包含树突细胞-特异性细胞间黏附因子-3攫取非整合素 的医药组合物和清洁用品及其用途 【技术领域】
本发明涉及一种包含树突细胞-特异性细胞间黏附因子-3攫取非整合素(dendritic cell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin，DC-SIGN)的医药组合物和清洁用品以及其应用于减低严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS CoV)感染力的方法、用于决定个体中是否存在严重急性呼吸道综合症冠状病毒的方法和用于决定检体中是否存在严重急性呼吸道综合症冠状病毒的套组。
背景技术
树突细胞(dendritic cells)有助于发展致病原特异性免疫反应，未成熟的树突细胞位于身体周边黏膜组织中，且监测致病原而为免疫的感应器，经由传递讯息给淋巴球而诱导有效的免疫反应以消灭致病原，一旦树突细胞感应且捕捉到致病原则会经过相当大的转变，在由周边组织移动到淋巴结的过程期间树突细胞发展成熟，在这其间树突细胞处理致病原且表现共同刺激分子而处于有效的T细胞刺激期，经由树突细胞辨认致病原是诱发保护性的免疫力最重要的步骤之一。
树突细胞表现致病原辨认接受器，包括能辨认由致病原表现分子的类Toll接受器(Toll-like receptor，TLR)和C型植物凝血素(C-typelectin)。树突细胞-特异性细胞间黏附因子-3攫取非整合素(dendriticcell-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin，DC-SIGN)被发现与选殖的HIV-1外壳-结合C型植物凝血素(HIV-1 envelope-binding C-typelectin)相同，而为树突细胞特异性的黏着接受器，因而发现了第一种与DC-SIGN互相作用的致病原为HIV，包括HIV-1、HIV-2和SIV(simianimmunodeficiency virus)。
【发明内容】
研究指出树突细胞-特异性细胞间黏附因子-3攫取非整合素(DC-SIGN)为一些病毒的接受器，包括HIV-1、HIV-2、Ebola病毒、巨细胞病毒、C型肝炎病毒和登革热病毒，DC-SIGN连接不同的醣类结构，例如包含甘露糖的醣结合物和包含果糖的Lewis血液-族群的抗原(Lex，Ley，Lea和Leb)，显示DC-SIGN的醣类特异性结合可控制多样化地致病原辨认形态。
DC-SIGN辨认由不同病毒所表现的病毒外壳醣蛋白，其包含相对大量的N-连接的醣类，特别是对HIV-1和Ebola病毒；不同醣化程度的外壳醣蛋白影响DC-SIGN与之结合的能力且增加感染标的细胞的能力，其它病毒(例如水泡型口炎病毒(vesicular stomatitis virus))在其细胞表面表现高度醣化的醣蛋白并不能与DC-SIGN互相作用，表示DC-SIGN结合的特异性有不同程度。
在本发明的一优选具体实例中，本发明发现SARS冠状病毒(SARS CoV)可与DC-SIGN结合，继而促使SARS病人于外围血液和第二级淋巴组织中消耗T细胞，更进一步，本发明发现可溶性的DC-SIGN在固态物质上可以至少部分中和SARS CoV的感染力以及减低其散布性；SARS CoV会污染木材、物质或塑胶的表面，因此可溶性的DC-SIGN应用于家庭或公开地区的墙壁、栏杆的表面可提供对抗SARS CoV散布的保护。
DC-SIGN的DNA序列已经解开，其GeneBank编号为AF290886(cDNA：10-1224)，DC-SIGN的全长氨基酸序列为SEQ ID NO.1。
在本发明的优选具体实施方案中，纯化的可溶性DC-SIGN有以下三种形式：
1、C-端标签
可溶性的DC-SIGN的DNA序列为SEQ ID NO.2，在制作时加入BamHI和XhoI转接子插入质粒pSecTag2/Hygro A中。
可溶性的DC-SIGN的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
2.N-端标签-1
猪的CTLA4信号肽(signal peptide)序列：
HindIII Kozak起始码
AAGCTTACTAGTCCGCCATGGCTTGTTCTGGACTCCGGAGCCATGGGGCTTGGCTGGAGCTTACTTCTAGGACCTGGCCCTGTACAGCTCTGTTTTCTCTTCTCTTCATCCCTGTCTTCTCCAAAGAATTCCATCACCACCATCACCACGGTGGCGGG EcoRI 6xHis
将之接续部分DC-SIGN(该部分DC-SIGN的DNA序列为SEQ ID NO.4)，而形成的DNA序列为SEQ ID NO.5，制作时插入质粒pcDNA3中，如图1所示。
3.N-端标签-2
老鼠的Igκ-链V-J2-C信号肽(signal peptide)序列：
NheI Kozak起始码
GCTAGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGACGCGGCCCATCACCACCATCACCACGGTGGCGGG
6xHis
所接续的部分DC-SIGN的DNA序列为SEQ ID NO.4，而形成DNA序列为SEQ ID NO.6，制作时插入质粒pcDNA 3.1/Hygro中，如图2所示。
由N-端标签-1和N-端标签-2所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
