一种合欢叶片中的内生菌H6菌株分离方法及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103555607 A (43)申请公布日 2014.02.05 CN 103555607 A (21)申请号 201310365784.3 (22)申请日 2013.08.21 CGMCC No.7790 2013.08.13 C12N 1/20(2006.01) A01P 3/00(2006.01) G01N 30/06(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人 青岛农业大学 地址 266109 山东省青岛市城阳区长城路 700 号青岛农业大学化学与药学院 (72)发明人 曲田丽 金玉兰 肖琳 李秀岚 (54) 发明名称 一种合欢叶片。

2、中的内生菌 H6 菌株分离方法 及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种合欢叶片中的内生菌 H6 菌 株分离方法及其应用， 该分离方法包括 ： 采用 75% （体积分数） 酒精浸泡 2min， 再用 10% 次氯酸钠溶 液浸泡3min， 无菌水冲洗2-3次， 可达到合欢叶片 表面最佳的消毒效果和内生菌 H6 分离的最适条 件。 本发明经试验证明H6菌株、 发酵液、 无菌株发 酵液及其从 H6 发酵液中分得的活性组分对供试 的植物病原菌苹果腐烂病菌， 葡萄黑痘病菌、 西瓜 枯萎病菌、 小麦赤霉病菌等均具有较强的抑制作 用。 本发明采用液- 液萃取法对内生菌H6的代谢 液提取， 得 10 个组分，。

3、 其中活性高的组分 1、 2 和 8 样品硅烷化衍生后进行 GC-MS 检测， 鉴定出其中 脂肪酸、 芳香酸、 环二肽、 甾醇类等 25 种具抗菌活 性的物质。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 13 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书9页 附图13页 (10)申请公布号 CN 103555607 A CN 103555607 A 1/1 页 2 1. 一种合欢内生菌 H6， 分离自山东省青岛市城阳区种植的合欢叶片中， 由中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏名 H6 解淀粉。

4、芽孢杆菌 （Bacillus amyloliquefaciens） ， 保藏号 ： CGMCC No. ： 7990。 2. 根据权利要求 1 所述的一种合欢内生菌 H6， 其特征在于， H6 在 LB 固体培养基和 LB 液体培养基中培养， 培养条件 ： 温度30-32， 培养时间24-48h， 该菌的鉴定特征为 ： H6为杆状 细菌， G+性， 芽孢中生。 3. 一种合欢内生菌 H6 的制备方法， 其特征在于包含以下步骤 ： （1） 选取新鲜无病斑的合欢叶， 用流水冲净叶片的表面， 然后用无菌水冲洗 3-4 次， 再 用 75（体积分数） 酒精消毒， 消毒时间为 2min， 再用 10次氯。

5、酸钠溶液再次消毒， 消毒时 间为 3min 左右， 即可达到合欢叶片表面的彻底消毒 ； （2） 采用组织块法， 无菌条件下， 取表面消毒处理后的合欢叶片表面接触 LB 培养基 2-3min 后取出， 作为对照， 用解剖刀将消毒后叶片剪成 5 mm5 mm 小块， 然后接种在 LB 平 板培养基上， 于 30恒温培养箱黑暗培养 2-3d， 根据菌落形态、 颜色等挑取单菌落， 采用平 板划线分离培养法纯化， 直至获得纯培养， 命名为 H6。 4. 一种合欢内生菌 H6 的抑菌用途， 其特征在于 ： 内生菌 H6 菌体本身、 发酵液、 无菌代 谢产物及代谢物中活性组分均具有抑菌作用。 5. 根据权利。

6、要求 4 所述的抑菌用途， 其特征在于 ： 所属的菌为苹果腐烂病菌， 葡萄黑痘 病菌， 西瓜枯萎病菌， 小麦赤霉病菌， 辣椒炭疽病菌， 辣椒炭疽病菌。 6. 根据权利要求 5 所述的抑菌用途， 其特征在于 ： 合欢内生细菌 H6 对苹果腐烂病、 葡 萄黑痘病、 西瓜枯萎病、 小麦赤霉病， 辣椒炭疽病， 辣椒炭疽病的具有潜在的防治作用。 7. 一种合欢内生菌 H6 抑菌活性组分的分离和检测方法， 其特征在于 ： 在 GC-MS 中无 法检测， 进行各组分的衍生化， 方法如下 ： 甲氧胺盐酸盐以 20mg/mL 的含量溶解于吡啶溶 液， 超声帮助溶解， 吸取 100l 溶剂加入已离心干燥好的样品管。

