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1、(10)申请公布号 CN 103558327 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103558327 A (21)申请号 201310560050.0 (22)申请日 2013.11.12 G01N 30/88(2006.01) (71)申请人 劲牌有限公司 地址 435100 湖北省黄石市大冶大冶大道 169 号 (72)发明人 李先芝 毛琼丽 严玲 刘源才 王喆 (74)专利代理机构 黄石市三益专利商标事务所 42109 代理人 瞿晖 (54) 发明名称 利用高效液相色谱法检测冬虫夏草中虫草酸 含量的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种利用高效液相色谱法检 测冬虫夏草中虫。
2、草酸含量的方法， 主要包括下述 步骤供试品溶液制备 ； 对照品溶液制备 ； 建立标准曲线 ； 供试品溶液的色谱分析， 得到 供试品溶液中虫草酸的峰面积， 带入标准曲线中 计算即得到供试品溶液中虫草酸的含量 ； 本发明 的检测方法通过提取冬虫夏草中化学物质， 采用 HPLC-ELSD 利用各物质间的分配系数将各物质分 开， ELSD 检测器检测虫草酸的含量， 检测过程中 排出干扰， 经加样回收试验验证， 检测结果准确。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 (10。
3、)申请公布号 CN 103558327 A CN 103558327 A 1/1 页 2 1. 利用高效液相色谱法检测冬虫夏草中虫草酸含量的方法， 其特征在于由下述步骤组 成 ： 供试品溶液制备 冬虫夏草原药材 35下鼓风干燥 3 天后， 初磨至毫米级， 再用南 京南大球磨机粉碎至 0.1m 级 ； 称取 0.1g 冬虫夏草药材样品至具塞锥形瓶中， 精密称定， 加入水25mL， 称定重量， 超声提取30min， 称重， 补足减失重量， 以0.45m滤膜过滤， 取滤液 作为供试品溶液备用 ； 对照品溶液制备 精密称取 55.51mg 虫草酸对照品于 50mL 容量瓶中， 以水溶解定 容， 摇匀，。
4、 即得浓度为 1093.547mg/L 的虫草酸对照品溶液原液， 再分别精密量取对照品原 液0.5mL、 1.0mL、 2.0 mL、 4.0 mL、 6.0 mL置于10mL容量瓶中， 加水稀释至刻度， 摇匀， 即得到 浓度分别为 54.67735mg/L、 109.3547 mg/L、 218.7094 mg/L、 437.4188 mg/L、 656.1282 mg/ L 的对照品溶液 ； 建立标准曲线 虫草酸的色谱分析采用氨基色谱柱， 流动相为乙腈 - 水， 体积比为 83:17， 流速 1.0mL/min， 进样体积 ： 10L， 柱温 ： 30， 蒸发光散射检测器进行检测， 漂移管。
5、 温度为 100， 雾化气体流速为 2.5L/min ； 在上述色谱条件下进行对照品溶液的色谱分析， 得到各浓度对照品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积， 以浓度的对数为横坐标， 相对应的色谱 峰面积的对数为纵坐标建立标准曲线 ； 供试品溶液的色谱分析 按步骤中所述的色谱条件进行供试品溶液的色谱分 析， 得到供试品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积， 带入标准曲线中计算即得到供试品溶液中 虫草酸的含量。 权 利 要 求 书 CN 103558327 A 2 1/4 页 3 利用高效液相色谱法检测冬虫夏草中虫草酸含量的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种中药材的检测方法， 具体是利用高效液相色谱法 （Hig。
6、h Performance Liquid ChromatographyHPLC） 检测冬虫夏草中虫草酸含量的方法。 背景技术 0002 冬虫夏草， 是麦角菌科真菌冬虫夏草寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸 体的复合体， 是一种传统的名贵滋补中药材， 有调节免疫系统功能、 抗肿瘤、 抗疲劳等多种 功效。 药理学现代研究结果中， 青海冬虫夏草含有虫草酸约7%， 糖类28.9%， 脂肪约8.4%， 蛋 白质约 25%。冬虫夏草中 82.2% 为不饱和脂肪酸， 此外， 尚含有维生素 B12、 麦角脂醇、 六碳 糖醇、 多种生物碱等。 0003 据文献资料报道 ： 北冬虫夏草中虫草酸的含量为 3.0。
