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1、(10)申请公布号 CN 103558213 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103558213 A (21)申请号 201310471944.2 (22)申请日 2013.10.11 G01N 21/78(2006.01) (71)申请人 华南农业大学 地址 510642 广东省广州市天河区五山路 483 号 (72)发明人 陈芳艳 冯定远 王林川 (74)专利代理机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 代理人 任重 (54) 发明名称 一种蛋白质烷基化修饰剂 PEG 修饰能力的检 测方法及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种蛋白质烷基化修饰剂 PEG 修饰。
2、能力的检测方法及其应用。本发明方法设置 GSH 经修饰剂修饰与 GSH 不经修饰两组， 分别用 5,5 二硫代对二硝基苯甲酸 （DTNB） 为显色剂， 利用分光光度计测定在波长 412nm 下两组反应体 系的吸光值， 根据两组吸光值的差异来检测蛋白 质氨基 PEG 化修饰剂的修饰能力。本发明进行修 饰剂修饰能力的检测， 既能实现定性检测又能实 现定量检测， 整个测定过程在 60min 内可完成， 具 有快速、 简便、 可靠的有益效果。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页。
3、 附图3页 (10)申请公布号 CN 103558213 A CN 103558213 A 1/1 页 2 1. 一种蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： S1. 测定组 ： 按照 2:1 的摩尔比分别准备活化的蛋白质烷基化修饰剂与谷胱甘肽溶液 ； 对照组 ： 谷胱甘肽溶液 ； S2.将S1测定组准备好的修饰剂与谷胱甘肽溶液进行反应， 反应体系的pH值为8.0 10.0、 反应温度为 35 55、 反应时间为 30 50min ； S3.S2 所述反应结束后分别在测定组和对照组加入显色剂 5,5 二硫代对二硝基苯甲 酸得到混合体系， 在波长 412nm 下于 。
4、3 6min 内分别测定混合体系的吸光值 ； S4. 根据 S3 测定的测定组和对照组的吸光值差异判断和 / 或计算出修饰剂的修饰能 力。 2. 根据权利要求 1 所述的蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， 其特征在于， 所 述活化的蛋白质烷基化修饰剂为活化的聚乙二醇。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， 所述修饰剂 的活化包括以下步骤 ： S11. 用无水苯重结晶三聚氰氯 ； S12. 取 S11 处理的三聚氰氯溶解于含无水碳酸钠的无水苯中， 加入单甲氧基聚乙二醇 mPEG， 室温下搅拌过夜后过滤 ； 取滤液在搅拌下加入乙醚， 得白色沉淀， 继续搅。
5、拌后抽滤， 所得沉淀用无水苯溶解 ； 上 述沉淀、 溶解重复操作多次， 直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止 ； S13. 将 S12 处理的 mPEG 真空抽干后得到白色粉末的活化 mPEG， 密封冷藏保存备用。 4. 根据权利要求 1 所述的蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， 所述谷胱甘肽溶 液的浓度为 1.0mmol/L。 5.根据权利要求1所述的蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， 所述显色剂DTNB 浓度为 1.0mmol/L。 6.根据权利要求1所述的蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， S2所述反应体系 的 pH 值为 9.0， 所述 pH 值采用 0.1mol/L pH9。
