毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质的提取和检测方法.pdf

本发明提供一种对毛发中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质的提取方法，包括毛发的提取和净化步骤。该提取方法还可以包括一个衍生步骤。本发明还提供一种对毛发中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质进行检测的方法，采用了气相色谱质谱联用仪或液相色谱质谱联用仪。与传统的毛发毒品残留检测方法相比，本发明的方法更温和，且有效地提取出了毛发中的药物并有效地去除了毛发检材中的多种杂质干扰物，具有较高的灵敏度和准确度，可供政府执法部门、检验部门及药检机构使用。

权利要求书
1.  一种毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺类物质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 
（1）清洗毛发，以液氮研磨，得到毛发粉末； 
（2）加入复合毛发处理液并进行超声处理，离心得到预处理上清液；所述复合毛发处理液是0.02-0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5%-10%的牛血清蛋白、0.1%-5%的吐温20，且pH值为2.0-5.0； 
（3）固相萃取柱经平衡后，注入所述毛发预处理上清液，依次用水、0.05-0.15M盐酸溶液和甲醇洗涤杂质；用体积比为90:10-98:2的乙酸乙酯：氨水混合溶液洗脱氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺类物质，得到萃取洗脱液。 

2.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于， 
所述复合毛发处理液是0.025-0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5%-5%的牛血清蛋白、0.1%-3%的吐温20，且pH值为2.0-4.0。 

3.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于， 
步骤（2）所述的超声处理为在37-85℃环境中进行1.5-12小时。 

4.  根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于， 
步骤（2）固相萃取柱依次经甲醇、水和磷酸盐缓冲液进行平衡。 

5.  根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，所述方法还包括有衍生步骤：将所述毛发的固相萃取洗脱液吹干，并用体积比4:1-1:4的乙酸乙酯：七氟丁酸酐混合溶液进行衍生，再复溶于乙酸乙酯，得到衍生产物。 

6.  根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述衍生条件为：55-75℃反应20min—60min。 

7.  根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述衍生步骤为： 
将所述毛发的固相萃取洗脱液吹干，并用体积比4:1-:1:4的乙酸乙酯：七氟 丁酸酐混合溶液，60-70℃反应20min-30min，再复溶于乙酸乙酯，得到衍生产物。 

8.  一种对毛发中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质的检测方法， 
其特征在于，包括以下步骤： 
1）根据权利要求1-4任一项所述提取方法得到所述萃取洗脱液或根据权利要求5-7任一项所述提取方法得到衍生产物； 
2）采用气相色谱质谱联用仪或液相色谱质谱联用仪对所述萃取洗脱液或衍生产物进行检测。 

9.  根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述气相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下： 
进样口温度：150-280℃； 
采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：

10.  根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下： 
①色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C182.1×150mm,3.5μm，接ZORBAX Eclipse XDB-C182.1×12.5mm保护柱；； 
②柱温：室温； 
③流动相：乙腈:乙酸铵缓冲溶液=70：30(V：V)； 
④流速：250μL/min； 
⑤进样量：10μL； 
⑥质谱条件：电喷雾电离离子源，正离子检测模式；碰撞气：Medium；气帘气：25；离子喷雾电压：5500V；雾化气温度：500℃；GS1：70；GS2：60。 