7、9 克， 野生的虫草为 5.54 克， 虫草酸是一种 D- 甘露醇， 甘露醇能提高血浆渗透压， 导致组织内的水分进入血管内， 从而 减轻组织水肿， 补充血浆。虫草酸多用于脑水肿， 防治急性肾功能衰竭， 有调节心、 脑、 血管 的作用， 促进人体的新陈代谢、 改善人体的微循环、 降血脂、 降血压。因此， 虫草酸含量的高 低也是判断冬虫夏草质量的重要指标之一。 0004 查阅文献资料得知 ： 冬虫夏草中虫草酸含量的检测方法主要是采用传统的显色方 法或者测定吸光度的方法， 这样会由于杂质的干扰而影响检测结果的准确性。 发明内容 0005 本发明的目的就是为了解决现有虫草酸含量检测方法由于杂质干扰导致。
8、检测结 果准确度较低的问题， 提供一种能够将虫草酸与冬虫夏草中其余化学物质分离开来， 再对 虫草酸进行准确定量的一种利用高效液相色谱法检测冬虫夏草中虫草酸含量的方法。 0006 本发明的检测方法， 由下述步骤组成 ： 0007 供试品溶液制备冬虫夏草原药材 35下鼓风干燥 3 天后， 初磨至毫米级， 再用 南京南大球磨机粉碎至 0.1m 级 ； 称取 0.1g 冬虫夏草药材样品至具塞锥形瓶中， 精密称 定， 加入水 25mL， 称定重量， 超声提取 30min， 称重， 补足减失重量， 以 0.45m 滤膜过滤， 取 滤液作为供试品溶液备用 ； 0008 对照品溶液制备精密称取 55.51mg。
9、 虫草酸对照品于 50mL 容量瓶中， 以水溶解定 容， 摇匀， 即得浓度为 1093.547mg/L 的虫草酸对照品溶液原液， 再分别精密量取对照品原液 0.5mL、 1.0mL、 2.0mL、 4.0mL、 6.0mL 置于 10mL 容量瓶中， 加水稀释至刻度， 摇匀， 即得到浓度分别 为 54.67735mg/L、 109.3547mg/L、 218.7094mg/L、 437.4188mg/L、 656.1282mg/L 的对照品溶液 ； 0009 建立标准曲线虫草酸的色谱分析采用氨基色谱柱， 流动相为乙腈 - 水， 体积比 为 83:17， 流速 1.0mL/min， 进样体积 ：。
10、 10L， 柱温 ： 30， 蒸发光散射检测器进行检测， 漂移 管温度为 100， 雾化气体流速为 2.5L/min ； 在上述色谱条件下进行对照品溶液的色谱分 析， 得到各浓度对照品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积， 以浓度的对数为横坐标， 相对应的色 谱峰面积的对数为纵坐标建立标准曲线 ； 说 明 书 CN 103558327 A 3 2/4 页 4 0010 供试品溶液的色谱分析按步骤中所述的色谱条件进行供试品溶液的色谱分 析， 得到供试品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积， 带入标准曲线中计算即得到供试品溶液中 虫草酸的含量。 0011 本发明的检测方法通过提取冬虫夏草中化学物质， 采用 HPLC-。
11、ELSD 利用各物质间 的分配系数将各物质分开， ELSD 检测器检测虫草酸的含量， 检测过程中排出干扰， 经加样回 收试验验证， 检测结果准确。 附图说明 0012 图 1 是虫草酸标准曲线图 ； 0013 图 2 是批号为 20130506-1 的虫草酸色谱图 ； 0014 图 3 是批号为 20130506-2 的虫草酸色谱图 ； 0015 图 4 是批号为 20130506-3 的虫草酸色谱图 ； 0016 图 5 是批号为 20130506-4 的虫草酸色谱图 ； 0017 图 6 是批号为 20130506-5 的虫草酸色谱图 ； 0018 图 7 是批号为 20130506-6 。
12、的虫草酸色谱图。 具体实施方式 0019 实施例 1 0020 供试品溶液制备冬虫夏草原药材 35下鼓风干燥 3 天后， 初磨至毫米级， 再用 南京南大球磨机粉碎至 0.1m 级 ； 称取 0.1g 冬虫夏草药材样品至具塞锥形瓶中， 精密称 定， 加入水 25mL， 称定重量， 超声提取 30min， 称重， 补足减失重量， 以 0.45m 滤膜过滤， 取 滤液作为供试品溶液备用 ； 0021 对照品溶液制备精密称取55.51mg虫草酸对照品于50mL容量瓶中， 以水溶解定 容， 摇匀， 即得浓度为 1093.547mg/L 的虫草酸对照品溶液原液， 再分别精密量取对照品原 液 0.5mL、 。
