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1、(10)申请公布号 CN 103571796 A (43)申请公布日 2014.02.12 CN 103571796 A (21)申请号 201310572486.1 (22)申请日 2013.11.15 CGMCC NO.7657 2013.05.29 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/24(2006.01) G01N 33/68(2006.01) G01N 33/577(2006.01) C07K 14/54(2006.01) C07K 1/22(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 地址 150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端 街 427。
2、 号 申请人 哈尔滨动物生物制品国家工程研究 中心有限公司 (72)发明人 韩凌霞 廉传江 文辉强 司昌德 林欢 陈洪岩 (74)专利代理机构 北京康思博达知识产权代理 事务所 ( 普通合伙 ) 11426 代理人 余光军 (54) 发明名称 鸡白介素 -10 单克隆抗体及其制备方法和应 用 (57) 摘要 本发明公开了鸡白介素 -10 单克隆抗体及其 制备方法和应用。本发明以原核表达的重组蛋白 ChIL-10 为免疫原， 真核细胞系表达的 ChIL-10 蛋白为筛选原， 细胞融合后以 IFA 筛选杂交瘤细 胞， 筛选获得 3 株分泌鸡白介素 -10 单抗的细胞 株 ； 其中杂交瘤细胞株 2F。
3、6 所分泌的单抗效价最 高、 稳定性最高、 特异性最强， 其微生物保藏号为 CGMCC NO.7657。 本发明进一步提供了杂交瘤细胞 株 2F6 及其分泌的单克隆抗体在检测或纯化鸡白 介素 -10 蛋白中的应用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103571796 A CN 103571796 A 1/1 页 2 1.一株分泌鸡白介素-10单克隆抗体的杂交瘤细胞株CHIL-10 2F6， 其特征在于， 其微。
4、 生物保藏号为 ： CGMCC NO.7657。 2. 由权利要求 1 所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。 3.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测或诊断鸡体内的IL-10蛋白试剂中的用 途。 4. 权利要求 1 所述的杂交瘤细胞株 CHIL-10 2F6 在制备纯化 IL-10 蛋白试剂中的用 途。 5. 权利要求 2 所述的单克隆抗体在制备检测或诊断鸡体内的 IL-10 蛋白试剂中的用 途。 6. 权利要求 2 所述的单克隆抗体在制备纯化 IL-10 蛋白试剂中的用途。 7. 按照权利要求 4 或 6 所述的用途， 其特征在于， 包括 ： 将权利要求 1 杂交瘤细胞株 CHIL-10 2。
5、F6 分泌的单克隆抗体吸附在惰性的固相基质上制备成层析柱 ； 当样品流经层析 柱时， 待分离的抗原与固相的单克隆抗体发生特异性结合， 其余成分不能与之结合 ； 将层析 柱充分洗脱后， 改变洗脱液的离子强度或 pH， 欲分离的抗原与抗体解离， 收集洗脱液便得到 纯化的鸡白介素 -10 蛋白。 8. 一种诊断或检测 IL-10 蛋白的 ELISA 检测试剂盒， 其特征在于 ： 含有权利要求 1 所 述杂交瘤细胞株 CHIL-10 2F6 分泌的单克隆抗体。 权 利 要 求 书 CN 103571796 A 2 1/6 页 3 鸡白介素 -10 单克隆抗体及其制备方法和应用 技术领域 0001 本发。
6、明涉及单克隆抗体， 尤其涉及鸡白介素 -10 单克隆抗体以及分泌该单克隆抗 体的杂交瘤细胞株， 本发明进一步涉及该单克隆抗体在检测或纯化鸡白介素 -10 蛋白中的 应用， 属于鸡白介素 -10 单克隆抗体的制备及应用领域。 背景技术 0002 白细胞介素简称白介素， 是由白细胞产生的、 介导细胞间相互作用的细胞因子， 在 细胞的活化、 增殖和分化中起调节作用。 随着分子生物学的发展， 有关鸡白介素基因和功能 的研究已逐渐成为热点， 从鸡中分离出多种白介素， 能够应用于免疫治疗剂、 免疫增强剂、 构建新型基因工程疫苗等方面， 利用白介素等细胞因子增强或调节机体的非特异性免疫， 不仅会有效防控畜禽。
