Esat-6蛋白在诊断结核病中的用途 【发明领域】
本发明涉及生物应用技术领域，具体地是涉及Esat-6蛋白作为变态反应原在诊断结核病，实现结核病高危人群筛选中的用途。
背景技术
结核病是威胁人类健康的重大传染病之一，而我国是全球22个结核高负担国家之一。据统计目前有约4.5亿人感染了结核杆菌，但从另一个角度讲，如此多的感染人群未必都会被确诊为结核病。流行病学分析显示，在感染了结核杆菌的人群中有10％的人结核发病率较高(这部分人群不仅感染了结核杆菌，体内更仍保留有存活的结核杆菌)，被称为结核病高危人群。因此，同时如何早期发现高危人群并给予预防是结核病控制的重要问题，这其中寻找能诊断和确定患者体内是否留有存活结核杆菌应该是实现的关键。
目前结核病诊断中广泛使用的胸部X光片、涂片镜检、血清学检查等均难做到大规模普查和早期发现，PPD(结核杆菌精制蛋白衍生物)皮肤变态反应虽可用于结核病的大规模普查，但PPD包含的抗原为结核分枝杆菌、非致病性分枝杆菌及BCG(卡介菌)所共有，因而不能区分BCG接种、非致病性分枝杆菌感染和结核杆菌感染，更不能鉴别结核菌感染者体内有无活的结核杆菌。
Esat-6(Early secretory antigenic target-6)是结核杆菌生长过程中分泌的一种低分子量蛋白。由于该基因只在少数分支杆菌中存在(如BCG菌株在减毒及传代过程中丢失了该基因)，特异性强，有关的研究结果显示，Esat-6可用于鉴别卡介苗接种和结核杆菌感染。然而，在所有PPD阳性反应者中筛选真正的结核高危人群，除应鉴别卡介苗接种和结核菌感染，更重要的是尚需鉴别感染者体内有无存活的结核杆菌。
【发明内容】
本发明的目的在于针对目前对结核病的鉴别诊断方法中的不足，提供Esat-6蛋白更全面的鉴别诊断结核病之用途，即，利用该蛋白可鉴别个体的PPD阳性反应是因体内存活的结核杆菌还是卡介苗接种或体内的结核死菌。
本发明提供了Esat-6蛋白在制备用于鉴别诊断结核病的药物中地应用。
前面已经提到，Esat-6(Early secretory antigenic target-6)蛋白是结核杆菌生长过程中分泌的一种低分子量蛋白。已经证明，Esat-6蛋白最初是从结核分支杆菌短期培养滤液(ST-CF)中纯化分离出的一种低分子量分泌蛋白(可参见Andersen，P.，A.B.Andersen.A.L.Sorensen andS.Nagai.Recall of long-lived immunity to Mycobacteriumtuberculosis Infect in mice[J].J.Immunol，1995；154：3359./Soresen A L，et al.Purification and characterization of low-molecular mass T-cell antigen secreted by Mycobacteeriumtuberculosis Infect.Immun.1995；63：1710)，对结核杆菌短期培养滤液(ST-CF)经不同方法处理，得到的Esat-6分子量有所不同，例如有6KD、24KD和9.9KD等(“分支杆菌Esat-6研究进展”，李晖综述，钟森，张建军审校；泸洲医学院学报，2001；24(2)：164)。据分析导致其分子量的区别可能是Esat-6在自然状态下以多聚体形式存在，但这种多聚体的联系并不强(参见Harboe，M.T.Oettinger.H.G Wiker，et al.Evidence foroccurrence of the Esat-6 protein in Mycobacterium tuberculosis andvirolent Mycobacterium bovis and for its abence in Mycobacteriumbovis BCG[J].Infect.Immun，1996；64：16.)，有关Esat-6蛋白的信息已有很多在先公开，编码该蛋白的核苷酸序列也有在Genebank中公开，很容易找到，例如已经登记的，登记号为AF420491，是一段由全长315个核苷酸组成的序列。研究结果显示，分子量的差异或者在编码组成上的个别差异对Esat-6的性质和应用并没有实质性的影响。
