一种抗人免疫缺陷病毒I型p24蛋白的单克隆抗体及其应用 技术领域：
本发明涉及一种抗人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)p24蛋白的单克隆抗体及其应用，更具体地说是利用基因工程制备重组HIV-1p24蛋白及其单克隆抗体，并用于HIV-1p24抗原的检测。
背景技术：
艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)在全球广泛流行，亚洲是继北美、非洲之后成为全球HIV(Human Immunodeficiency Virus)感染上升最迅速、流行最严重的地区之一。我国AIDS也呈加速流行的趋势。专家估计，我国实际HIV感染者累计超过100万，2003年底估计现存感染者人数为84万。截至2004年9月底，报告的艾滋病病毒感染者89,067例，其中艾滋病病例20,786例。
HIV主要通过性、母婴和血液三种途径传播。为监控流行情况，评价新的疫苗和药物，建立简便、灵敏、特异的检测方法特别关键。检测HIV试剂包括抗体、抗原、核酸三大类。
HIV-1p24蛋白是构成病毒核衣壳的主要结构蛋白。gag基因在病毒复制中扮演十分重要的角色。p24蛋白的氨基酸序列在HIV-1各毒株之间高度保守，缺失p24会导致病毒无法正常组装。HIV-1感染人体后，机体会产生针对p24抗原的免疫应答。
HIV-1p24抗原的检测在早期诊断(1)、预测病程(2，3)、胎儿感染确诊、药物疗效评价(3，4)和基础研究(5)等方面具有重要意义。现在，以<酶联免疫分析(ELISA)为基础的测定p24抗原技术最为常用。
美国专利公开号US 005,173,399，公开日1992年12月22日，发明创造的名称为Mouse monoclonal antibodies to hiv-1p24 and their use in diagnostic tests，该申请公开了一种抗人免疫缺陷病毒p24蛋白的单克隆抗体及其在检测中的应用。美国专利公开号US 004,888,290，公开日1989年12月19日，发明创造的名称为Monoclonalantibody specific to HIV antigens，该申请公开了一种抗人免疫缺陷病毒p55，p24蛋白的单克隆抗体KC-57。美国专利公开号US 004,886,742，公开日1989年12月12日，发明创造的名称为Enzyme immunoassay for detecting HIV antigens in human sera，该申请公开了一种检测人免疫缺陷病毒p24蛋白地方法，其不足之处是采用人阳性血清作为检测抗体，增加了非特异性反应的可能。
经文献检索，未见与本发明相同文献的公开报道。
参考文献
1.Le Pont F et al.，Transfusion，1995，35:542.
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6.徐志凯等，1992，实用单克隆抗体技术，75-79
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的缺点，采用能降低非特异性反应的重组HIVp24免疫的兔血清作为检测抗体，提供一种HIV-1p24的单克隆抗体及检测人免疫缺陷病毒p24蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
本发明的单克隆抗体的免疫原为纯化B亚型HIV-1p24基因工程重组蛋白，表达蛋白产物的分子量为24kDa。单克隆抗体源于HIV-1p24重组蛋白免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞。单克隆抗体p3JB9，p5F1和p6F4识别HIV-1p24的不同表位，p5F1识别表位DCKTILKALGPAATLEEMMTAC，位于HIV-1Gag蛋白上氨基酸329-350。单克隆抗体均为IgG1亚类。单克隆抗体不与猴免疫缺陷病毒SIVAGM、猴逆转录D型病毒SRV交叉反应。单克隆抗体p3JB9，p5F1和p6F4都能与HIV-1实验株HIV-1IIB、HIVAda-M和耐药株HIV74V反应；单克隆抗体p5F1和p6F4能与临床分离株HIVKM018反应。
本发明的另一技术方案为：用基因工程重组HIV-1p24作免疫原，通过免疫正常家兔，收集血清，从中分离纯化出抗人HIV-1p24多克隆抗体。