7、疾病， 还能在畜牧业生产中产生巨大的经济效益。 0003 目前， 用于分泌鸡白介素 -10 单克隆抗体的杂交瘤细胞株存在效价低、 稳定性差 等缺陷， 所分泌的单克隆抗体特异性较差， 严重制约了生产应用， 亟待改进。 发明内容 0004 本发明的目的之一是提供一株稳定、 高效分泌鸡白介素 -10 单克隆抗体的杂交瘤 细胞株 ； 0005 本发明的目的之二是提供由该杂交瘤细胞株分泌的鸡白介素 -10 单克隆抗体 ； 0006 本发明的目的之三是将所述的鸡白介素 -10 单克隆抗体应用于检测或纯化鸡白 介素 -10 蛋白。 0007 本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的 ： 0008 一株稳定。
8、、 高效分泌鸡白介素 -10 单克隆抗体的杂交瘤细胞株 CHIL-10 2F6， 其微 生物保藏编号为 ： CGMCC NO.7657 ； 分类命名为 ： 鸡IL-10单克隆抗体杂交瘤细胞株 ； 保藏单 位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 ； 保藏时间是 2013 年 5 月 29 日 ： 保藏 地址 ： 中国北京朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所。 0009 本发明以原核表达的重组蛋白ChIL-10为免疫原， 真核细胞系表达的ChIL-10F和 ChIL-10M 蛋白为筛选原， 细胞融合后以 IFA 筛选杂交瘤细胞上清， 将初步判定为阳性的杂 交瘤细胞。
9、经 2 次克隆化， 获得 3 株分泌 ChIL-10 单抗的细胞株 ： 2F6， 3E6 和 3C12。本发明用 IFA 检测 3 株分泌 ChIL-10 单抗的细胞株培养上清， 测定这 3 株阳性杂交瘤细胞株的效价， 从效价测定结果来看， 2F6 阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水 IFA 效价为 1 ： 2800， 3E6 阳性杂交 瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1 ： 1300， 3C12阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1 ： 1200 ； 从效价测定结果来看， 2F6 阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水 IFA 效价要显著高于其它 2 株阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水 IFA 效价。 0010 本发。
10、明将阳性杂交瘤细胞株 2F6、 3E6 和 3C12 所分泌的单克隆抗体分别与原核重 组蛋白ChIL-10进行Western blot， 试验结果发现， 2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗只与重组 蛋白ChIL-10起反应， 而不与空载体菌体反应， 说明2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗的特异性 说 明 书 CN 103571796 A 3 2/6 页 4 最好 ； 阳性杂交瘤细胞株 3E6 和 3C12 所分泌的单克隆抗体与空载体菌体存在反应， 特异性 较差。 0011 本发明应用杂交瘤细胞株2F6所分泌的单克隆抗体检测经LPS刺激的外周血淋巴 细胞中的 IL-10 蛋白， 试验结果发现， 不同 B 单。
11、倍型鸡的外周血淋巴细胞中均检测到一条 17kDa 大小的蛋白， 检测到的蛋白均与天然 ChIL-10 蛋白 17kDa 相符。 0012 本发明鸡白介素 -10 单克隆抗体具有良好的特异性， 可制备成检测或诊断鸡体内 的 IL-10 蛋白的诊断试剂， 例如， 可以将本发明鸡白介素 -10 单克隆 抗体制备成诊断或检 测 IL-10 蛋白的 ELISA 检测试剂盒。 0013 此外， 本发明鸡白介素 -10 单克隆抗体还可应用于纯化鸡白介素 -10 蛋白 ； 例如， 将本发明单克隆抗体吸附在惰性的固相基质上制备成层析柱 ； 当样品流经层析柱时， 待分 离的抗原与固相的单克隆抗体发生特异性结合， 。