本发明所使用的Esat-6蛋白可以来自这些已知方法，也可以通过基因重组法获得，例如，可以用基因重组法以结核杆菌DNA为模板扩增出Esat-6基因后克隆、表达得到。本发明中所使用的Esat-6蛋白可以来自上述分离纯化过程的全长序列蛋白，也可以从使用方便考虑，使用其中的一段，例如从全长蛋白中切割或者采用重组方法合成，例如在后面的实施例中采用所描述的重组方法制备出的Esat-6蛋白的分子量一般在在11.0KD±10％范围内，等电点在在3.50-4.55范围内(参见序列表中的SEQ ID NO：2)。
本发明在不同分支杆菌致敏的动物中作Esat-6皮肤变态反应，结果Esat-6蛋白除与堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠有一定的交叉反应外(根据已有的文献，Esat-6与堪萨斯分枝杆菌有一定的抗原交叉，二者鉴别可用PPD-B皮试实验)，只与结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠呈阳性反应，而与卡介苗致敏豚鼠、结核分枝杆菌灭活菌体致敏豚鼠、偶发分枝杆菌致敏豚鼠、瘰疬分枝杆菌致敏豚鼠、鸟分枝杆菌以及龟亚种分枝杆菌致敏豚鼠均呈阴性反应。
动物试验的结果显示，Esat-6蛋白用于分支杆菌致敏豚鼠的皮肤试验时，与结核分支杆菌死菌或卡介苗致敏的豚鼠呈阴性反应，与结核分支杆菌活菌致敏的豚鼠呈阳性反应。所以本发明人提出Esat-6蛋白可用于鉴别PPD阳性反应者是因卡介苗接种或结核杆菌继往感染但体内已无活菌者与体内仍有存活结核杆菌者，该结果可用于结核高危人群的筛选。这也是本发明的意义所在。
以下结合具体实施方案详细说明本发明，但不应构成对本发明实施范围的限定。
附图简述
图1显示对结核死菌致敏豚鼠的Esat-6和PPD皮试反应，图中A为PPD的皮试结果，B为Esat-6的皮试结果。
图2为采用基因重组方法制备Esat-6蛋白过程中PCR扩增E6基因图，图中：
1.λ-EcoT14 Idigest Marker(19329bp、7743bp、6223bp、4254bp、3472bp、2690bp、1882bp、1489bp、925bp、421bp、74bp)，
2.PCR扩增产物，
3.DL-2000 Marker(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
图3为采用基因重组方法制备Esat-6蛋白过程中，PET9d-E6表达质粒的酶切图谱鉴定，图中：1、6为DNA标准分子量(100bp DNA ladder)，2为PET9d-E6表达质粒BamHI单酶切图，5为PET9d-E6表达质粒NcoI单酶切图，3、4为PET9d-E6表达质粒BamHI和NcoI双酶切图。
【具体实施方式】
一、基因重组法获得Esat-6蛋白：
1、目的基因的获得、克隆和鉴定
1.1 PCR扩增
a.设计、合成引物：
上游引物序列：5’CATGCCATGGTAGAGCAGCAGTGGAATTTC0GC3’
下游引物序列：5’CGGGATCCAATTGCGAACATCCCAGTGAGGTTGC3’
b.提取DNA模板：取结核分支杆菌H37Rv(来自中国药品生物制品检定所中国医学菌种保藏中心)标准株新鲜培养物，以常规分子生物学方法提取基因组DNA。