6、.0 的巴比妥钠 - 盐酸缓冲溶液调节。 7. 根据权利要求 1 所述的蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， S2 所述反应时 间为 40min。 8. 根据权利要求 1 所述的蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， S2 所述反应温 度为 45。 9.权利要求1至8任一项所述蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法在蛋白质烷基 化修饰剂质量检测方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 103558213 A 2 1/8 页 3 一种蛋白质烷基化修饰剂 PEG 修饰能力的检测方法及其应 用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 更具体地， 涉及一种蛋白质烷基化 PEG 修饰剂修饰能 力的检。
7、测方法和应用。 背景技术 0002 20 世纪 50 年代末期， 用化学修饰的方法研究蛋白质分子的结构与功能的关系成 为生物化学和分子生物学领域的热点。 蛋白质化学修饰的目的是用于生物医学和生物技术 方面。 在生物医学方面， 化学修饰可以降低免疫原性的免疫反应性、 抑制免疫球蛋白E 的产 生等 ； 在生物技术领域， 酶经过化学修饰后能够在有机溶剂中高效地发挥催化作用， 并表 现出新颖的催化性能。 0003 蛋白质修饰剂与蛋白质发生反应的性质， 主要可以分为四种类型 ：（1） 酰化及其 相关反应， 这类修饰剂可以与蛋白质的侧链基团发生酰基化反应 ；（2） 烷基化反应， 这类修 饰剂的特点是带有活。
8、泼的卤素原子， 由于卤素原子的电负性， 使烷基带有部分正电荷， 很容 易导致蛋白质分子的亲核基团发生烷基化 ；（3） 氧化和还原反应， 这类修饰剂具有氧化性， 能将侧链基团氧化 ；（4） 芳香环取代反应， 蛋白质氨基酸残基的酚羟基在 3 和 5 位上很容易 发生亲电取代的碘化和硝化反应。有代表性的修饰剂有乙酰咪唑、 卤代乙酸、 N- 乙基马来 酰亚胺、 碳化二亚胺、 焦碳酸二乙酯、 四硝基甲烷、 N- 卤代琥珀酰亚胺、 乙二酸 / 丙二酸的 共聚物、 羧甲基纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮、 乙烯 / 顺丁烯二酰肼共聚物、 多聚唾液酸、 聚氨基 酸、 葡聚糖、 环糊精、 聚乙二醇 （PEG ） 等。其。
9、中， PEG 溶解性好， 毒性低， 无免疫原性， 蛋白质 经其修饰后不但保持了水溶性而且在有机溶剂中的溶解性也增加了， 因此 PEG 类修饰剂应 用最多。 0004 由于 PEG 的醇羟基化学性质不活泼， 所以必须通过特定的活化剂与其反应使之活 化。其中氰尿酰氯法是比较经典的方法。该法具有活化反应操作简单、 所活化的 PEG 修饰 能力强、 修饰蛋白质稳定性高等优点， 是目前最常用的PEG 活化方法之一。 经氰尿酰氯活化 后的 PEG 带上卤素原子， 由于卤素原子的电负性， 使烷基带有部分正电荷， 很容易导致蛋白 质分子的亲核基团 （例如 -SH，NH2 等） 发生烷基化反应， 且巯基基团是蛋。
10、白质分子中最 容易反应的侧链基团。因此活化的 PEG 修饰剂很容易与蛋白质中的巯基与氨基发生反应。 0005 但是氰尿酰氯也存在着易水解的问题， 水解后的氰尿酰氯即失去活化 PEG 的能 力， 此外活化后修饰剂的放置时间对其修饰能力产生很大影响， 通常情况下， 随着活化 PEG 在冰箱中放置时间的延长， 其修饰蛋白质的能力会越来越低， 并最终失去修饰能力。 另外在 制备 PEG 修饰剂的过程中， 随着操作及反应条件的变化， PEG 修饰能力也会有较大的差异。 所以及时了解和掌握 PEG 修饰剂修饰蛋白质的能力具有重要的意义。 0006 目前还没有理想有效的测定各种活化 PEG 修饰蛋白质的能力。