12、其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗 脱后， 改变洗脱液的离子强度或 pH， 欲分离的抗原与抗体解离， 收集洗脱液便可得到纯化的 鸡白介素 -10 蛋白。 附图说明 0014 图 1 单克隆抗体亚类的鉴定结果 ； 分别为 2F6、 3E6， 3C12 的细胞培养液的上清。 0015 图 2 腹水的 IFA 反应结果 (200) ； A ： 腹水稀释 50 倍时的 IFA 结果 ； B ： 腹水稀释 2000 倍时的 IFA 结果 ； C ： 阴性对照。 0016 图 3 单抗与原核重组蛋白 ChIL-10 的 Western blot 的结果 ； 1 ： 原核重组蛋白 ChIL-10 ； 2 。
13、： 空载体菌体 ； M ： 蛋白质分子质量标准。 0017 图4利用单抗2F6检测经LPS刺激的鸡外周血淋巴细胞中的IL-10蛋白结果 ； 1-2 ： 两只鸡个体 ； M ： 蛋白质分子量质量标准。 具体实施方式 0018 下面结合具体实施例来进一步描述本发明， 本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是， 在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换， 但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 0019 1. 生物材料和试剂 0020 1.1 实验动物和细胞 0021 。
14、BALB/c 雌性小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心 ； 小鼠骨 髓瘤细胞系 SP2/0 由本发明人实验室保存。 0022 1.2 主要试剂 0023 50HAT、 100HT添加剂均购自GIBCO ； 胎牛血清 ： BIOCHROM,Berlin ； DyLight594 标记羊抗鼠 IgG 购自 Jackson ImmunoResearch 公司 ； IRDyeTM680 标记山羊抗鼠 IgG 购自 LI-COR 生命科学公司 ； IgG 抗体亚类试剂盒购自 Southern Biotech 公司 ；组织裂 解液购自 Thermo Fisher 科技公司 ； 鼠抗 -Act。
15、in 的单抗购自中杉金桥公司。 0024 实验例 1 鸡白介素 -10 单克隆抗体的制备及鉴定 0025 1. 实验方法 说 明 书 CN 103571796 A 4 3/6 页 5 0026 1.1 小鼠的免疫 0027 （1）制备含 ChIL-10 重组蛋白的 SDS-PAGE 胶条。具体操作如下 ： 将 ChIL-10 基 因与原核表达载体 pET-30a 进行双酶切， 连接， 转染大肠杆菌 BL21（DE3） ， 收获经终浓度为 0.1mmol/L 的 IPTG 诱导 5h 后的菌体， 经超声处理后， 进行 SDS-PAGE 电泳。准确切取目的条 带所在凝胶， 即为上述的 ChIL-1。
16、0 重组蛋白胶条 0028 （2） 免疫前加入少量 PBS 用研磨棒研磨， 加入适量双抗溶液， 以胶粒能够通过 1mL 注射器针头为宜， 即免疫原 ； 0029 （3） 选取 5 只 6-8 周龄清洁级 BALB/c 小鼠， 用制备的免疫原通过腹腔注射对其免 疫， 每只每次 300L， 每隔 2w 免疫一次 ； 0030 （4） 第三次免疫后 1w 眶下窦采血， 按照常规方法分离血清 ； 0031 （5） 将免疫鼠的抗血清与CHO-ChIL-10F细胞做IFA验证试验， 检测二者能否反应， 并测定血清的效价 ； 0032 （6） 选取血清效价最高的小鼠进行加强免疫， 72h 后融合。 0033。