c.PCR扩增及目的基因回收：以结核分支杆菌H37Rv DNA为模板，以上述序列为引物，在TaqplusI DNA聚合酶作用下扩增E6基因，循环参数：94℃、1min，61℃、1min，72℃、1min，30次循环，72℃延伸7min。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳约300bp，与预计相符(参看图2)。将其余所有扩增产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切割含目的DNA条带的凝胶块并用UNIQ-10column DNA gel extraction kit回收。回收的DNA溶解于40μl ddH2O，-20℃保存备用。
1.2碱裂解法大量制备PET-9d质粒
制备大肠杆菌BL21(来自军事医学科学院生物工程研究所)感受态，取-20℃保存的PET-9d质粒1.0μl加入100μl该大肠杆菌感受态混匀，0℃、30min，42℃、2min，0℃、2min，加400μl LB培养基，37℃、45min。取100μl铺LB琼脂平板(含50μg/ml卡那霉素)37℃培养1h，平板倒置培养过夜。第二天挑取单菌落于150ml LB培养基(50μg/ml卡那霉素)振荡培养12h，5000rpm离心5min收集菌体，碱裂解法大量制备PET-9d质粒。
1.3克隆和鉴定
将1.1和1.2中制备的目的基因和质粒分别作BamHI和NcoI双酶切，取适量酶切产物经T4DNA连接酶在14℃-16℃连接过夜，得重组质粒。挑重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态，形成的菌落接种于LB培养基(50μg/ml卡那霉素)培养过夜，5000rpm离心10min收集菌体，以碱裂解法抽提质粒。对质粒DNA进行酶切和PCR扩增鉴定，结果见图3。
选酶切和PCR鉴定均为阳性的重组子，对其插入的E6基因进行测序，测序结果见SEQ ID NO：1。与前登记号为AF420491的序列比较可以知道，本实施例中得到的Esat-6蛋白仅在设计上游引物时改变了两个核苷酸：将编码第二个氨基酸的密码子由ACA变为GTA，使第二个氨基酸由苏氨酸(Thr或T)突变为缬氨酸(Val或V)。
2、工程菌构建
取测序准确的重组质粒转化大肠杆菌BL21。转化培养菌落随机挑选5个培养过夜，按1％各接种2支5ml LB培养基中，培养至OD600≈0.6左右，加IPTG诱导培养4小时，离心收集菌体，加200μl 1XSDS加样缓冲液，沸水浴3分钟，15％聚丙烯酰胺凝胶电泳。取目的蛋白表达量高的菌落扩大培养、保存于甘油中即为工程菌。
对于该大肠杆菌申请人已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行了保藏，保藏号为CGMCC No.1102，保藏日期2004年3月2日。
3、重组Esat-6蛋白的诱导表达
取鉴定合格的工程菌接种5ml LB培养基(含50μg/ml卡那霉素)，37℃培养10h。培养菌液1ml转接于1L LB培养基(50μg/ml卡那霉素)，37℃培养过夜。取1.5ml菌液抽提质粒作鉴定，其余供发酵罐或摇床放大培养接种用的种子液。种子液按1％接种于新鲜LB培养基(50μg/ml卡那霉素)中，大量培养。从开始接种到培养结束，每30min测1次OD600值，当OD600≈0.8时，加IPTG至0.4mmol/L诱导，37℃继续培养4h，5000rpm离心15min，收集菌体。
4、重组Esat-6蛋白的纯化
通过预实验获知目的蛋白以可溶性形式表达。