在本发明的优选具体实施方案中，本发明提供了一种用于治疗严重急性呼吸道综合症(SARS)的医药组合物，其包含治疗有效量的树突细胞-特异性细胞间黏附因子-3攫取非整合素(DC-SIGN)或其生物功能等效物，以及医药上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
本发明所提供的医药组合物中，所述DC-SIGN生物功能等效物优选为部分DC-SIGN，更优选地，该DC-SIGN生物功能等效物为DC-SIGN四聚体。
本发明所提供的上述医药组合物中，优选所述DC-SIGN生物功能等效物为可溶性；优选地，该DC-SIGN生物功能等效物的核苷酸序列为SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6；更优选地，该DC-SIGN生物功能等效物的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
在本发明的优选具体实施方案中，本发明还提供了一种清洁用品，其中包括DC-SIGN或其生物功能等效物。
优选地，本发明所提供的清洁用品中，所述DC-SIGN生物功能等效物为部分DC-SIGN，更优选地，该DC-SIGN生物功能等效物为DC-SIGN四聚体。
本发明所提供的清洁用品中，优选所述DC-SIGN生物功能等效物为可溶性；优选地，该DC-SIGN生物功能等效物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6；更优选地，该DC-SIGN生物功能等效物的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
在本发明的优选具体实施方案中，本发明还提供了一种减低严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS CoV)感染力的方法，包括将SARS CoV接触DC-SIGN或其生物功能等效物。
优选地，本发明所提供的方法中，所述DC-SIGN生物功能等效物为部分DC-SIGN，更优选地，该DC-SIGN生物功能等效物为DC-SIGN四聚体。
优选地，本发明所提供的方法中，所述DC-SIGN生物功能等效物具有可溶性；优选地，该DC-SIGN生物功能等效物的核苷酸序列为SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6；优选地，该DC-SIGN生物功能等效物的氨基酸序列为SEQ ID NO.3。
在本发明的优选具体实施方案中，本发明还提供了一种用于决定个体中是否存在严重急性呼吸道综合症冠状病毒的方法，其包括下列步骤：
(a)提供检体，该检体来自待测个体；
(b)由(a)检体中侦测与DC-SIGN或其生物功能等效物结合的程度；
(c)根据(b)所测得的程度决定是否存在严重急性呼吸道综合症冠状病毒。
优选地，本发明所提供的方法中，在步骤(b)可利用ELISA方法侦测与DC-SIGN或其生物功能等效物结合的程度。
例如，在本发明的一优选具体实施方案中，本发明所述的方法为：
(a)提供痰液；
(b)将痰液与固定有DC-SIGN的物质接触，经由加入可侦测DC-SIGN与严重急性呼吸道综合症冠状病毒结合结构的抗体或加入一组可侦测DC-SIGN与严重急性呼吸道综合症冠状病毒结合结构的抗体而测得DC-SIGN与严重急性呼吸道综合症冠状病毒结合的程度；
(c)由所测得的DC-SIGN与严重急性呼吸道综合症冠状病毒结合的程度决定检体中是否存在严重急性呼吸道综合症冠状病毒。
其中，所述制备具有辨认或侦测DC-SIGN与严重急性呼吸道综合症冠状病毒结合结构的抗体或一组抗体的方法为本领域技术人员所熟知的方法。
另一方面，在本发明的优选具体实施方案中，本发明还提供了一种用于决定检体中是否存在严重急性呼吸道综合症冠状病毒的套组，其包含一组可侦测检体中与DC-SIGN或其生物功能等效物结合程度的物质，利用所测得的值决定检体中是否存在严重急性呼吸道综合症冠状病毒。
优选地，所述可侦测检体中与DC-SIGN或其生物功能等效物结合程度的物质可以是具有辨认DC-SIGN与严重急性呼吸道综合症冠状病毒结合结构的抗体或一组具有辨认DC-SIGN与严重急性呼吸道综合症冠状病毒结合结构的抗体，藉由辨认DC-SIGN与严重急性呼吸道综合症冠状病毒结合结构而测得检体中与DC-SIGN或其生物功能等效物结合的程度。
本发明中，术语“树突细胞-特异性细胞间黏附因子-3攫取非整合素(DC-SIGN)”意指具有与自然存在的DC-SIGN蛋白质相似的氨基酸序列的蛋白质，若文中的树突细胞-特异性细胞间黏附因子-3攫取非整合素(即DC-SIGN)前没有特别的标示，则表示为所有形式的DC-SIGN。
术语“生物功能等效物”意指该生物功能相等性的物质在生物功能上与DC-SIGN的功能相等，优选地，该生物功能等效物为可溶性的DC-SIGN，更优选地，该生物功能等效物为DC-SIGN的颈区域(neck domain)与C-植物凝血素区域。
术语“治疗有效量”意指当需要接受治疗的人所接受医药组合物的量足够达成有效的治疗，该治疗有效量根据接受者与所需接受治疗疾病状况的不同而有差异性，根据接受者的重量及年龄与疾病情况的严重度等等，本领域的技术人员可决定治疗有效量。
术语“医药上可接受”意指载体、稀释剂或赋形剂为必须与组合物其它成分可相容，并且不会有害于接受者。
术语“检体”意指任何可能包含严重急性呼吸道综合症冠状病毒的检体，优选地，指可侦测或确定存在严重急性呼吸道综合症冠状病毒的检体，更优选地，指生物检体，包括痰液。
【附图说明】
图1为N-端标签-1的质粒图谱。