本发明的抗HIV-1p24单克隆抗体和多克隆抗体，可以与其它单克隆抗体或多克隆抗体组合，用于各种体液、培养上清或各种细胞、组织中HIV-1p24抗原的定性或定量检测；可以作包括放射性同位素、酶、荧光素化合物、化学发光化合物或胶体金属离子在内的各种标记，用于各种体液、培养上清或各种细胞、组织中HIV-1p24抗原的定性或定量检测。
HIV-1p24蛋白的单克隆抗体采用公知的方法制备，具体包括以下步骤：
(1)制备HIV-1p24的蛋白：
分别用表达HIV-1B亚型p24蛋白的E.coli表达系统大量表达GST-p24融合蛋白，用溶菌酶裂解细菌后，采用Parmacia Sepharose-4B GST亲和层析柱吸附GST融合蛋白，经PreScission蛋白酶在4℃过夜酶切，用洗脱缓冲液洗脱得到电泳纯HIV-1B亚型重组p24蛋白。
(2)制备HIV-1p24蛋白特异性单克隆抗体
用纯化的HIV-1p24蛋白背部皮下常规免疫6-8周的Balb/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞与NS-1小鼠骨髓瘤细胞在50％聚乙二醇(PEG)作用下进行融合，用含20％小牛血清的HAT选择性培养基将融合的细胞培养10-14天，使其产生并增殖细胞克隆，然后更换为HT培养基。ELISA间接法检测培养上清中的抗体，以有限稀释法进行克隆化，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％。给每只Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml，1周后，将扩大培养的阳性单克隆细胞以5×105细胞/鼠注入液体石蜡致敏的小鼠腹腔，1-2周后收集腹水。采用Protein G亲和层析法纯化，得到IgG蛋白分子。
制备HIV-1p24的多克隆抗体制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备HIV-1p24的蛋白：
同“制备HIV-1p24的单克隆抗体制备方法”。
(2)制备HIV-1p24蛋白特异性多克隆抗体
纯化的抗原100ug/只，与等体积完全佛氏佐剂充分混合、乳化，肌肉注射及皮下多点注射正常家兔；4周后，相同量抗原与不完全佛氏佐剂充分混合、乳化，再次皮下多点注射；4周后，重复第二次免疫；末次免疫一周后耳缘静脉采血，收集血清，-20℃保存。
通过ELISA、流式细胞术、免疫组化和Western blot将抗HIV-1p24蛋白的单克隆抗体及多克隆抗体用于制备检测HIV-1p24的试剂的应用。
本发明的优点是：本发明提供单克隆抗体和多克隆抗体的制备方法简单，效价高；单克隆抗体特异性强，灵敏度高；本发明可用于HIV-1p24抗原的检测，在HIV感染的早期诊断、预测病程、胎儿感染确诊和基础研究等方面具有重要意义。
【附图说明】
图1为p3JB9，p5F1和p6F4三株的杂交瘤细胞核型分析图。
图2为抗HIV p24单克隆抗体和多克隆抗体的点印迹分析图。
图3为抗HIV p24单克隆抗体和多克隆抗体的蛋白印迹分析图。
【具体实施方式】
下面，结合实施例对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。
实施例1、单克隆抗体的制备
(1)免疫小鼠
用于制备单克隆抗体的免疫原为纯化B亚型HIV-1p24基因工程重组蛋白。B亚型HIV-1p24全长蛋白用表达HIV-1B亚型p24蛋白的E.coli表达系统大量表达GST-p24融合蛋白，用溶菌酶裂解细菌后，采用Parmacia Sepharose-4B GST亲和层析柱吸附GST融合蛋白，经PreScission蛋白酶在4℃过夜酶切，用洗脱缓冲液洗脱得到电泳纯HIV-1B亚型重组p24蛋白。
用B亚型HIV-1p24重组蛋白免疫动物为BALB/c小鼠，具体免疫方案如下：
初次免疫 HIV-1p24抗原加福氏完全佐剂，50ug/只
腹腔注射，三点注射，50μl/点
↓ 30天后
第二次免疫剂量及免疫方法同上，加福氏不完全佐剂
↓ 30天后
第三次免疫剂量及免疫方法同上，加福氏不完全佐剂
↓ 7天后采血测其效价，检测免疫效果
↓ 45天后
加强免疫 剂量50ug/只，腹腔注射
↓ 3天后
取脾细胞融合 (2)细胞融合