按每克菌体加5ml裂解缓冲液悬浮菌体，加苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为0.1mmol/L)，400W、10秒，间隔10秒，共超声40次。12000rpm、4℃离心30min，收获上清液。将该上清上样至以20mmol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液充分平衡的DEAE-52离子交换柱，上样完毕后，用平衡缓冲液平衡至基线，用0-0.5mol/L NaCl洗脱，同时用分步收集器收集样品。按洗脱曲线选取收集管蛋白进行电泳，合并含杂蛋白少、目的蛋白多的样品管的蛋白液体，以pH8.5、50mmol/L Tris·Cl为缓冲液、4℃透析去盐。透析后的样品再上样至以50mmol/L Tris·Cl(pH8.5)缓冲液充分平衡的QFF离子交换柱，上样完毕后，用平衡缓冲液平衡至基线，阶段梯度洗脱：100mmol/L NaCl、200mmol/L NaCl、400mmol/L NaCl，用分步收集器收集样品。按洗脱曲线选取收集管蛋白进行电泳，合并管内蛋白呈现一条目的蛋白带的液体，以0.01mmol/L PBS缓冲液4℃透析样品。透析后的样品经SDS-PAGE电泳，目的蛋白纯度为97.8％。
测定获得的Esat-6蛋白分子量为11.0KD±10％，等电点在在pH3.50-4.55。
二、变态反应原(Esat-6)的药理学研究
--Esat-6与不同分支杆菌致敏豚鼠的皮试实验
1、试验材料：
本药理学和后面药效学实验中采用的堪萨斯分支杆菌、偶发分支杆菌、瘰疠分支杆菌、鸟分支杆菌、龟亚分支杆菌和结核分支杆菌灭活菌液，各菌种均来自中国药品生物制品检定所中国医学菌种保藏中心。处理方法为：选取生长良好且无污染的菌种，用常规方法洗下菌体，用灭菌的液体石蜡制备浓度为100mg/ml的菌悬液，用吸管反复吹打至乳浊状，10磅灭活15分钟，分装灭菌塑料小管，2～8℃保存备用。
结核分枝杆菌和卡介苗菌种：也来自中国药品生物制品检定所中国医学菌种保藏中心。结核分枝杆活菌菌液，浓度3×107cfu/ml；卡介苗(丹麦株)为冻干菌种，浓度60mg/支。
Esat-6蛋白：来自上述重组方法或者按照文献方法获得。
人型-PPD指结核菌素纯蛋白衍化物，对已受结核菌感染或曾接受卡介苗免疫的机体，能引起特异的皮肤变态反应。PPD-B指胞内分支杆菌纯化蛋白衍生物，是鉴别分支杆菌感染用变态反应原类制剂的国家标准品，由中国药品生物制品检定所制备。
豚鼠：购自中国药品生物制品检定所动物中心。为健康成年清洁级豚鼠，随机分为8组，每组6只。
2、实验方法：取堪萨斯、偶发、瘰疠、鸟、龟亚分支杆菌和结核分支杆菌灭活菌液(100mg/ml)及卡介苗活菌菌液(60mg/ml)和结核分枝杆菌活菌菌液，于豚鼠腹股沟皮下注射，每种菌液致敏6只豚鼠。活菌液致敏一次，5-6周后进行皮试，死菌液3周致敏一次，共2次，末次致敏后3-4周进行皮试。皮试时每只豚鼠各注射2点，一点注射PPD-B或人型-PPD，一点注射Esat-6。皮内注射，每点0.1ml。观察24小时和48小时局部硬结反应，根据48小时结果判定。
3、实验结果：在堪萨斯分枝杆菌致敏的6只豚鼠中，PPD-B皮试均呈阳性反应，局部硬结反应累计值为75.5mm，平均值为12.6mm，Esat-6皮试阳性反应率为3/6，局部硬结反应累计值为24.5mm，平均值为4.1mm。在偶发分支杆菌、瘰疠分支杆菌、鸟分支杆菌、龟亚分支杆菌、卡介苗活菌液和结核分支杆菌灭活菌液分别致敏的6只豚鼠中，PPD-B或人型-PPD皮试均呈10mm以上的阳性反应，而Esat-6皮试均呈阴性反应(参见图1及作为参考的彩色照片显示)。在结核活菌致敏的6只豚鼠中，人型-PPD皮试和Esat-6皮试均呈10mm以上的阳性反应。
结论：Esat-6除与堪萨斯分枝杆菌致敏豚鼠有交叉反应外，只与结核活菌致敏的豚鼠呈阳性反应，与卡介苗、结核死菌、和偶发、瘰疠、鸟、龟亚分支杆菌致敏的豚鼠均呈阴性反应。由此可见，Esat-6可鉴别PPD阳性个体是源于体内尚有结核活菌还是卡介苗接种或继往结核菌感染但体内已无结核活菌。
三、变态反应原(Esat-6)的药效学研究