图2为N-端标签-2的质粒图谱。
图3为树突细胞暴露于SARS CoV后经由实时RT-PCR侦测病毒数结果图表。
图4为有或没有转染DC-SIGN的THP-1细胞暴露于SARS CoV后经由实时RT-PCR侦测病毒相对数目结果图表。
图5为检测经由DC-SIGN吸收后SARS CoV的感染力结果图表。
【具体实施方式】
下列实施例用于示范说明本发明。这些实施例仅用于指示如何实施本发明的材料及方法，并不限制本发明的范围。
实施例1：DC-SIGN与SARS CoV的关系
1.1、方法
将纯化的树突细胞分别前处理抗DC-SIGN抗体的同型抗体、抗DC-SIGN抗体以及不进行前处理，之后暴露于SARS CoV经过24小时，经由实时(real-time)RT-PCR侦测病毒数。
另外将DC-SIGN转染至THP-1细胞，将有转染DC-SIGN的THP-1细胞或亲代THP-1细胞前处理抗DC-SIGN抗体或没有前处理抗DC-SIGN抗体，之后暴露于SARS CoV经过24小时，检测CoV聚合酶RNA(基因P)的表现，并用β-肌动蛋白的表现标准化CoV聚合酶RNA(基因P)的表现。
1.2、结果
图3显示经由实时RT-PCR侦测病毒数的结果，结果为三次实验的平均±标准差；由结果可看出树突细胞会与SARS CoV结合，而前处理抗DC-SIGN抗体后，由树突细胞上侦测到SARS CoV的量降低至与没有暴露SARS CoV的量相当接近，证明SARS CoV藉由DC-SIGN而结合至树突细胞上，即DC-SIGN为SARS CoV的接受器。
图4显示THP-1细胞CoV聚合酶RNA(基因P)的表现，结果为三次实验的平均±标准差；由结果显示转染表现有DC-SIGN的THP-1细胞表现CoV基因P的量将近没有转染DC-SIGN的THP-1细胞表现CoV基因P的量的六倍，而将转染表现有DC-SIGN的THP-1细胞前处理DC-SIGN抗体后所表现CoV基因P的量几乎回复至与没有DC-SIGN的THP-1细胞的表现量一样。
实施例2：SARS CoV前处理DC-SIGN的感染力
2.1、制备可溶性DC-SIGN四聚体
可溶性DC-SIGN使用相同双功能性试剂双(琥珀酰亚胺磺酸)(sulfosuccinimidyl)受质于表现和缺乏10nM CaCl2室温下一小时，加入内含1％β-乙基硫醇(mercaptoethanol)的两倍的SDS明胶装载缓冲液停止反应，并加热至100℃经过5分钟，DC-SIGN四聚体复合物可结合至塑胶、木材和固体物质上，而其中C-植物凝血素区域朝外凸出。
2.2、方法
将96孔盘涂覆不同浓度的可溶性DC-SIGN四聚体复合物，将0.1MolSARS CoV置放于96孔盘经过整夜后，隔天收集病毒的上清液并使用于感染FRhK-4细胞，经过感染24小时，经由实时RT-PCR侦测FRhK-4细胞内的病毒RNA，即收集受感染的细胞，清洗过后利用QIAamp RNA单离套组(Roche Molecular Biochemicals，USA)萃取出全部的RNA，经由使用RNA H+反转录酶(Life Technologies，USA)和随机引物合成cDNA，2μl的RT产物(模版)进行实时PCR，使用的引物最终浓度为900nM，引物序列：
正向引物：5’-GCATGAAATTGCCTGGTTTCAC-3’
反向引物：5’-GCATTCCCCTTTGAAAGTGTC-3’
使用的荧光探针最终浓度为250nM，序列为：
FAM-AGCTACGAGCACCAGACACCCTTCGAAA-TRMA
将引物与探针混合并使用ABI7900序列侦测系统(sequence detectionsystem)进行实时定量，其中PCR的条件为50℃进行5分钟；95℃进行10分钟；95℃进行15秒，61℃进行1分钟，循环40次。
2.3、结果
图5显示将SARS CoV前处理DC-SIGN后的感染力，随着前处理的DC-SIGN浓度愈高，SARS CoV感染FRhK-4细胞的能力愈低。
其中SARS CoV株为HKU-66078，其于GenBank的编号为AY304494。
虽然本发明已叙述特定的优选具体实施例，但必须了解的是本发明不应被限制于这些特定具体实施例上。对于本领域的技术人员而言，在不会偏离本发明的范围与精神内，可作的不同修正及变化均应包含于本发明的保护范围内。
序列表
<110>台湾葛迪夫生物科技股份有限公司
<120>包含树突细胞-特异性细胞间黏附因子-3攫取非整合素的医药组合物和清洁用品及其用途
<130>F0403067G
<160>6
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>404
<212>PRT
<213>人类
<400>1
Met Ser Asp Ser Lys Glu Pro Arg Leu Gln Gln Leu Gly Leu Leu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Gln Leu Arg Gly Leu Gly Phe Arg Gln Thr Arg Gly Tyr Lys
20 25 30
Ser Leu Ala Gly Cys Leu Gly His Gly Pro Leu Val Leu Gln Leu Leu
35 40 45
Ser Phe Thr Leu Leu Ala Gly Leu Leu Val Gln Val Ser Lys Val Pro
50 55 60
Ser Ser Ile Ser Gln Glu Gln Ser Arg Gln Asp Ala Ile Tyr Gln Asn