7、中， 封口， 超声 15min， 涡旋 1min， 帮助溶解， 稍微离心， 30培养 2h， 加入 100L BSTFA 至样品管中， 封口， 超声 20min 溶解， 稍微离心， 37培养 6h， 离心 15min， 转速 12000r/min， 吸取 160L 至 GC 样品玻璃管 中。GC-MS 检测条件 ： HP-5MS 毛细管柱 (30m0.25mm0.25m)。进样口温度为 65， 进 样体积 1L， 流速 1mL/min， 柱箱程序 ： 初始温度 65保持 2min ； 以 5 /min 升至 185 ； 以 1 /min 升温至 200； 再以 15升温至 280， 保持 5m。

8、in， 氦气为载气， 恒压模式， 进样 口压力58.7kPa， 离子源和传输线温度分别为230和280， 电子能量70eV， 全扫描扫描范围 m/z20 650， 溶剂延迟时间 5.5min， 检测的样品中， 环 （PHE-PRO） 具有 抗菌活性， 其保留时 间为 19.91min。该化合物的结构式为 ： 权 利 要 求 书 CN 103555607 A 2 1/9 页 3 一种合欢叶片中的内生菌 H6 菌株分离方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种新筛选的合欢内生细菌， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心， 保藏名 H6 解淀粉芽孢杆菌 （Bacillus amy。

9、loliquefaciens） ， 保藏号 ： CGMCC No. ： 7990 ； 保藏单位地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研 究所 ； 保藏时间 ： 2013 年 8 月 13 日。该菌及发酵液中的活性成分对可引起植物病害的病原 真菌具有显著的抑菌活性， 可制备成生物农药， 用于田间病害的防治。 技术背景 0002 合欢内生菌 H6（保藏编号 CGMGG No. ： 7990） 自山东省青岛市城阳区青岛农业大 学校园内种植的合欢 （Albizzia julibrissin Durazz.） 叶片中筛选出的具有抑菌活性的 内生细菌， 经过大量室内实验研究结。

10、果表明它对苹果腐烂病菌、 葡萄黑痘病菌、 西瓜枯萎病 菌、 小麦赤霉病菌等植物病原菌具有较高的生物活性， 可用于相应田间病害的防治。 0003 长期以来， 我国农药生产以仿制为主， 知识产权的保护和市场竞争的形势迫使我 国必须将创制新药的研究放在重要位置。 我国天然药物资源丰富、 经济基础相对比较薄弱， 从天然产物中寻找创新药物适合现阶段国情。随着分离分析技术的进步， 许多结构复杂及 微量成分获得纯品并确定其化学结构成为可能， 极大地丰富了天然药物的来源。 近几年， 药 用植物新资源的寻找集中在其内生菌方面。传统药用植物中都存在很多内生菌， 其在进化 过程中发生了基因重组， 获得了宿主的某些基。

11、因， 能够产生与宿主植物相同或更新颖的代 谢产物， 有研究显示， 5l的从植物内生真菌分离的生物活性物质是以前没有发现的化合 物， 其化学结构种类远远高于植物本身及土壤微生物。 已有报道其代谢产物具有抑菌、 抗氧 化及抗肿瘤等多种活性， 这一特点使药用植物内生菌成为人们寻找天然药物和生物活性物 质的新方向， 同时在保护珍稀濒危植物方面也具有重要价值。 0004 合欢 （Albizzia julibrissin Durazz.） 系豆科合欢属植物， 产于我国黄河流域及 以南各地， 朝鲜、 日本、 越南、 印度等地也有分布， 资源非常丰富。 合欢花的干燥花序， 是常用 中药。 现代研究表明， 由于。

12、合欢本身含有机酸、 甾醇及其苷、 黄酮类化合物、 神经酰胺及神经 鞘苷等多种活性物质， 具有抗过敏、 抗肿瘤、 抗炎抗菌、 免疫增强、 镇静安神、 抗抑郁、 抗氧化 等多种药理活性作用， 越来越引起国内外相关学者的关注。赵杰等研究表明合欢叶提取物 对黄瓜霜霉病有很好的预防作用。杨秀娟等研究表明， 合欢叶提取物在 24h 内对南方根结 线虫的抑制率在 50以上， 且其杀卵率达到 81.41%。刘峰等初步研究了合欢叶提取物对油 菜茵核病菌的抑制作用， 金玉兰与贾福丽研究表明， 合欢茎叶正丁醇萃取物对油菜菌核、 苹 果腐烂病、 辣椒炭疽病等病菌均有一定的防治效果， 说明合欢茎叶提取物中确实存在抑菌 。