——不同浓度的Esat-6与卡介苗、结核死菌和结核活菌致敏豚鼠的皮试实验
1、试验材料：各种材料来源与药理学研究相同。
2、实验方法：取结核分支杆菌灭活菌液(100mg/ml)及卡介苗活菌苗(60mg/ml)
和结核分枝杆菌活菌菌液(5000cfu/ml)，于豚鼠腹股沟皮下注射，结核分枝杆菌活菌菌液注射0.5ml/只，其它致敏原注射0.2ml/只，每种菌液致敏6只豚鼠。
致敏5-6周后进行皮试。给结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠脊柱双侧去毛，以轮圈法于皮内注射各稀释度East-6及人型-PPD，每点0.2ml。用双盲法分别记录24及48小时局部硬结的纵径与横径。计算每个稀释度2天的总和。给卡介苗活菌致敏豚鼠和结核分枝杆菌灭活菌体致敏豚鼠脊柱双侧去毛，以轮圈法于皮内注射三批浓度为20μg/ml的East-6及人型-PPD，每点0.2ml。记录48小时局部硬结的纵径与横径。
实验结果：见表1、表2、表3。
结论：人型-PPD与卡介苗、结核死菌和结核活菌致敏豚鼠均呈阳性反应。Esat-6与结核活菌致敏豚鼠呈阳性反应，与卡介苗和结核死菌致敏豚鼠呈阴性反应。
四、变态反应原(Esat-6)的毒理学研究
使用材料：
Esat-6蛋白：来自上述重组方法或者按照文献方法获得。
豚鼠和小鼠均购自中国药品生物制品检定所动物中心。其中，豚鼠为健康成年清洁级豚鼠，小鼠为18-22克SPF级昆明种小鼠。
按新药临床前研究的要求，进行了Esat-6的小鼠急性毒性实验、小鼠和豚鼠的异常毒性实验、豚鼠安全实验和全身过敏实验。结果证明Esat-6无上述毒性。
1、小鼠急性毒性实验：采用400U/只的剂量经腹腔和皮内两种途径注射小鼠，均未引起小鼠的异常症状和死亡。结果见表4和表5
2、小鼠异常毒性实验：
小鼠称重后，给每只小鼠腹腔注射0.5mlEsat-6制品(50U/ml)，注射后连续观察7天。结果：所有动物均健存、无异常反应，且体重增加(见表6)。
3、豚鼠异常毒性实验：
豚鼠称体重后，给每只豚鼠腹腔注射5.0ml Esat-6制品(50U/ml)，注射后连续观察7天。结果：所有动物均健存、无异常反应，且体重增加(见表7)。
4、豚鼠安全性实验
动物称重后，给实验组动物腹腔注射重组Esat-6制品1000U/0.5ml/只，对照组注射等体积的生理盐水。注射后7天观察注射部位是否有硬结和溃烂，体重是否增加，全部解剖后，观察动物脏器——心、肝、脾、肺、肾及淋巴结等是否有病变。
结果：豚鼠无死亡、体重增加、注射部位和各脏器未见异常(见表8)。
5、动物全身过敏试验
以1000U/0.5ml/只的量用重组Esat-6致敏豚鼠后，给阳性对照组豚鼠攻击BSA 4mg/ml/只，给实验组和阴性对照组豚鼠攻击Esat-61000U/0.5ml/只。BSA阳性对照组豚鼠在攻击后第14天攻击，有3只出现典型过敏症状后死亡，其余3只出现连续、多次的咳嗽、伴有明显的呼吸困难或痉挛等过敏症状。Esat-6实验组和阴性对照组豚鼠攻击后，均未出现任何异常反应。
结论：重组结核病鉴别诊断用变态反应原对豚鼠不引起致敏动物的全身过敏反应(见表9及附表9-1)。
表1.不同浓度的East-6与人型-PPD对结核分枝杆菌活菌致敏豚鼠的皮试结果
动物6 15× 15 14 ×14 12 ×13 10 ×10 14 ×14 11 ×12 12 ×12 10 ×11 9× 9 9× 9平均直径累计值(mm) 102. 0 85. 5 97. 0 80. 5 85. 5 72. 0 81. 5 69.5 78. 0 77. 024、48小时平均直径累计值(mm) 187.5 177.5 157.5 151.0 155.0与PPD的比值 1.2 1.1 1.0 1.0 /