说明书毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质的提取和检测方法
技术领域
本发明属于生物医药检测技术领域，特别是涉及毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质的提取方法和检测方法。 
背景技术
毒品和滥用成瘾性药物危害人体健康和社会安全，一直是国家依法严厉打击的对象，人体毒品残留的检测手段，对执法的辅助作用至关重要。在对人体毒品残留的检测中，毛发检材越来越受关注。相较于传统的生物检材（尿液、血液、唾液、组织等），毛发检材具有无法比拟的独特优势，例如：检出时限长、药物滥用信息全面、抗腐败、易于采取、保存和重复取样等。毛发检测在药物滥用鉴定中的作用也已被确证和公认（Kintz P.Analytical and practical aspects of drug testing in hair.Taylor&Francis Group,LLC,2007:1-19；沈敏,向平.毛发分析基础及应用[M].北京:科学出版社.2010:3-34.）。 
生物检材成分复杂，存在大量的干扰物，毛发中存在许多内源性杂质。因此建立有效的前处理方法分离提取毛发中的目标物是毛发检测中的关键部分。毛发中氯胺酮及苯丙胺类毒品水解常用酸水解、碱水解、酶水解和甲醇提取等方法。酸水解法条件较为温和，释放效率较高，例如，在《氯胺酮滥用的毛发分析研究》中记载的一种酸水解方法，是将洗涤后的毛发样本用0.1mol/L的HCl溶液1mL在45℃水浴中水解过夜，取出冷却后调节pH至pH>10，用乙醚提取，取有机层吹干，得甲醇复溶残留物，再注入气相色谱质谱联用仪加以分析（向平,沈敏,沈保华等.氯胺酮滥用的毛发分析研究.《法医学杂志》2005(21) 4:290-293.）。但该方法依然存在酸水解时间太长，不满足时效性的需求。碱水解药物释放完全，但条件激烈；酶水解适用范围广，释放效率高，但价格昂贵。 
目前，亟需一种对毛发中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质（包括苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDEA、MDA、甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮等）进行高效分离提取的方法，以及进行高灵敏度和高特异性检测的方法。 
发明内容
本发明的目的之一是提供一种毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质的提取方法，该方法非常温和，但又能够有效富集得到氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质。 
实现上述目的的技术方案如下。 
一种毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺类物质的提取方法，包括以下步骤： 
（1）清洗毛发，以液氮研磨，得到毛发粉末； 
（2）加入复合毛发处理液并进行超声处理，并离心得到预处理上清液；所述复合毛发处理液是0.02-0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5%-10%的牛血清蛋白、0.1%-5%的吐温20，且pH值2.0-5.0； 
（3）固相萃取柱经平衡后，注入所述毛发预处理上清液，依次用水、0.05-0.15M盐酸溶液和甲醇洗涤杂质；用体积比为90:10-98:2的乙酸乙酯：氨水混合溶液洗脱氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺类物质，得到固相萃取洗脱液。 
优选地，步骤（2）所述复合毛发处理液0.025-0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，含0.5%-5%的牛血清蛋白、0.1%-3%的吐温20，且pH值2.0-4.0。 
优选地，步骤（2）所述的超声处理为37-85℃进行1.5-12小时，更优选地， 为60-85℃进行2.0-4.0小时。 
优选地，步骤（3）固相萃取柱依次经甲醇、水和磷酸盐缓冲液进行平衡。 
在其中一个实施例中，该方法还包括衍生步骤：将所述毛发的固相萃取洗脱液吹干，并用体积比4:1-1:4的乙酸乙酯：七氟丁酸酐（HFBA）混合溶液进行衍生，再复溶于乙酸乙酯，得到衍生产物。 
优选地，所述衍生步骤为：55-75℃反应20min-60min。 
优选地，所述衍生步骤为：将所述毛发的固相萃取洗脱液吹干，并用体积比4:1-1:4的乙酸乙酯：七氟丁酸酐混合溶液，60-70℃反应20min-30min，再复溶于乙酸乙酯，得到衍生产物。 
本发明的另一目的还提供一种对毛发中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质进行检测的方法，该检测方法灵敏度高，特异性好。 
实现上述目的的技术方案如下。 
一种对毛发中的氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类物质进行检测的方法，包括以下步骤： 
1）根据上述提取方法得到所述固相萃取洗脱液或衍生产物； 
2）采用气相色谱质谱联用仪或液相色谱质谱联用仪对所述固相萃取洗脱液或衍生产物进行检测。 
在其中一个实施例中，所述气相色谱质谱联用仪检测方法的操作条件如下： 
进样口温度：150-280℃； 
采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：
在其中一个实施例中，上述的液相色谱质谱联用仪检测的操作条件如下： 
①色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C182.1×150mm,3.5μm，接ZORBAX Eclipse XDB-C182.1×12.5mm保护柱；； 
②柱温：室温； 
③流动相：V(乙腈):V(乙酸铵缓冲溶液)=70：30； 
④流速：250μL/min； 
⑤进样量：10μL； 
⑥质谱条件：电喷雾电离离子源，正离子检测模式；碰撞气：Medium；气帘气：25；离子喷雾电压：5500V；雾化气温度：500℃；GS1：70；GS2：60。 
本发明提供的一种对毛发中的毒品残留进行提取和检测的方法，操作简单，能有效检测出药物滥用人群毛发中的氯胺酮及苯丙胺类物质等成分和含量，为临床诊断提高科学依据。与传统的检测方法相比，本发明的方法通过用复合毛发处理液对毛发进行预处理和固相萃取，反应条件非常温和，且有效地去除了毛发检材中的多种杂质干扰物，高效分离提取了毛发中的目标物。另外，再进一步通过衍生步骤，更能有效富集到目标物，提高了检测灵敏度。 
附图说明
图1是在阴性毛发基质中添加氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类标准物质，按照实施例3中所述方法进行提取净化、气相色谱质谱联用仪分析所得的总离子流出色谱图，图中标记分别为（A）苯丙胺及其内标，（B）甲基苯丙胺及其内标，（C）甲卡西酮及其内标，（D）MDA及其内标，（E）MDMA及其内标，（F）MDEA及其内标，（G）去甲氯胺酮及其内标，（H）4-甲基甲卡西酮及其内标，（I）氯胺酮及其内标。 
具体实施方式
实施例1 
本实施例是阴性毛发中添加氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺类物质（苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDEA、MDA、甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮），经复合溶液预处理、固相萃取、衍生后进行GC/MS-SIM分析。在同一天每个浓度配制6个样本，测得各成分与内标峰面积的比值，计算回收率及CV值，确定方法回收率、日内检测的精密度；连续5天，分别配制这两个浓度标准添加样本，测得各成分与内标峰面积的比值，计算CV值，确定方法的日间检测精密度和准确度。 
一、实验步骤： 
（1）分别称取约30mg的阴性毛发，用3mL洗洁精、水、丙酮清洗后，剪成1.0mm片段，液氮碾磨，得到研磨后的毛发粉末； 
（2）分别精确称取20mg研磨后的阴性毛发粉末，加入氯胺酮和苯丙胺类标准物质，制得15000pg/mg、80000pg/mg两个浓度水平的加标样品，加入2mL的毛发复合处理液（具体成分为0.025mol/L的磷酸盐缓冲溶液（PBS)，5%的牛血清蛋白，0.1%的吐温20，且其pH值调节为2.0），加入内标，在60℃下超声4h，离心，获得上清液； 
（3）依次用1mL甲醇、1mL水、1mL0.1mol/L的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、1ml0.1M盐酸溶液、3mL甲醇洗涤杂质，压干5min，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比90:10，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液； 
（4）吹干洗脱液，将乙酸乙酯和七氟丁酸酐分别以40μL和10μL的体积比混合，在75℃的环境中衍生20min，冷却，抽干，复溶于50μl的乙酸乙酯中，待气相色谱质谱联用仪分析； 
（5）进行气相色谱质谱联用仪分析，具体检测条件如下： 
①色谱柱：CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱； 
②进样口温度：230℃； 
③载气：氮气，纯度≥99.99%，流速为2.0mL/min； 
④采用不分流进样； 
⑤采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：
⑥采用离子轰击（EI）离子源质谱检测，其中电子能量70eV，离子源温度230℃，接口温度280℃。 
（6）具体结果见表1、表2。在两个浓度添加水平上，氯胺酮、去甲氯胺酮及苯丙胺类回收率均在±10%范围内，日间、日内CV%均小于15%，该方法回收率及日间、日内精密度验证合格。 