13、物质， 而 且具有一定的抑菌谱。 对于合欢中内生菌的研究， 至今仅见国内有零星报道， 缪莉 等自合欢树皮中分离出 7 株内生菌用于抗肿瘤活性的筛选。杨嘉等从不同地区的合欢组织 中分离到 268 株内生真菌菌株， 进行了总抗氧化活性的筛选。郑志斌从采集到的合欢组织 中分离、 纯化得到 5 株内生真菌， 通过产孢形态进行菌种鉴定。鉴于合欢叶的提取物具有良 好的杀菌、 抗肿瘤、 抗氧化活性， 从其中分离出的内生菌也具有多种生物活性， 具有进行深 入研究的必要， 本发明基于前期近三年的自合欢叶中进行具抗菌活性的内生菌分离筛选， 说 明 书 CN 103555607 A 3 2/9 页 4 经试验研究发。

14、现， 合欢内生细菌 H6 菌体， 发酵液、 无菌代谢产物、 发酵液中活性组分均具有 较强的抑菌活性。 发明内容 0005 本发明提供了一株新用途的合欢内生细菌 （解淀粉芽孢杆菌） H6 菌株， 它对多种植 物病原真菌的菌丝生长具有明显的抑制作用。 合欢叶片表面消毒的最佳组合为， 叶片用75% （体积分数） 酒精浸泡2min， 再用10%次氯酸钠溶液浸泡3min左右即可达到合欢叶片表面的 彻底消毒。所分得的菌株 H6 在 LB 固体培养基和 LB 液体培养基中的培养温度为 30-32， 转速 180rpm/min， 培养时间为 24-48h， 培养 24h 的种子液， 按 5% 的接种量接种于发。

15、酵培养 基， 发酵液pH为6.8-7.2。 该菌株的菌落在LB培养基上类似圆形， 有隆起， 不透明， 干燥， 菌 落边缘为锯齿状， 表面褶皱， 正反面颜色一致呈浅黄色。经革兰氏染色观察， 为 G+ 性， 杆状 细菌， 长度为 1.17-1.43um， 形成芽孢， 中生。经 17 项生理生化指标测定， 结合 16SrRNA 序 列比对与系统发育树归属， 结果表明， 其与已知 Bacillus amyloliquefaciens 序列同源性 99%， 初步鉴定其为是解淀粉芽孢杆菌。 0006 本发明优化了合欢叶片表面消毒和其内生菌 H6 分离的方法， 采用 75% （体积分数） 酒精浸泡 2min。

16、， 再用 10% 次氯酸钠溶液浸泡 3min， 无菌水冲洗 2-3 次， 即可达到合欢叶片表 面最佳的消毒效果和内生菌 H6 分离的最适条件。 0007 本发明经试验证明H6菌株、 发酵液、 无菌株发酵液及其从H6发酵液中分得的活性 组分对供试的植物病原菌苹果腐烂病菌， 葡萄黑痘病菌、 西瓜枯萎病菌、 小麦赤霉病菌等均 具有较强的抑制作用， 目的在于从药用植物合欢中寻找具有生防效果的内生菌， 并发现具 有抗菌活性的新颖结构物质， 为新生物农药的开发提供模板。 0008 本发明采用液 - 液萃取法对内生菌 H6 的代谢液 （30L） 分别以石油醚、 乙酸乙酯和 正丁醇萃取， 将具有抑菌活性的乙酸。

17、乙酯层进行柱层析， 得 10 个组分， 其中活性高的组分 1、 2 和 8 样品硅烷化衍生后进行 GC-MS 检测， 经 GC-MS 联用仪标准质谱数据库 NIST2005 的 检索， 鉴定出其中脂肪酸、 芳香酸、 环二肽、 甾醇类等 25 种具抗菌活性的物质。 0009 本发明具有以下特点 ： 0010 1、 H6 菌株分离自于药用植物， 在与植物长期共生的条件下， 其基因发生变化， 可以 代谢出药用植物本身具有的一些独特的活性成份， 为新农药的创制提供结构新颖的模板。 0011 2、 H6 菌株为解淀粉芽孢杆菌， 其适应性强， 易培养， 抗菌活性物质产率高。其分离 自植物， 为内生菌， 对。