17、 1.2 细胞融合 0034 1.2.1 饲养层细胞制备 0035 细胞融合前一天， 按照以下方法制备饲养层细胞 ： 0036 (1)取8-10周龄BALB/c雌性小鼠， 摘除眼球取血， 分离血清作为阴性对照， 颈椎脱 臼致死， 用 75% 的酒精浸泡消毒 5min ； 0037 (2) 移入超净台， 四肢用 1mL 注射器针头固定在已灭菌的泡沫固定板上， 腹面向 上， 无菌操作将小鼠腹部皮肤剪开一小口， 钝性分离皮肤与腹膜， 用 5mL 注射器吸取 5mL DMEM 培养基注入腹腔， 用酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部， 再用注射器缓慢吸出腹腔内的液体， 反复操作 2 次 ； 0038 (3)加入约。
18、90mL HAT培养液轻轻悬浮细胞， 按照100L/孔分装到96孔细胞培养 板， 置 5%CO2、 37培养箱中培养。 0039 1.2.2 骨髓瘤细胞 SP2/0 的制备 0040 (1) 于融合前 2w 复苏 SP2/0， 在超净工作台配制含 10%FBS、 1% 谷氨酰胺的 DMEM 培 养液 ； 0041 (2)从液氮中取出含SP2/0细胞冻存管， 迅速放入37水浴中， 在1min内融化 ； 以 75% 酒精消毒管口， 移入超净工作台内， 吸出细胞悬液加入到培养瓶中， 置于 37、 5%CO2培 养箱中培养 ； 0042 (3)12h 后， 更换新鲜 DMEM 完全培养液。 0043 。
19、1.2.3 脾细胞的制备 （研磨法） 0044 (1) 选择血清抗体效价较高的免疫小鼠， 眼球采血， 收集血清供检测时阳性对照 用 ； 颈椎脱臼致死， 放入 75% 酒精浸泡 5min 进行体表消毒 ； 0045 (2) 将小鼠移入超净台， 四肢用 1mL 注射器针头固定在已灭菌的泡沫固定板上， 腹 面向上 ； 0046 (3) 无菌将小鼠腹部皮肤剪开一小口， 钝性分离皮肤与腹膜， 然后剪开 腹膜， 暴露 脾脏， 将脾脏移入一放有10mL DMEM平皿内， 剔除周围的结缔组织， 取出脾脏， 然后将其放入 另一提前倒入 10mL DMEM 的平皿中清洗 ； 说 明 书 CN 103571796 。
20、A 5 4/6 页 6 0047 (4) 然后将其转移至灭菌的铜网上， 铜网放在另外一个盛有 DMEM 的平皿上 ； 用注 射器的活塞部轻轻地在铜网上研磨， 将铜网浸在培养液中使脾细胞被分离 ； 0048 (5) 将脾细胞悬液转移到 15mL 离心管中， 1500rpm 离心 8min。 0049 1.2.4 细胞融合 0050 (1) 将生长状态良好的 SP2/0 及脾细胞， 按照 1:5-1:10 的体积比， 在 50mL 尖底离 心管中混合， 补加 DMEM 于一定的体积， 轻轻混匀 ； 0051 (2) 于水平离心机 1500rpm 离心 8min， 倒干净上清液， 用手指轻弹离心管底。
21、部， 使 两种细胞松散混匀， 放于装有 37水的烧杯中保温 ； 0052 (3) 用移液器沿管内壁在 1min 内逐滴加入 1mL50% 的 PEG3350， 同时匀速转动离心 管 ； 0053 (4) 用 30mL DMEM 培养液终止 PEG3350 的作用， 90s 内加完， 静置 10min ； 0054 (5)1500rpm 离心 8min。吸弃上清， 加入 50mL37保温的含 HAT、 10%FBS 的 DMEM， 混匀 ； 0055 (6) 在长好饲养细胞的细胞板上每孔加入 100L 融合细胞悬液， 置于 37， 5% 的 CO2培养箱中培养 ； 0056 (7) 融合 5 天。
22、后， 更换 HAT 培养液， 采用半换液的方式进行换液 ； 0057 (8) 培养至 9 天左右， 观察培养液颜色， 若培养液变为黄色时可进行检测。 0058 1.3 以 IFA 筛选阳性杂交瘤细胞 0059 (1) 将 CHO-ChIL-10F 和 CHO-ChIL-10M 细胞系按常规方法传代铺于 96 孔细胞培 养板上， 置于 37， 5%CO2培养箱中培养 ； 0060 (2) 当细胞单层长至 80%-90%， 倒掉培养液， 用 PBS 洗涤 3 次， 每次 5min， 用室温的 丙酮 ： 甲醇 （1:1） （v/v） 室温固定 15min， 甩掉固定液， 敞开培养板自然干燥后待用 ；。