融合前用50ug重组HIV-1p24蛋白腹腔注射加强免疫，3天以后在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨制备成单细胞悬液后，用0.83％NH4Cl处理出去红细胞。取对数生长的骨髓瘤细胞NS-1与脾细胞按1∶5的比例混合在一起，用不完全培养液洗1次，1200rpm，8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在37℃下，60秒内加入预热的1ml 50％PEG 4000，边加边搅拌，作用90秒钟。加10ml预热的不完全培养液，终止PEG作用，前1分钟加入1ml，紧接着的1分钟加入2ml，剩下的一分钟内加完。离心，800rpm，6分钟。弃上清，先用20 ml左右20％小牛血清RPMll640轻轻混悬。37℃、5％CO2培养3小时。
离心，800rpm，6分钟。弃上清，用含HAT(终浓度为100 μ M的Hypoxanthine，0.4μM的aminopterin和16 μ M的Thymidine)、20％小牛血清、10％P388D1培养上清的RPMI 1640选择培养液轻轻混悬。将细胞悬液加入96孔板，200μl/孔，37℃、5％CO2培养。一块96孔板含有1×107脾细胞。一周后，一半的培养基换为HT培养液，再维持培养两周，改用10％小牛血清的RPMI 1640培养液。
(3)筛选、克隆
在融合10-14天后，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可用间接ELISA检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。
ELISA筛选单克隆抗体
用铺板液(Na2CO3 1.59g/l，NaHCO3 2.93 g/l，pH 9.6)稀释抗鼠IgG Fc片段特异抗体到1μg/ml铺板，捕捉抗p24单抗，与兔抗p24多抗组合成检测p24抗原的双抗体夹心法ELISA方法。
用抗鼠IgG Fc片段特异抗体1μg/ml铺板，4℃保温过夜；用洗涤液洗板用封闭液(5％奶粉，PBS，pH7.4)封板，37℃孵育1小时；洗去多余奶粉；用封闭液1∶2稀释上清，37℃ 1小时；洗涤后加入HIV-1裂解液，置37℃ 2小时；洗去未结合的游离p24，加入1∶4000兔抗p24多抗，置37℃1小时；洗涤后加入1∶4000酶标的抗兔IgG抗体，置37℃ 1小时；洗板后加入OPD底物反应液，反应10分钟，用2MH2SO4终止反应，50μl/孔。用酶标仪在490nm，参考波长630nm下读取OD值。
检测抗体阳性的杂交克隆采用有限稀释法进行克隆，初次克隆的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT(终浓度为100μM的Hypoxanthine和16μM的Thymidine)。阳性孔细胞的计数，取350个细胞放入14mlR-15-CM完全培养液，即25个细胞/ml，把此细胞悬液加入2块96孔板的Column 1-3，200μ1/孔(每孔约5 cells)；在剩余的4.4ml悬液中再添24.4ml R-15-CM，混匀，把此细胞悬液加入96孔板的Column4-12，200μ1/孔(每孔约O.76 cells)；把96孔培养板放入37℃，含5％二氧化碳的培养箱中培养；2块板，每孔200μl，含10％CM，15％NCS；培养4-5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl/孔；第8-9天时，肉眼可见细胞克隆，用ELISA进行抗体检测，方法同上。一般需进行3次克隆。
共进行6次融合，筛选了41株抗HIV-1B亚型基因工程重组p24抗原的阳性杂交瘤，已用有限稀释法三次克隆建立了三株能用于检测HIV-1p24杂交瘤：p3JB9、p5F1和p6F4。
实施例2、单克隆抗体的鉴定
融合细胞染色体计数
培养成单层的融合细胞加入秋水仙碱(0.1μg/ml)培养36-48小时，0.075 M的KCI低渗处理，冰醋酸和甲醇固定，制片和Giemsa染色。三株杂交瘤细胞各计数20个有效细胞的染色体，杂交瘤p3JB9染色体均数为89.7±5.5、p5F1染色体均数为91.O±1.5和p6F4染色体均数为83.2±4.6。
三株杂交瘤细胞的核型分析图如图1所示。
单克隆抗体Ig类/亚类的鉴定