65 70 75 80
Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Ser Glu Lys Ser Lys
85 90 95
Leu Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Gly
100 105 110
Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Leu Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr
115 120 125
Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Leu Gln
130 135 140
Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Trp Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu
145 150 155 160
Pro Glu Lys Ser Lys Met Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu
165 170 175
Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile
180 185 190
Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu
195 200 205
Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala
210 215 220
Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln
225 230 235 240
Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Glu Arg Leu Cys His Pro Cys
245 250 255
Pro Trp Glu Trp Thr Phe Phe Gln Gly Asn Cys Tyr Phe Met Ser Asn
260 265 270
Ser Gln Arg Asn Trp His Asp Ser Ile Thr Ala Cys Lys Glu Val Gly
275 280 285
Ala Gln Leu Val Val Ile Lys Ser Ala Glu Glu Gln Asn Phe Leu Gln
290 295 300
Leu Gln Ser Ser Arg Ser Asn Arg Phe Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp
305 310 315 320
Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly Ser Pro Leu Leu
325 330 335
Pro Ser Phe Lys Gln Tyr Trp Asn Arg Gly Glu Pro Asn Asn Val Gly
340 345 350
Glu Glu Asp Cys Ala Glu Phe Ser Gly Asn Gly Trp Asn Asp Asp Lys
355 360 365
Cys Asn Leu Ala Lys Phe Trp Ile Cys Lys Lys Ser Ala Ala Ser Cys
370 375 380
Ser Arg Asp Glu Glu Gln Phe Leu Ser Pro Ala Pro Ala Thr Pro Asn
385 390 395 400
Pro Pro Pro Ala
<210>2
<211>1215
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>可溶性DC-SIGN-1
<400>2
atgagtgact ccaaggaacc aagactgcag cagctgggcc tcctggagga ggaacagctg 60
agaggccttg gattccgaca gactcgagga tacaagagct tagcagggtg tcttggccat 120
ggtcccctgg tgctgcaact cctctccttc acgctcttgg ctgggctcct tgtccaagtg 180
tccaaggtcc ccagctccat aagtcaggaa caatccaggc aagacgcgat ctaccagaac 240
ctgacccagc ttaaagctgc agtgggtgag ctctcagaga aatccaagct gcaggagatc 300
taccaggagc tgacccagct gaaggctgca gtgggtgagc ttccagagaa atctaagctg 360
caggagatct accaggagct gacccggctg aaggctgcag tgggtgagct tccagagaaa 420
tctaagctgc aggagatcta ccaggagctg acctggctga aggctgcagt gggtgagctt 480
ccagagaaat ctaagatgca ggagatctac caggagctga ctcggctgaa ggctgcagtg 540