23、 0061 (3)当细胞培养液变黄后， 吸取100L上清液加在固定的CHO细胞板上， 以免疫鼠 血清为阳性对照 （1:50 稀释， 稀释液为 PBS） ， 以制备饲养层细胞的小鼠血清为阴性对照， 以 PBS 为空白对照， 37水浴 1h ； PBS 洗涤 3 次， 每次 5min ； 加入 50L DyLight594 标记羊抗 鼠 IgG 为二抗 （l:200 稀释， PBS 稀释） ， 37水浴 40min， PBS 洗涤 3 次， 每次 5min ； 在荧光倒 置显微镜下观察红色荧光 ； 0062 (4) 选择红色荧光最强的孔的细胞进行单克隆。 0063 1.4 阳性杂交瘤细胞的单克隆化。
24、 0064 采用有限稀释法单克隆化。根据实际情况确定克隆的次数。按如下步骤进行 ： 0065 （1） 克隆化的前一天按照上述 2.1 的方式制备饲养层细胞 ； 0066 （2） 用移液器将待克隆的孔内细胞吹打混匀， 用含 20% 血清的 HT 选择培养液稀释 至 1 个细胞 / 孔的密度 ； 0067 （3） 按照 1 个细胞 / 孔加到已有饲养细胞的细胞板， 置 5%CO2、 37的培养箱中进 行培养 ； 0068 （4） 培养至第 4 天时， 在倒置显微镜下观察并记录细胞单克隆生长孔 ； 培养 1w 左 右， 当细胞培养液变黄时， 做好标记， 吸取 100L 上清， 用建立的 IFA 方法。
25、检测细胞孔。 0069 （5） 隔 3 天左右待培养液变黄， 再次对初检阳性孔做 IFA 检测 ； 0070 （6） 将两次检测均为强阳性的孔内细胞进行 2 次亚克隆， 直至每孔都能检测到强 说 明 书 CN 103571796 A 6 5/6 页 7 红色荧光 ； 0071 （7） 扩大培养并冻存强阳性单克隆杂交瘤细胞 ； 0072 以原核表达的重组蛋白ChIL-10为免疫原， 真核细胞系表达的ChIL-10F蛋白为筛 选原， 细胞融合后以 IFA 进行筛选杂交瘤细胞上清， 阳性杂交瘤细胞克隆经 2 次克隆化， 获 得 3 株分泌 ChIL-10 单抗的细胞株 ： 2F6、 3E6 和 3C。
26、12。 0073 1.5 强阳性杂交瘤细胞的稳定性检测 0074 (1) 用弯头吸管将生长状态良好的处于对数生长期的阳性杂交瘤细胞轻轻从瓶壁 上吹下 ； 0075 (2)1000rpm 离心 5min， 弃上清 ； 0076 (3) 将细胞沉淀悬浮用冻存液 （DMEM 培养液 ： FBS ： DMSO=5:4:1） ， 将细胞分装至无 菌冻存管中， 4 30min， -20 1h， -70过夜， 放入液氮罐中长期保存 ； 做好相应记录 ； 0077 (4)按照CHO细胞的复苏方法复苏。 培养后， 用IFA检测细胞培养上清， 测定效价。 0078 1.6 单抗腹水的制备 0079 (1) 选取 。
27、10-13 周龄 BALB/c 小鼠 4 只， 腹腔注射液体石蜡 0.5mL/ 只 ； 0080 (2)7 天后， 腹腔接种经 PBS 稀释的培养至对数期的阳性杂交瘤细胞， 每只小鼠 5105/0.2mL ； 0081 (3)5 天后观察， 当小鼠腹部明显膨胀时， 用 5mL 的注射器抽取腹水， 每隔 3 天收集 一次， 直到小鼠死亡。 0082 (4) 将腹水以 2000rpm， 离心 5min ； 留上清分装后 -70冰箱保存。 0083 1.7 单克隆抗体亚类的鉴定 0084 利用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒 （Southern Biotech 公司） 对 2F6， 3E6 和 3C12。
28、 共 3 株单抗进行亚类鉴定， 具体试验方法如下 ： 0085 （1） 将 ChIL-10 重组蛋白经 SDS-PAGE 电泳， 切下目的胶条， 在 EP 管中尽可能地碾 碎， 加入适量 PBS， 4过夜 ； 0086 （2） 次日， 5000rpm 离心 5min ； 取上清， 测蛋白浓度 ； 0087 （3） 按照 4ug/mL 包被酶标板， 每孔 100L， 37过夜 ； 0088 （4）次日， 甩掉未结合的蛋白， PBST 洗涤 3 次， 每次 5min ； 每孔加入 100L 的 0.5%BSA 封闭， 37放置 1h ； 0089 （5） 在封闭好的酶标板中分别加入 2F6， 3E。