用铺板液(Na2CO3 1.59g/l，NaHCO3 2.93g/l，pH 9.6)把p24抗原稀释到1μg/ml，100μl/孔，4℃过夜；用洗涤液洗板用封闭液(5％奶粉，PBS，pH 7.4)封板，37℃孵育1小时；洗板后加入阳性克隆上清，37℃ 1.5 h；洗板后加入1∶1000稀释羊抗鼠Ig亚类抗体(Sigma)，37℃孵育1小时；洗板后加入用封闭液1∶10000稀释的驴抗羊-HRP，37℃1小时；洗板后加入OPD底物反应液，反应10分钟，用2MH2SO4终止反应，50μl/孔。用酶标仪在490nm，参考波长630nm下读取OD值。
三株单克隆抗体的亚类都为IgG1型。
单克隆抗体识别抗原表位的分析
用ELISA进行鉴定。先用ELISA法测定McAb与包被抗原反应的饱和浓度。用抗鼠IgGFc片段特异抗体1μg/ml铺板，4℃保温过夜；用洗涤液洗板用封闭液(5％奶粉，PBS，pH 7.4)封板，37℃孵育1小时；洗去多余奶粉后前2孔分别加入饱和量McAbl、McAb2，其值分别记录为A1、A2，第3孔先加其中一种饱和量的McAb作用2h，洗涤后加入HIV-1裂解液，置37℃ 2小时；洗去未结合的游离p24，再另外加一种McAb作用1h，OD值记录为A1+2，洗涤后加入1∶4000酶标的抗鼠IgG抗体，置37℃ 1小时；洗板后加入OPD底物反应液，反应10分钟，用2M H2SO4终止反应，50μl/孔。用酶标仪在490nm，参考波长630nm下读取OD值。计算相加指数公式如下：
AI＝[2A1+2/(A1+A2)-1]×100％
每组重复试验3次，计算其平均值，AI值大于50％即认为2种单克隆抗体识别不同的抗原表位。
ELISA法鉴定了p3JB9、p5F1和p6F4三株单克隆抗体分别识别p24上的不同表位。点印迹实验(Dot blot)
用10μg/ml的6个HIV-1 p24上的肽段、6μg/ml重组p24在硝酸纤维素膜上点样，用封闭液(5％奶粉，PBS，pH 7.4)封闭，37℃孵育1小时；洗涤后分别加入用封闭液1∶200稀释的腹水，37℃ 1小时；洗涤后加入1∶1000酶标的抗鼠IgG抗体，置37℃ 1小时；洗板后加入DAB底物反应液，反应到适合对比度后用水洗涤终止反应。
p5F1特异地与DCKTILKALGPAATLEEMMTAC肽(Gag中位置aa329-350)，p3JB9和p6F4不与这6个HIV-1p24上的肽段反应。因此，p5F1的表位在Gag上氨基酸329-350：DCKTILKALGPAATLEEMMTAC，而p3JB9和p6F4的表位不是这6个肽段代表的氨基酸序列。图2所示为抗HIVp24单克隆抗体和多克隆抗体的点印迹分析图：1为单克隆抗体p3JB9、2为单克隆抗体p5F1、3为单克隆抗体p6F4、4为抗p24多克隆抗体。第一排点样为GA-12和NI-15，第二排点样为DR-16和DC-22，第三排点样为PS-18、AG-23和重组p24。
免疫印迹分析法进行单克隆抗体特异性分析
1、浓缩纯化HIV-1病毒裂解液的制备
HIV-1 IIIB感染H9细胞，培养72小时后收上清，离心HIV上清；加入1/2体积的PEG溶液(30％PEG，4M NaCl 5ml)，混匀，冰浴2小时；离心，2000rpm，20min；1％原体积的PBS重悬上清后，27,000g，4℃离心2小时，用1/1000原体积含1％TritonX-100的PBS重悬病毒沉淀，-20℃保存。
2、蛋白印迹实验(Western blot)
把浓缩纯化HIV-1病毒裂解液、重组p24用2×SDS加样缓冲液稀释一倍，将样品加到12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，电泳分离蛋白质，通过电洗脱使在凝胶上分离出来的蛋白质转印到PVDF膜上，自然风干后转印膜用含5％脱脂奶、0.05％Tween 20的PBS，室温封闭1小时，将转印膜剪成数根小条，分别加入杂交瘤细胞培养上清和兔抗HIV-1p24多克隆抗体中，室温反应1小时，用含有0.05％Tween 20的1×PBS洗涤膜后，分别加入1∶1000倍稀释的HRP标记羊抗鼠IgG或HRP标记羊抗兔IgG，置室温反应1小时，用同样的洗涤液洗涤膜后，DAB显色后，用去离子水终止显色。免疫印迹结果如附图的图2显示，本发明的3株单克隆抗体与rp24蛋白特异性结合。其中p3JB9与HIV-1裂解液中相对分子质量约为24kd的p24蛋白结合；p5F1和p6F4与HIV-1裂解液中的三个蛋白结合，结合蛋白相对分子质量约为24kd的p24，39kd的p55部分降解片段和55kd的前体蛋白p55。说明获得的单克隆抗体能够特异性识别p24抗原。图3所示为抗HIVp24单克隆抗体和多克隆抗体的蛋白印迹分析图：1为单克隆抗体p3JB9、2为单克隆抗体p5F1、3为单克隆抗体p6F4、4为抗p24多克隆抗体。