11、的方法的相关报道。 常远等 （1996） 以牛血清白蛋白 （BSA） 为模型蛋白， 采用凝胶电泳法来测定各种活化 PEG 的 修饰能力， 但该方法操作麻烦、 操作时间长、 结果不理想， 而且不能定量的检测活化 PEG 修 说 明 书 CN 103558213 A 3 2/8 页 4 饰蛋白质的能力。 发明内容 0007 本发明要解决的技术问题是克服现有检测活化 PEG 修饰蛋白质的能力的技术不 足， 提供一种检测蛋白质烷基化 PEG 修饰剂修饰能力的方法， 该方法既能实现定性检测又 能实现定量检测， 快速、 简便、 可靠。 0008 本发明的另一目的是提供所述方法的应用。 0009 本发明的目。
12、的通过以下技术方案予以实现 ： 提供一种蛋白质烷基化修饰剂修饰能力的检测方法， 包括以下步骤 ： S1. 测定组 ： 按照 2:1 的摩尔比分别准备修饰剂与谷胱甘肽 （GSH） 溶液 ； 对照组 ： 谷胱 甘肽 （GSH） 溶液 ； S2.将S1测定组准备好的修饰剂与谷胱甘肽溶液进行反应， 反应体系的pH值为8.0 10.0、 反应温度为 35 55、 反应时间为 30 50min ； S3.S2 所述反应结束后分别在测定组和对照组加入显色剂 DTNB 得混合体系， 在波长 412nm 下于 3 6min 内分别测定混合体系的吸光值 ； S4. 根据 S3 测定的测定组和对照组混合体系的吸光值。
13、差异计算出修饰剂的修饰能力。 0010 本发明所述活化的蛋白质烷基化修饰剂优选为活化的聚乙二醇。 0011 作为优选的修饰剂活化方法， 包括以下步骤 ： S11. 用无水苯重结晶三聚氰氯 ； 优选重结晶 2 次 ； 所述无水苯经 3A 分子筛除水 ； S12. 取 S11 处理的三聚氰氯溶解于含无水碳酸钠的无水苯中， 加入单甲氧基聚乙二醇 mPEG， 室温下搅拌过夜后过滤 ； 取滤液在搅拌下加入乙醚， 得白色沉淀， 继续搅拌后抽滤， 所得沉淀用无水苯溶解 ； 上 述沉淀、 溶解重复操作多次， 直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止 ； S13. 将 S12 处理的 PEG 真空抽干后得到白色粉末 。
14、mPEG （活化的 PEG） ， 密封冷藏保存备 用。可以采用真空干燥器抽干， 抽干后置于冰箱密封保存备用。 0012 其中， 修饰剂活化反应机理如下 ： 优选地， S1 所述谷胱甘肽溶液的浓度为 1.0mmol/L。 0013 优选地， S2 所述 pH 值为 9.0， 所述 pH 值使用 0.1mol/L pH9.0 的巴比妥钠 - 盐酸 缓冲溶液调节。 0014 优选地， S2 所述反应时间为 40min。 0015 优选地， S2 所述反应温度为 45。 0016 优选地， S3 所述显色剂 DTNB 浓度为 1.0mmol/L。 说 明 书 CN 103558213 A 4 3/8 。
15、页 5 0017 本发明所述蛋白质氨基烷基化修饰剂修饰能力的检测方法可应用于蛋白质氨基 烷基化修饰剂质量检测方面。 0018 本发明方法应用以下原理 ： 本发明利用上述氰尿酰氯法活化的蛋白质烷基化修饰剂 （例如活化的 PEG） 带有活泼的 卤素原子， 由于卤素原子的电负性， 使烷基带有部分正电荷， 很容易导致蛋白质分子的亲核 基团 （例如 -NH2， -SH 等） 发生烷基化反应， 因此蛋白质分子的侧链基团氨基、 巯基等在一定 的条件下可以与活化的 PEG 反应， 生成 PEG- 蛋白。以 GSH 为例， GSH 与活化的 PEG 修饰剂 的反应式见图 1。 0019 蛋白质的巯基可以与 5,。