18、作物无致病性， 而对靶标病原菌具有良好的生防效果。满足开发成生 物农药的要求， 具有安全、 与环境相容性好的特性。 0012 3、 内生菌 H6 菌体本身、 发酵液、 无菌代谢产物及代谢物中活性组分均具有抑菌作 用。经过室内试验证明， 本发明中申请保护的合欢内生细菌 H6 对苹果腐烂病、 葡萄黑痘病、 西瓜枯萎病、 小麦赤霉病等的具有潜在的防治作用， 对作物安全、 杀菌谱较广。 附图说明 0013 图 1H6 系统发育树构建 0014 图 2、 形态学实验 0015 图 3、 革兰氏染色实验 说 明 书 CN 103555607 A 4 3/9 页 5 0016 图 4 乙酸乙酯层对苹果轮纹病。

19、菌抑制作用 0017 图 5 乙酸乙酯层对小麦全蚀病菌抑制作用 0018 图 6 乙酸乙酯层对棉花枯萎病菌抑制作用 0019 图 7 乙酸乙酯层对苹果腐烂病菌抑制作用 0020 图 8 组分 F1、 F2、 F6 对苹果腐烂病菌的抑制作用效果 0021 图 9 组分 F1、 F2、 F8 对苹果轮纹病菌的抑制作用效果 0022 图 10 组分 F2、 F3、 F8、 F9 对小麦全蚀病菌病菌的抑制作用效果 0023 图 11 组分 F1 的总离子流图 0024 图 12 组分 F2 的总离子流图 0025 图 13 组分 F8 的总离子流图 0026 图 14 组分 F1、 F2、 F8 中 。

20、24 种化合物质谱图与组分 F1、 F2、 F8 中 25 种化合物质谱 图 具体实施方式 0027 实施例 1. 合欢内生细菌 （Bacillus amyloliquefaciens） H6 分离纯化方法 0028 （1） 合欢叶片表面最佳消毒方法与时间的筛选 0029 采用组织印记法对消毒时间进行筛选。具体操作为 ： 选取新鲜无病斑的合欢叶， 用流水冲净叶片的表面 10min， 然后用无菌水冲洗 3-4 次， 再用 75（体积分数） 酒精消毒， 消毒时间设定为 2min、 3min、 5min， 再用 10次氯酸钠溶液再次消毒， 消毒时间分别设定为 2min、 3min、 5min、 10。

21、min， 将不同处理时间的组织小块用无菌水冲洗 3-5 次， 吸取最后一次 的无菌水冲洗液 100L 涂布于培养基表面作为对照 1 ； 另外， 将消毒后的叶片表面接触 LB 培养基 2-3min后取出作为对照2。 用解剖刀将消毒后叶片剪成5mm5mm小块， 然后接种在 LB 平板培养基 （9cm） 上， 每皿接 3 块， 每处理 3 次重复， 于 30恒温培养箱避光培养 2-3d。 若各对照培养皿中没有菌落出现， 并且相对应的消毒叶片有菌落出现， 则证明表面消毒方 法合适， 选取这一组合方法作为最佳消毒方法。 经组织印记法检验消毒效果， 确定较为合适 的合欢叶片组织表面消毒方法为 ： 75%（。

22、体积分数） 酒精浸泡 2min， 再用 10% 次氯酸钠溶液 浸泡 3min 左右即可达到合欢叶片表面的彻底消毒。 0030 （2） 合欢内生细菌 H6 的分离纯化 0031 采用组织块法， 无菌条件下， 取表面消毒处理后的合欢叶片表面接触 LB 培养基 2-3min后取出， 作为对照。 用解剖刀将消毒后叶片剪成5mm5mm小块， 然后接种在LB平板 培养基上， 于 30恒温培养箱黑暗培养 2-3d， 根据菌落形态、 颜色等挑取单菌落， 采用平板 划线分离培养法纯化， 直至获得纯培养， 命名为 H6。 0032 实施例 2.H6 菌株的鉴定特征 0033 （1） 菌体形态观察和染色反应 003。