表1 


表2 
实施例2 
本实施例是阴性毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺类标准物质，经复合溶液预处理、固相萃取、然后进行液相色谱质谱分析。在15000pg/mg和80000pg/mg两个浓度水平分别配制6个平行样本，计算回收率。 
一、实验步骤： 
（1）分别称取约40mg的阴性毛发，清洗及冷冻研磨过程同实施例1； 
（2）分别精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液（具体成分为0.3mol/L的磷酸盐缓冲溶液，0.5%的牛血清蛋白，3%的吐温，且其pH值调节为2.0），加入内标，在85℃下超声2h，离心，获得上清液； 
（3）固相萃取柱平衡、上样、洗涤过程同实施例1，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比98:2，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液； 
（4）吹干洗脱液，复溶于100μL液相流动相中，待液相色谱质谱仪分析； 
（5）进行液相色谱质谱仪分析，具体检测条件如下： 
①色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(2.1×150mm,3.5μm)(安捷伦公司)，接ZORBAX Eclipse XDB-C18（2.1×12.5mm）保护柱； 
②柱温：室温； 
③流动相：V(乙腈):V(乙酸铵缓冲溶液：20mmoL/L乙酸铵，0.2%甲酸)=70：30； 
④流速：250μL/min； 
⑤进样量：10μL； 
⑥质谱条件：电喷雾电离离子源（ESI），正离子（MRM）检测模式；碰撞气（CAD）：Medium；气帘气（CUR）：25；离子喷雾电压（IS）：5500V；雾化气温度（TEM）：500℃；GS1：70；GS2：60。 
⑦氯胺酮、去甲氯胺酮、苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA、MDA、MDEA、甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮的碎片特征离子，如下表3所示： 