表2.卡介苗活菌致敏豚鼠的皮试结果 制 品 名 称 结核病鉴别诊断用变态反应原 (Esat-6) 人型 -PPD 200201 批 200202 批 200203 批 动物1 0 0 0 15× 15 动物2 0 0 0 15× 14 动物3 0 0 0 15× 15 动物4 0 0 0 14× 16 动物5 0 0 0 13× 14 动物6 0 0 0 14× 14 直径累计平 均值(mm) 0 0 0 14.5
表3.结核分枝杆菌灭活菌体致敏豚鼠的皮试结果 制 品 名 称 结核病鉴别诊断用变态反应原 (Esat-6) 人型 -PPD 200201 批 200202 批 200203 批 动物1 0 0 0 15× 16
动物2 0 0 0 14× 14 动物3 0 0 0 16× 16 动物4 0 0 0 15× 16 动物5 0 0 0 15× 15 动物6 0 0 0 15× 14 直径累计平 均值(mm) 0 0 0 15.1
表4小鼠腹腔组给药急性毒性实验结果 给药 剂量 (U/ 只) 注 射 途 径 动物只 数 (只) 存活数 (只) 死亡数 (只)给药组 400 腹 腔 12 12 0对照组 0 腹 腔 12 12 0
表5小鼠皮内组给药急性毒性实验结果 给药 剂量 (U/ 只) 注 射 途 径 动物只 数 (只) 存活数 (只) 死亡数 (只)给药组 400 皮 内 12 12 0对照组 0 皮 内 12 12 0
表6.小鼠异常毒性试验结果
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动物 20020601批Esat-6 20020602批Esat-620020603批Esat-6
编号 初重(g) 7天重(g) 初重(g) 7天重(g) 初重(g) 7天重(g)
1 21.3 25.5 21.2 24.522.0 27.2
2 21.7 27.2 21.8 28.521.4 29.6
3 21.5 28.6 21.2 24.822.0 24.6
4 21.3 31.2 20.8 25.021.9 25.8
5 21.0 29.1 20.1 24.421.8 28.3
表7. 豚鼠异常毒性试验结果
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动物 200201批Esat-6 200202批Esat-6200203批Esat-6
编号 初重(g) 7天重(g) 初重(g) 7天重(g) 初重(g) 7天重(g)
1 324 365 285 333303 347
2 332 388 324 363337 394
表8.豚鼠安全性实验结果 分 组注射前体重(g)注射后体重(g) 注 射 部 心 脏 脾 脏 肾 脏 肝 脏 肺 淋 巴 结
位 实 验 组 头 363. 5 394. 5 ------- 背 312. 6 345. 6 ------- 尾 317. 4 355. 5 ------- 白 328. 2 389. 2 ------- 头 背 328. 8 377. 2 ------- 头 尾 304. 8 346. 4 ------- 对 照 组 头 304. 8 357. 0 ------- 背 349. 1 385. 0 ------- 尾 300. 0 351. 1 ------- 白 387. 2 435. 1 ------- 头 背 323. 5 365. 2 ------- 头 尾 316. 8 347. 8 -------
表9：动物全身过敏实验中各组豚鼠反应结果
0 1 2 3 4 6 -6 - -- - -- 3- - 3-
附表9-1：豚鼠过敏实验反应症状分级 反应级 数 反应症状 0 无明显反应 1 只有轻微抓鼻、颤抖或竖毛 2 有几次咳嗽、有抓鼻、颤抖或竖毛 3 多次或连续的咳嗽、伴有呼吸困难或痉挛、 抽搐等 4 痉挛、抽搐、大小便失禁、休克、死亡