29、6， 3C12 细胞培养液上清， 100L/ 孔， 37孵育 1h ； PBST 洗涤 3 次， 每次 5min ； 0090 （6） 向酶标板中依次加入用 PBS1:250 稀释的 HRP 标记的羊抗鼠二抗 0091 （分别为抗鼠 、 、 IgM、 IgA、 IgG1、 IgG2a、 IgG2b和 IgG3） ， 100L/ 孔， 37放置 1h， PBST 洗涤 3 次， 每次 5min ； 0092 （7） 加入 ABTS 底物， 显色， 100L/ 孔， 孵育 10-15min ； 0093 （8） 用酶标仪在 405nm 波长处读取吸光值 （OD 值） 。 0094 1.8 单抗腹水。
30、 IFA 效价的测定 0095 将3株单抗分泌的腹水分别用PBS按照以下比例稀释， l:50、 l:100、 l:200、 l:400、 l:600、 l:800、 l:1000、 l:1200、 l:1500、 l:2000、 1:3000， 测定 IFA 效价。 0096 1.9 单抗与原核重组蛋白 ChIL-10 的 western blot 的反应性 说 明 书 CN 103571796 A 7 6/6 页 8 0097 分别将原核重组蛋白 ChIL-10 和空载体菌体经 SDS-PAGE 电泳后， 转印至 PVDF 膜， 以 2F6， 3E6， 3C123 株分泌单抗的细胞培养液为一。
31、抗， 以 IRDyeTM700DX 标记山羊抗鼠 IgG （1:5000 稀释） 为二抗进行 western blot 反应。 0098 2. 实验结果 0099 2.1 单克隆抗体亚类的鉴定结果 0100 亚类鉴定结果为 3 株单抗重链均为 IgM， 轻链均为 Kappa 链 （图 1） 。 0101 2.2 强阳性杂交瘤细胞的稳定性检测 0102 稳定性检测结果发现， 强阳性杂交瘤细胞2F6分泌ChIL-10单抗的稳定性最好， 明 显优于 3E6 和 3C12 的稳定性。 0103 2.3 单抗腹水 IFA 效价的测定 0104 单抗腹水 IFA 效价测定结果见图 2。从效价测定结果来看，。
32、 2F6 阳性杂交瘤细胞株 的单抗腹水IFA效价为1 ： 2800， 3E6阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水IFA效价为1 ： 1300， 3C12 阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水 IFA 效价为 1 ： 1200 ； 从效价测定结果来看， 2F6 阳性杂交瘤 细胞株的单抗腹水 IFA 效价要显著高于其它 2 株阳性杂交瘤细胞株的单抗腹水 IFA 效价。 0105 2.4 单抗与原核重组蛋白 ChIL-10 的 western blot 的反应性结果 0106 图3为2F6阳性杂交瘤细胞株的细胞培养上清为一抗的western blot结果 ； 结果 表明2F6阳性杂交瘤细胞株的单抗只与重组蛋白ChIL-。
33、10起反应， 而不与空载体菌体反应， 具有较强的特异性 ； 而3E6以及3C12阳性杂交瘤细胞株的单抗除了与重组蛋白ChIL-10起 反应外， 还与空载体菌体反应， 说明 3E6 以及 3C12 的特异性较差。 0107 实验例 2 利用本发明单克隆抗体 2F6 检测经 LPS 刺激的鸡外周血淋巴细胞中的 IL-10 蛋白 0108 1实验方法 0109 分离 B19 和 B21 单倍型鸡外周血淋巴细胞， 含 10%FBS 的 DMEM 培养液培养 2h 后， 加入浓度为 30g/mL 的 LPS 刺激 36h， 提取蛋白， 利用 2F6 细胞株细胞培养液为一抗， 以 IRDyeTM700DX 标记山羊抗鼠 IgG（1:4000 稀释） 为二抗， 进行 western blot 反应。 0110 2实验结果 0111 实验结果见图 4。经 LPS 刺激 36h 后的 B19 和 B21 单倍型鸡外周血淋巴细胞中均 检测到一条 17kDa 大小的蛋白， 与天然 ChIL-10 蛋白大小相符。 说 明 书 CN 103571796 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103571796 A 9 2/2 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103571796 A 10 。