表3 
（6）15000pg/mg和80000pg/mg两个浓度水平回收率结果见表4。回收率均在±10%范围内，验证合格。 

表4 
实施例3 
本实施例是8例药物滥用者毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺类物质（例如苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA）的检测实验示例。 
一、实验步骤： 
（1）分别称取约30mg的滥用者毛发，用3mL洗洁精、水、丙酮清洗后，剪成1.0mm片段，液氮碾磨，得到研磨后的毛发粉末； 
（2）分别精确称取20mg研磨后的滥用者毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液（具体成分为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，1%的牛血清蛋白，3%的吐温，且其pH值调节为2.7），加入内标，在70℃下超声4h，离心，获得上清液； 
（3）依次用1mL甲醇、1mL水、1mL0.1M的磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、1ml0.1M盐酸溶液、3mL甲醇洗涤杂质，压干5min，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比98:2，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液； 
（4）吹干洗脱液，乙酸乙酯：七氟丁酸酐（10μL:40μL）60℃衍生40min，冷却，抽干，复溶于50μL的乙酸乙酯中，待气相色谱质谱联用仪分析； 
（5）称取7份40mg的阴性毛发（即用作对照的正常毛发），分别按照步骤（1）所述方法进行清洗和研磨，得到研磨后的毛发粉末； 
（6）精确称取30mg研磨后的阴性毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液，加入内标，加入标准物质工作溶液，配成0、2500、5000、10000、20000、50000、100000、200000pg/mg的系列浓度标准溶液，混匀；经上述的步骤（2）-（4）进行超声处理、固相萃取和衍生后，待气相色谱质谱联用仪分析； 
（7）对上述的滥用者毛发和阴性毛发经预处理、固相萃取和衍生后的最终提取物，分别进行气相色谱质谱联用仪分析，具体检测条件如下： 
①色谱柱：CD-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)色谱柱； 
②进样口温度：230℃； 
③载气：氮气，纯度≥99.99%，流速为2.0mL/min； 
④采用不分流进样； 
⑤采用程序升温模式，其中柱温变化设定为：
⑥采用离子轰击（EI）离子源质谱检测，其中电子能量70eV，离子源温度230℃，接口温度280℃。 
二、数据处理 
（1）根据阴性毛发制成的系列浓度标准溶液的检测结果，绘制标准浓度定量曲线，具体方法如下： 
采用内标法，以浓度为横坐标，对应浓度的响应值与内标物响应值的比值作为纵坐标，不强制通过原点，进行一元线性回归分析，得到的回归方程如下： 
氯胺酮：y=(2.666e-004)x+(9.696e-003)，(r=0.9987)； 
去甲氯胺酮：y=(1.875e-003)x+(6.664e-002)，(r=0.9991); 
苯丙胺：y=(5.363e-003)x+(-1.003e-002)，(r=0.9998)； 
甲基苯丙胺：y=(2.273e-004)x+(1.119e-002)，(r=0.9991)； 
MDMA：y=(2.256e-003)x+(-2.754e-002)，(r=0.9998)； 
MDA：y=(2.256e-002)x+(-1.097e-002)，(r=0.9999)。 
（2）根据滥用者毛发的检测结果，以及步骤（1）中所得定量曲线和回归方程，计算该8名滥用者毛发中毒品含量如表5所示。在检测的8例样本中，甲基苯丙胺检出5例，浓度在0-35.0pg/mg范围内，部分同时检出其代谢物苯丙胺。MDMA检出3例，浓度在0-30.0pg/mg范围内，同时检出其代谢物MDA。氯胺酮2例，浓度在0-75.0pg/mg范围内，1例同时检出其代谢物去甲氯胺酮。该8例毛发中5例同时检测了氯胺酮及苯丙胺类（甲基苯丙胺、MDMA及其代谢物），无同时检出的现象。 
阴性基质添加标准物质色谱流出图见附图1。 


------表示未检测该项目ND表示未检出 
表5 
实施例4 
本实施例是实施例3中的4例药物滥用者毛发中氯胺酮、去甲氯胺酮和苯丙胺类物质（例如苯丙胺、甲基苯丙胺、MDMA）的检测实验示例。 
一、实验步骤： 
（1）同实施例3； 
（2）分别精确称取20mg研磨后的滥用者毛发粉末，加入2mL的毛发复合处理液（具体成分为0.5mol/L的磷酸盐缓冲溶液，10%的牛血清蛋白，3%的吐温，且其pH值调节为4），加入内标，在70℃下超声4h，离心，获得上清液； 
（3）依次用1mL甲醇、1mL水、1mL0.1mol/L的0.1M磷酸盐缓冲液平衡固相萃取柱，并注入上述毛发预处理上清液，用2mL水、1ml0.15M盐酸溶液、3mL甲醇洗涤杂质，压干5min，最后用乙酸乙酯：氨水(体积比96:4，总量为3mL)洗脱，得到洗脱液； 
（4）吹干洗脱液，乙酸乙酯：七氟丁酸酐（30μL:20μL）55℃衍生60min，冷却，抽干，复溶于50μL的乙酸乙酯中，待气相色谱质谱联用仪分析； 
（5）同实施例3； 
（6）同实施例3； 
（7）具体同实施例3。 
二、数据处理 
数据处理同实施例3，具体结果如下表6所示。实施例3和实施例4检测结果基本一致。 

------表示未检测该项目ND表示未检出 
表6 
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。