ggtgagcttc cagagaaatc taagcagcag gagatctacc aggagctgac ccggctgaag 600
gctgcagtgg gtgagcttcc agagaaatct aagcagcagg agatctacca ggagctgacc 660
cggctgaagg ctgcagtggg tgagcttcca gagaaatcta agcagcagga gatctaccag 720
gagctgaccc agctgaaggc tgcagtggaa cgcctgtgcc acccctgtcc ctgggaatgg 780
acattcttcc aaggaaactg ttacttcatg tctaactccc agcggaactg gcacgactcc 840
atcaccgcct gcaaagaagt gggggcccag ctcgtcgtaa tcaaaagtgc tgaggagcag 900
aacttcctac agctgcagtc ttccagaagt aaccgcttca cctggatggg actttcagat 960
ctaaatcagg aaggcacgtg gcaatgggtg gacggctcac ctctgttgcc cagcttcaag 1020
cagtattgga acagaggaga gcccaacaac gttggggagg aagactgcgc ggaatttagt 1080
ggcaatggct ggaacgacga caaatgtaat cttgccaaat tctggatctg caaaaagtcc 1140
gcagcctcct gctccaggga tgaagaacag tttctttctc cagcccctgc caccccaaac 1200
ccccctcctg cgtag 1215
<210>3
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1 5 10 15
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50 55 60
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100 105 110
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130 135 140
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145 150 155 160
Arg Leu Lys Ala Ala Val Gly Glu Leu Pro Glu Lys Ser Lys Gln Gln
165 170 175
Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Gln Leu Lys Ala Ala Val Glu Arg Leu
180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
Gly Leu Ser Asp Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly
260 265 270
Ser Pro Leu Leu Pro Ser Phe Lys Gln Tyr Trp Asn Arg Gly Glu Pro
275 280 285
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<223>猪的CTLA4信号肽序列-可溶性DC-SIGN-2
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<210>6
<211>1141
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>老鼠的Igk-链V-J2-C信号肽序列-可溶性DC-SIGN-2
<400>6
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ctccataagt caggaacaat ccaggcaaga cgcgatctac cagaacctga cccagcttaa 180
agctgcagtg ggtgagctct cagagaaatc caagctgcag gagatctacc aggagctgac 240
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ggagctgacc cggctgaagg ctgcagtggg tgagcttcca gagaaatcta agctgcagga 360
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agtgggtgag cttccagaga aatctaagca gcaggagatc taccaggagc tgacccagct 660
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cagggatgaa gaacagtttc tttctccagc ccctgccacc ccaaaccccc ctcctgcgta 1140
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