16、5 二硫代对二硝基苯甲酸 （DTNB） 反应， 断裂 DTNB 的二 硫键产生2-硝基-5-硫代苯甲酸 （NTB-） ， 在中性或碱性pH条件下的水中可以离子化， 生成 呈现黄色的 NTB2- 二价阴离子， 可在可见 - 紫分光光度计上检测到。以谷胱甘肽 GSH 为例， GSH 与显色剂 DTNB 的反应式见图 2。 0020 当 GSH 的巯基与修饰剂发生反应后， 再加入 DTNB 溶液， GSH 就不再与 DTNB 发生反 应生成浅黄色 5- 硫代 -2- 硝基苯甲酸阴离子， 因而被修饰后的 GSH 不显色， 因此根据修饰 前后测定的反应体系吸光值的差异， 可以检测修饰剂的修饰能力， 即相。
17、同质量的修饰剂修 饰 GSH 后， 再加入 DTNB 显色剂， 进行平行对比， 生成的黄色越浅， 说明修饰剂的修饰能力越 强。 0021 进一步地， 本发明根据修饰前后测定的反应体系吸光值数值可以定量检测修饰剂 的修饰能力。 0022 修饰能力计算公式为 ： 另外， 本发明所述的蛋白质烷基化修饰剂在对蛋白质进行修饰的过程中， 不仅与蛋白 质的氨基进行反应， 同时会与蛋白质的巯基发生反应。因此可应用上述机理来检测蛋白质 烷基化修饰剂的修饰能力， 实现本发明的目的。 0023 本发明具有以下有益效果 ： 本发明方法可准确确定蛋白质烷基化修饰剂是否具备有修饰蛋白的能力以及修饰能 力的大小， 从而避免。
18、在蛋白质的修饰试验结束后才发现问题， 便于问题的查找， 避免试验成 本的浪费 ； 同时也有利于修饰剂的定量使用。 0024 采用本发明方法检测氨基烷基化修饰剂的修饰蛋白能力， 整个检测过程在 60min 内可完成， 快速， 简便。 0025 本发明检测方法机理明确， 可适用于能与蛋白质发生烷基化反应的修饰剂， 即可 与蛋白质分子的亲核基团 （如NH2、 SH 等） 等发生反应的修饰剂都在本发明的适用范围 中， 具有重要的推广应用价值。 附图说明 0026 图 1 为谷胱甘肽 GSH 与活化的 PEG 修饰剂的反应式。 0027 图 2 为谷胱甘肽 GSH 与显色剂 DTNB 的反应式。 说 明。
19、 书 CN 103558213 A 5 4/8 页 6 0028 图 3 为本发明方法 pH 值对修饰能力的影响。 0029 图 4 为本发明方法反应时间对修饰能力的影响。 0030 图 5 为本发明方法反应温度对修饰能力的影响。 具体实施方式 0031 以下结合附图和具体实施例来进一步说明本发明， 除非特别说明， 本发明采用的 试剂、 设备为本技术领域常规试剂和设备。 0032 实施例 1 1. 试剂的制备 （1） 1.0mmol/L GSH 溶液 ： GSH 3.07mg 用 0.1mol/L pH9.0 的巴比妥钠 - 盐酸缓冲液溶解， 稀释定容至 10mL， 现用 现配。 0033 （。
20、2） 0.32mol/L Na2HPO4溶液 ： Na2HPO429.92g 双蒸水溶解并稀释定容至 200mL。 0034 （3） 1.0mmol/L DTNB（5,5 - 二硫代对二硝基苯甲酸 ) 显色溶液 ： 称取 20mg DTNB、 柠檬酸三钠 500mg， 双蒸水溶解并稀释定容至 50mL（棕色瓶避光保存 于 4冰箱） 。 0035 （4） 5mmol/L 活化 mPEG5000 溶液 ： A修饰剂的活化 参照 Abuchowski （1977） 的方法并进行改进优化 ： 三聚氰氯用前先用无水苯 （3A 分子筛 除水） 重结晶两次 ； 取 5.5g 二次重结晶的三聚氰氯溶解于 40。
21、0mL 含 10g 无水碳酸钠的无水 苯中， 加入 50g mPEG-5000， 室温下搅拌过夜， 过滤， 取滤液约 400mL 搅拌下缓慢加入 600mL 乙醚， 沉淀出白色产物后继续搅拌 20min， 抽滤， 沉淀再用 400mL 无水苯溶解， 如此沉淀、 溶 解重复多次， 直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止。将活化的 mPEG 置于真空干燥器中抽 干， 得到白色粉末活化的 mPEG， 在冰箱中密封保存。 0036 B称取 mPEG 250mg 用 0.1mol/L pH9.0 的巴比妥钠 - 盐酸缓冲液溶解， 稀释定容 至 10mL， 配制得到 5mmol/L mPEG 溶液。 0037。
