGTTTACCGTAATC540ATTGAAGAGGCAGTACCAT。
43、TTGACATGGTAGCTTATGGTCGAAACCTGATGCTGAAAGCC600TCGGCAGGGTCCTTTCCAACGATCGACTTGCTCTATGACTACAGATTGTTTCTCGACAAA660TGTTCCGATAGTGGGCGGATCGGCTTCTTTCCGGAAGATGTTCCCAGGCCAAAAGTAGCG720序列表CN104059940A122/3页13GTCATTGGGGCTGGCATTTCCGGGCTCGTGGTGGCAAGCGAACTGCTTCATGCTGGCGTA780GACGATGTTACAATATATGAAGCAGGTGATCGGGTTGGAGGTAA。
44、GCTTTGGTCACATGCC840TTCAAGGACGCTCCGGGCGTCGTGGCCGAAATGGGGGCGATGCGATTTCCTCCTGCTGCA900TCGTGCTTGTTTTTCTTCCTCGAGCGATACGGTCTGTCTTCGATGAGGCCGTTCCCAAAT960CCCGGCACAGTCGACACTGACTTGGTCTACGAGGGTTGCCGATACATGTGGAAAGCCGGG1020CAGCAGCCACCGAAGTTGTTCCATCGCGTTTACAGCGGGTGGCATGCGTTCTTGAAGGAC1080GGTTTCCTTGAGGGAGATATTGTGTTG。
45、GCGTCGCCTGATGCTATCACTGAGGCCTTGAAA1140TCAGGGGACATTAGGCGGGCTCATGACTCCTGGCAAATTTGGCTGAACCGTTTCGGGAGG1200GAGTCGTTCTCCTCAGCGATAGAGAGGATCTTTCTGGGCACGCATCCTCCTGGTGGAGAA1260ACATGGAGTTTCCCTCATGATTGGGACCTATTCAAGCTAATGGGAATAGGATCTGGCGGG1320TTTGGTCCAGTTTTTGAAAGCGGGTTTACTGAGATCCTTCGCTTGGTCATAAACGGATAT1380GAAGAAA。
46、ATCAGCGGATGTGCTCTGAAGGAATCTCAGAACTTCCACGTCGAATAGCCTCT1440CAAGTGGTTAACGGTGTGTCTGTAAGCCAGCGTATACGCCATGTTCAAGTCAGGGCGATC1500GAGAAGGAAAAGACAAAAATAAAGATAAGGCTTAAGAGCGGGATATCAGAACTTTATGAT1560AAAGTGGTGGTTACATCTGGACTCGCAAATATCCAACTCAGGCATTGTCTGACATGCGAT1620ACCACCATTTTTCGTGCACCAGTGAACCAAGCGGTTGATAACAGCCACATG。
47、ACAGGCTCT1680TCAAAACTCTTCCTGCTGACTGAACGAAAATTTTGGTTTGACCATATGCTCCCGTCCTGT1740GTCCTCATGGACGGGTTCGCAAAAGCAGTCTATTGCCTGGACTATGAGCCGCAGGATCCG1800AACGGTAAAGGTCTGGTGCTCATCAGTTATACATGGGAGGACGACTCCCACAAGCTATTG1860GCGGTCCCCGACAAAAAAGAGAGATTATGTCTGCTGCGTGACGCAATTTCAAAATCTTTC1920序列表CN104059940A133/3页14CCGGTGTT。
48、TGCCCAGCATCTAGTTCCCGCCTGCGCTGATTACGACCAAAATGTTGTTCAA1980CATGATTGGCTTACAGACGAGAATGCCGGCGGACGTTTCAAACTTAACCGACGCGGCGAA2040GATTTTTATTCTGAAGAACTTTTCTTTCAAGCGCTGGACACGACTAATGATACTGGAGTT2100TACTTGGCGGGTTGCAGTTGTTCCTTCACCGGTGGATGGGTGGAGGGCGCTATTCAGACC2160GCGTGTAACGCCGTCTGCGCAATTATCCACAATTGTGGAGGCATTTTAGCGAAGGACAAT2220CCTCTTAAACACCCTTGGAAGAGATATAACTACCGCAATAGAAATTAA2268序列表CN104059940A14。