23、4 将 H6 接种于 LB 培养基上， 2-3d 后观察， 菌落为圆形， 干燥， 菌落边缘为锯齿状， 菌 落扁平， 不透明， 正反面颜色一致为淡黄色。经革兰氏染色观察， 为 G+ 性， 杆状细菌， 长度为 1.17-1.43um， 形成芽孢， 中生。 0035 （2） H6 的生理生化特性 0036 触酶实验、 淀粉水解、 卵磷脂酶、 V-P 测定、 柠檬酸盐的利用、 酪酛水解、 吲哚、 硝酸 盐还原、 丙二酸盐的利用等实验项目均为阳性， 而明胶液化、 运动性、 甲基红实验、 脲酶、 酪 说 明 书 CN 103555607 A 5 4/9 页 6 氨酸水解、 苯丙氨酸脱氨酶、 纤维素分解等实。

24、验项目均显阴性。 0037 表 1H6 菌株生理生化特性 0038 0039 注 ： ： 阳性， ： 阴性 0040 （3） 16S rRNA 序列比较分析与系统发育树的构建 0041 提取 H6 的基因组 16S rRNA 进行 PCR 扩增， 16S rRNA 基因 PCR 扩增， 两个通用性 引 物 为 27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和 1492R(5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3） 。 PCR 反应结束后， 取 25L 产物于 1.2% 的琼脂糖凝胶中电泳， 经 EB 染色后， 于凝胶成像仪 检测， 并将 1.5kb 左右的产物切胶回收。基因序。

25、列测定由北京博迈德科技发展有限公司服 务有限公司完成。H6 的 16S rRNA 基因序列通过 NCBI 的 Blast 检索系统进行序列同源性 分析， 使用 Lasergene 软件与从 GenBank 数据库中获得的 16S rRNA 序列进行多序列匹配 排列 （Multiple Alignments） ， 使用 Mega5.1 软件， 采用相邻连接方法 （Neighbor joining method） 获得系统进化树。其与 Bacillus amyloliquefaciens 同源性 99%， 结合生理生 化指标， 推测 H6 为解淀粉芽孢杆菌属。 0042 实施例 3 0043 （1。

26、） 合欢内生细菌 H6 对植物病原真菌抑菌作用 0044 将 H6 按 5% 接种于 LB 培养液中， 180rpm/min， 30摇床培养 24h。无菌条件下， 用 打孔器打取供试植物病原真菌菌饼 （5mm） 接种在 PDA 平板培养基中央， 吸取 50LH6 的发 酵液滴加于滤纸片 （5mm） 上， 晾干。将晾干的滤纸片距菌饼 20mm 周围摆放， 置于， 28培养 箱中培养 3-4d， 测量抑菌带宽度。 0045 表 2 合欢叶片内生细菌 H6 对病原真菌的抑菌活性 0046 0047 （2） 合欢内生细菌 H6 无菌发酵液对植物病原真菌抑菌作用 0048 将 H6 按 5% 接种于 L。

27、B 培养液中， 180rpm/min， 30摇床分别培养 2、 4、 6、 8d， 然后 将所得发酵液于 10000rpm 离心机中离心 10min 去除菌体， 得上清液， 将上清液过细菌滤膜 说 明 书 CN 103555607 A 6 5/9 页 7 (0.22m)。将所得上清液的分成两份， 一份于 100水域下加热 15min 后备用。 0049 采用环柱法测定内生菌 H6 不同发酵时间的无菌发酵培养液对苹果腐烂病菌抑制 作用， 无菌条件下， 用打孔器打取供试植物病原真菌菌饼 （5mm） 接种在 PDA 平板培养基中 央， 距菌饼 20mm 处用打孔器打取孔洞 （5mm） ， 吸取 50。

28、LH6 的无菌发酵液加于的孔洞内， 无 菌水做对照。置于 28培养箱中培养 3-4d， 测量抑菌带宽度。 0050 表 3 内生细菌 H6 无菌发酵液对苹果腐烂病病原菌的抑制作用 0051 0052 （3） 合欢内生菌 H6 发酵液中萃取相抑菌活性的测定 0053 按上述方法， H6 经大量发酵培养后， 共获得发酵液 30L， 离心取上清液， 经石油醚、 乙酸乙酯和正丁醇萃取分别得到淡黄色有结晶颗粒的石油醚层浸膏 0.94g， 深褐色粘稠状 的乙酸乙酯层浸膏2.91g和棕黄色有结晶颗粒的正丁醇层浸膏8.53g。 对石油醚， 乙酸乙酯 层， 正丁醇层， 水层提取物分别采用抑菌圈法对苹果腐烂病菌、。