22、 本实施例所述蛋白质氨基 PEG 化修饰剂修饰能力的检测操作步骤见表 1 所示 ： 表 1 说 明 书 CN 103558213 A 6 5/8 页 7 如表 1 所示， 显色反应结束后 3min 6min 内测定波长 412nm 处吸光值， 空白管用来调 零。结果为测定空白管吸光值 0.0012， 说明修饰剂在 412nm 波长处无光吸收。对照管吸光 值 0.7280、 测定管吸光值 0.3124， 表明了修饰剂具备较高的修饰能力。 0038 由上述修饰能力计算公式可得活化的mPEG-5000对GSH的修饰能力为57.25%。 表 明了本发明方法可以准确的定量检测修饰剂的修饰能力。 0039。
23、 另外， 对显色反应结束后四组管的颜色进行比对， 空白管和测定空白管透明无色， 对照管为深黄色， 测定管为浅黄色， 表明所制备的修饰剂具有较强的修饰能力。 同时也表明 了本发明方法可以准确的定性检测修饰剂的修饰能力。 0040 实施例 2 1. 试剂的制备 （1） 1.0mmol/L GSH 溶液、 0.32mol/L Na2HPO4溶液以及 1.0mmol/L DTNB（5,5 - 二硫 代对二硝基苯甲酸 ) 显色溶液配制方法同实施例 1。 0041 （2） 5mmol/L 活化的 mPEG10000 溶液 ： A修饰剂的活化 参照 Abuchowski （1977） 的方法并进行改进优化 。
24、： 三聚氰氯用前先用无水苯 （3A 分子筛 除水） 重结晶两次 ； 取 5.5g 二次重结晶的三聚氰氯溶解于 400mL 含 10g 无水碳酸钠的无水 苯中， 加入100g mPEG10000， 室温下搅拌过夜， 过滤， 取滤液约400mL搅拌下缓慢加入600mL 乙醚， 沉淀出白色产物后继续搅拌 20min， 抽滤， 沉淀再用 400mL 无水苯溶解， 如此沉淀、 溶 解重复多次， 直到紫外检测无三聚氰氯的吸收峰为止。将活化的 mPEG10000 置于真空干燥 器中抽干， 得到白色粉末活化 mPEG10000 ， 在冰箱中密封保存。 0042 本实施例所述蛋白质氨基 PEG 化修饰剂修饰能力。
25、的检测操作步骤见表 2 所示 ： 表 2 说 明 书 CN 103558213 A 7 6/8 页 8 如表 2 所示， 显色反应结束后 3min 6min 内测定波长 412nm 处吸光值， 空白管用来调 零。结果为测定空白管吸光值 0.0027， 说明修饰剂在 412nm 波长处无光吸收。对照管吸光 值 0.7280、 测定管吸光值 0.4103， 表明了修饰剂具备较高的修饰能力。 0043 由上述修饰能力计算公式可得活化的 mPEG-5000 对 GSH 的修饰能力为 44%。表明 了本发明方法可以准确的定量检测修饰剂的修饰能力。 0044 另外， 对显色反应结束后四组管的颜色进行比对，。
26、 空白管和测定空白管透明无色， 对照管为深黄色， 测定管为浅黄色 （比实施例1中测定管的颜色深） ， 表明所制备的修饰剂具 有较强的修饰能力。同时也表明了本发明方法可以准确的定性检测修饰剂的修饰能力。 0045 同时， 根据实施例 1 和实施例 2 中测定管的颜色与对照管相对， 颜色越浅， 说明修 饰剂的修饰能力越强。 更加说明了本发明方法可以准确的定性及定量检测修饰剂的修饰能 力。 0046 实施例 3 本发明方法最佳测定条件的确定试验 为确定最佳的反应条件， 本发明长期大量地实验摸索包括单因素实验和比较分析。以 下将最终的实验结果叙述如下 ： （1） 修饰剂与 GSH 反应质量最佳摩尔比的。
27、选择 本发明人根据反应机理分析确定本发明方法中 mPEG 与 GSH 反应的质量比按摩尔比按 2 ： 1 进行。GSH 有氨基和巯基两个可反应基团， 因此一分子 GSH 可与两分子 mPEG 发生反应， 故 mPEG 与 GSH 的质量比按 2 ： 1 的摩尔比进行， 便于对修饰剂修饰能力的计算， 大量实验证 明严格按照 mPEG 与 GSH 的摩尔比为 2 ： 1 进行试验， 可准确判断和计算得到修饰剂修饰能 力。反应机理如下 ： （2） 最宜反应 pH 值的确定 摩尔比按 2 ： 1 比例加 mPEG 与 GSH， 在 37、 pH7.0 9.0 的条件下反应 40min 后取出， 测定修。