实施例3、单克隆抗体的大量生产
先腹腔注射0.5ml Pristane(降植烷)于BALB/c鼠，1周后腹腔注射O.5×106个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后可产生腹水，处死小鼠，用注射器抽取腹水，离心取上清，-20℃保存。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml。
实施例4、抗HIV-1p24免疫血清的制备
用HIV-1B亚型重组p24抗原免疫雌性日本大耳兔，5次，剂量为每次每只100μg，程序如下：初次免疫：完全弗氏佐剂臀部肌肉注射和背颈部皮下三点注射。加强免疫：在初次免疫后第30天进行，不完全弗氏佐剂臀部肌肉注射和背颈部皮下三点注射。最后加强免疫：在上次免疫45天后进行，含100μg蛋白的生理盐水，耳静脉注射，100μl/只。10-14天后心脏取血，制备血清，ELISA滴定了血清的效价，与rp24反应的滴度分别为1∶40,000。
实施例5、间接ELISA检测HIV-1p24方法的建立
建立了用抗鼠IgG Fc片段特异抗体铺板捕捉抗p24单抗，与兔抗p24多抗组合成检测p24抗原的双抗体夹心法ELISA方法。
用抗鼠IgGFc片段特异抗体1μg/ml铺板，4℃保温过夜；洗涤后用脱脂奶粉封板并洗去多余奶粉；加入鼠抗p24单抗；洗涤后加入被检测样品和已知含有HIV-1p24抗原样品，置37℃2小时；洗去未结合的游离p24，加入1∶4000兔抗p24多抗，置37℃小时；洗涤后加入1∶4000酶标的抗兔IgG抗体，置37℃1小时；洗涤后加入底物显色。
实施例6、间接ELISA检测HIV-1p24方法的敏感性和特异性
利用实施例8中所建立的ELISA检测梯度稀释的HIV-1IIIB裂解液，测得p5F1检测灵敏度最高，能检测1∶10000稀释的HIV-1IIIB裂解液，p3JB9次之(1∶5000)，p6F4最弱(1∶2000)。在用RETRO-TEK HIV-1p24 Antigen ELISA检测试剂盒中的p24标准抗原作为检测抗原时，p5F1检测灵敏度最高，能检测到30pg/ml的HIV-1p24，p3JB9次之(60pg/ml)，p6F4最弱，不能检测到125pg/ml。
p3JB9、p5F1和p6F4都特异地与HIV-1IIIB p24反应，不与SIVAGM、SRV裂解液反应；三株都能与CCR5嗜性病毒株HIV-1Ada-M和耐药株HIV-174V反应；p5F1和p6F4能与昆明临床分离株HIV-1KMO18反应，而p3JB9不能。
表1.三株单克隆抗体特异性检测结果 病毒株 单克隆抗体 p3JB9 p5F1 p6F4 HIV-1IIIB SIVAGM SRV-1 HIV-1Ada-M HIV-174V HIV-1KMO18 Control 1.583 0.032 -0.036 0.728 1.525 -0.008 -0.019 1.804 0.074 -0.025 0.998 1.819 1.803 -0.009 1.604 0.055 -0.017 0.592 1.217 1.612 -0.004
实施例7、辣根过氧化物酶标记抗体
辣根过氧化物酶标记抗体制备采用改良过碘酸钠法，将5mg辣根过氧化物酶搅拌溶解于1毫升蒸馏水中，加入0.2毫升新配0.1M过碘酸钠30分钟，置1mM pH 4.4醋酸钠缓冲液中，4℃透析过夜，次日加入20μl 0.2M pH 9.5碳酸盐缓冲液后加预先在0.01M碳酸盐缓冲液中pH9.5透析平衡的10mg抗体，在室温避光轻轻搅拌2～3小时，加入0.1毫升新配4mg/毫升硼氢化钠，4℃避光过夜，冰浴上避光搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵(硫酸铵用前先用氨水调pH至7.0-7.2)，置4℃ 6小时。10000g，4℃离心30分钟，弃上清，沉淀溶于适量10mM磷酸盐缓冲液，用同样的液体，4℃透析过夜，换液三次。收集结合物加入2％BSA PBS 50％甘油保护剂，分装置-70℃保存并进行酶标抗体工作浓度测定。