13、1.0mL、 2.0mL、 4.0mL、 6.0mL 置于 10mL 容量瓶中， 加水稀释至刻度， 摇匀， 即得到 浓度分别为 （） 54.67735mg/L（） 109.3547mg/L（） 218.7094mg/L（） 437.4188mg/L （） 656.1282mg/L 的五份对照品溶液 ； 0022 建立标准曲线虫草酸的色谱分析采用氨基色谱柱， 流动相为乙腈 - 水， 体积比为 83:17， 流速1.0mL/min， 进样体积： 10L， 柱温： 30， 蒸发光散射检测器进行检测， 漂移管温度为 100， 雾化气体流速为2.5L/min； 在上述色谱条件下分别对上述五份对照品溶液进。
14、行色谱分析， 得到各浓度的对照品溶液的虫草酸色谱峰的峰面积， 以浓度的对数为横坐标， 相对应的色谱峰面 积的对数为纵坐标建立标准曲线； 标准曲线图如图1中所示。相关数据如表1中所示： 0023 表 1 虫草酸标准曲线建立相关数据 0024 序号（）（）（）（）（） 浓度 mg/L 54.67735109.3547218.7094437.4188656.1282 峰面积1319673278053258403341214662219625960 说 明 书 CN 103558327 A 4 3/4 页 5 0025 供试品溶液的色谱分析按步骤中所述的色谱条件进行供试品溶液的色 谱分析， 共平行做六。
15、个样品， 样品编号分别为 20130506-1、 20130506-2、 20130506-3、 20130506-4、 20130506-5、 20130506-6， 分别得到各样品中虫草酸的峰面积， 上述六个样品 的虫草酸色谱图分别参见图 2、 图 3、 图 4、 图 5、 图 6， 图 7， 带入标准曲线中计算即得到各样 品中虫草酸的含量， 具体结果如表 2 中所示。 0026 表 2 六个供试品溶液中的虫草酸含量 0027 序号峰面积浓度 （mg/L)取样量 （g）含量 （%） 20130506-16558095374.8460.10169.22 20130506-2615442835。
16、7.1650.10898.20 20130506-36365444366.4410.10498.73 20130506-47232749403.8270.10659.48 20130506-55407249323.6810.10527.69 20130506-6520.4272314.3980.10487.50 0028 加样回收试验 0029 重复性试验样品测定称取同一冬虫夏草样品 6 份， 按照实施例 1 中的步骤制 备重复性试验样品的供试品溶液。按照实施例 1 步骤中所述的色谱条件对制备的重复性 供试品溶液进行色谱分析， 得到各供试品溶液中虫草酸的峰面积， 带入标准曲线中计算得 到各供试。
17、品溶液中虫草酸的含量。 计算得出冬虫夏草药材重复性样品中虫草酸的平均含量 为 12.31%。 0030 加样回收实验样品的制备称取经过测定虫草酸含量的冬虫夏草样品六份， 编号 为1、 2、 3、 4、 5、 6， 每份0.05g至具塞锥形瓶中， 精密称定。 每份精确取样量如表3中所示。 分 别在1和2、 3和4、 5和6号样品中加入浓度为1093.547mg/L的虫草酸对照品溶液5mL、 6mL、 7mL， 然后用水补足至 25mL， 称定重量， 超声提取 30min， 称重， 补足减失重量， 以 0.45m 滤 膜过滤， 作为加样回收实验的供试品溶液样品备用 ； 0031 按照实施例 1 步。
18、骤中所述的色谱条件对加样回收实验样品进行色谱分析， 得 到加样回收实验样品中虫草酸的含量， 然后根据虫草酸对照品的添加量及样品中虫草酸的 含量， 计算出添加对照品的回收率。计算得到添加虫草酸对照品的平均回收率为 99.99%。 说明本发明的检测方法准确度高。 0032 加样回收实验的相关数据如表 3 中所示 ： 0033 表 3 加样回收实验的相关数据 说 明 书 CN 103558327 A 5 4/4 页 6 0034 说 明 书 CN 103558327 A 6 1/4 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103558327 A 7 2/4 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103558327 A 8 3/4 页 9 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103558327 A 9 4/4 页 10 图 7 说 明 书 附 图 CN 103558327 A 10 。