28、饰剂的修饰能力， 试验结果如附图 3 所示。 0047 由附图3可知， 修饰剂的修饰能力随着pH值的不断升高而上升， 在pH为9.0时， 修 饰能力达最大值， 继续增加 pH 值， 修饰能力提高不大反而略有下降。据此， 选择 pH9.0 为反 说 明 书 CN 103558213 A 8 7/8 页 9 应体系的最佳 pH 值。由上述反应式知， 反应要求在碱性环境中进行， 反应过程中生成 HCl， 为了使反应能向右进行彻底反应， 需将反应体系的 pH 值维持在 9.0。 0048 （3） 最宜反应时间的选择 按摩尔比按 2 ： 1 比例加入 mPEG 与 GSH， 在反应体系的 pH 值为 9。
29、.0， 37条件下反应， 每 10min 取样测定修饰能力， 结果如附图 4 所示。 0049 由附图4可以看出， 修饰剂的修饰能力随着反应时间的增加而增加， 在40min时达 最大值， 之后继续延长时间， 反而略微下降。据上， 选择 40min 为反应的最佳时间。 0050 （4） 最佳反应温度的选择 按摩尔比 2 ： 1 比例加入 mPEG 与 GSH， 在反应体系的 pH 值为 9.0， 温度为 25（常温） 、 35、 45、 55条件下反应 40min 后取出， 测定修饰剂的修饰能力， 结果如附图 5 所示。 0051 由附图 5 可以看出， 修饰剂的修饰能力随着反应温度的上升而增加。
30、， 在 45时达 最大值， 之后继续升高温度， 修饰剂的修饰能力略微下降。据上， 选择 45为反应的最佳温 度。 0052 （5） 显色时间的选择 将待测样品与DTNB显色液快速混匀后迅速置于分光光度计中， 于波长412nm处测定吸 光值， 记录下每分钟吸光值的变化， 实验结果如表 3 所示。 0053 表 3 显色时间对吸光值的影响 表 3 表明， 加入显色剂后在 1 2min 内 A412nm 是上升的， 3 -6min 时 A412nm 稳定不 变， 6min 后 A412nm 开始缓慢下降。因此选择测定时间为加入显色剂后 3 6min 内测定。 如果样品很多， 短时间内测不完， 在 1。
31、0min 内完成测定对结果影响不大。 0054 综上所述， 该方法最优选的方案为以 DTNB 为显色剂， mPEG 与 GSH 反应按摩尔比 2 ： 1， 在pH9.0的反应体系中， 45条件下反应40min， 取出样品加入显色剂后于36min内测 定波长 412nm 处修饰前后 GSH 的吸光值， 根据修饰前后 GSH 的吸光值差异计算出修饰剂的 修饰能力。 0055 实施例 4 本发明方法检测修饰剂修饰能力的可靠性和准确性验证试验 为了验证本发明方法检测修饰剂修饰能力的可靠性和准确性， 本发明同时用 TNBS 法 测定了 GSH 的残留氨基的量， 计算其氨基修饰率， 将两种方法测定的结果进。
32、行比较， 结果如 表 4。 0056 表 4 两种方法对比的结果 说 明 书 CN 103558213 A 9 8/8 页 10 表 4 表明， 采用两种方法测定即按试验建立的测定修饰剂修饰能力的方法与测定蛋白 氨基残留量的结果比较， 所得到的结果非常接近， 表明该方法检测修饰剂的修饰能力可靠。 说 明 书 CN 103558213 A 10 1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103558213 A 11 2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103558213 A 12 3/3 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 103558213 A 13 。