29、 苹果轮纹病菌、 小麦全蚀病 菌和棉花枯萎病菌 4 种病原菌进行生物测定， 每个处理设 3 次重复， 其结果如下 ： 0054 表 4 发酵液各萃取层对 4 种病原菌的抑菌活性 0055 0056 注 ：- 表示无抑制作用。 0057 0058 从实验结果可以看出， 合欢内生菌 H6 代谢产物发酵浓缩液乙酸乙酯层和正丁醇 层提取物对 4 种病原菌都有一定的抑制作用。 0059 （4） 合欢内生菌 H6 抑菌活性组分分离 0060 经初步生测， 确定乙酸乙酯层提取物对 4 种病原菌有较好的抑制效果。所以对乙 酸乙酯层萃取物采用薄层层析和硅胶柱层析进一步分离。采用氯仿 - 甲醇 (V:V)100:。

30、1、 50:1、 25:1、 10:1、 1:1 进行洗脱， 每 10mL 接一馏份， 每一馏份经薄层点样展开后， 分别在紫 外仪和硫酸显色后观察， 确定乙酸乙酯萃取层经硅胶柱分离共得 10 个组分， 在 40减压旋 转蒸干， 各组分用 75% 乙醇溶解分别进行抑菌活性测定， 结果如下 ： 0061 表 5 合欢内生菌 H6 乙酸乙酯层柱层析后各组分抑菌活性 说 明 书 CN 103555607 A 7 6/9 页 8 0062 0063 （5） 合欢内生菌 H6 抑菌活性组分 GC-MS 检测 0064 组分 F1、 F2 和 F8 中一些物质含有活性氢， 不易挥发， 在 GC-MS 中无法。

31、检测， 进行其 硅烷化处理。硅烷化作用可以将硅烷基引入到分子中， 一般是取代活性氢 （如 ： 羟基 -OH， 羧 基 -COOH， 氨基 -NH2， 巯基 -SH， 磷酸盐） 。活性氢被硅烷基取代后降低了化合物的极性， 减 少了氢键束缚， 因此所形成的硅烷化衍生物更容易挥发 ； 同时， 由于含活性氢的反应位点数 目减少， 化合物的稳定性也得以加强。在 GC-MS 中无法检测， 进行各组分的衍生化， 方法如 下 ： 甲氧胺盐酸盐以 20mg/mL 的含量溶解于吡啶溶液。超声帮助溶解。吸取 100l 溶剂加 入已离心干燥好的样品管中， 封口。超声 15min， 涡旋 1min， 帮助溶解。稍微离心。

32、， 30培养 2h。加入 100l BSTFA 至样品管中， 封口。超声 20min 溶解。稍微离心， 37培养 6h。离 心 15min， 转速 12000r/min。吸取 160l 至 GC 样品玻璃管中。 0065 GC-MS检测条件 ： HP-5MS毛细管柱(30m0.25mm0.25m)。 进样口温度为65， 进样体积1L， 流速1mL/min。 柱箱程序 ： 初始温度65保持2min ； 以5/min升至185； 以 1 /min 升温至 200 ； 再以 15升温至 280， 保持 5min。氦气为载气， 恒压模式， 进 样口压力 58.7kPa， 离子源和传输线温度分别为 23。

33、0 和 280。电子能量 70eV。全扫描扫描 范围 m/z20 650。溶剂延迟时间 5.5min。 0066 检测的样品中， 环 （PHE-PRO） 具有抗菌活性， 二异辛基邻苯二甲酸脂与合欢植物提 取物中已报道的化合物类似， 其特性与用途需进一步验证。 0067 表 6 内生细菌 H6 活性组分单体的结构解析 0068 说 明 书 CN 103555607 A 8 7/9 页 9 0069 说 明 书 CN 103555607 A 9 8/9 页 10 0070 说 明 书 CN 103555607 A 10 9/9 页 11 说 明 书 CN 103555607 A 11 1/13 页。

34、 12 图 1 图 2图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 12 2/13 页 13 图 6 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 13 3/13 页 14 图 9 图 10 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 14 4/13 页 15 图 11 图 12 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 15 5/13 页 16 图 13 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 16 6/13 页 17 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 17 7/13 页 18 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 18 8/13 页 19 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 19 9/13 页 20 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 20 10/13 页 21 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 21 11/13 页 22 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 22 12/13 页 23 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 23 13/13 页 24 图 14 说 明 书 附 图 CN 103555607 A 24 。