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1、(10)申请公布号 CN 103756974 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103756974 A (21)申请号 201310453489.3 (22)申请日 2013.09.29 CCTCC NO:V201309 2013.05.15 C12N 7/00(2006.01) G01N 33/569(2006.01) A61K 39/215(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (71)申请人 广东温氏食品集团股份有限公司 地址 527400 广东省云浮市新兴县新城镇东 堤北路 9 号温氏集团总部 (72)发明人 。
2、田小艳 宋延华 周庆丰 潘永飞 (74)专利代理机构 广州市深研专利事务所 44229 代理人 陈雅平 (54) 发明名称 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 (57) 摘要 本发明公开了一株猪流行性腹泻病毒及 其培养方法和应用， 该株猪流行性腹泻病毒， 名称为冠状病毒科冠状病毒属猪流行性腹泻 病毒 GDSJ/2012(Porcine epidemic diarrhea virus)， 于 2013 年 5 月 15 日保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏编号 CCTCCNO:V201309。该毒 株的培养需要使用含有胰蛋白酶和氯化镁的无血 清 DMEM 培养液。其可用于制备 PEDV 。
3、诊断试剂和 PEDV 疫苗， 免疫原性好， 可弥补现有疫苗种类少 的不足。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103756974 A CN 103756974 A 1/1 页 2 1. 一株猪流行性腹泻病毒， 名称为冠状病毒科冠状病毒属猪流行性腹泻病毒 GDSJ/2012 (Porcine epidemic diarrhea virus)， 于 2013 年 5 月 15 日保藏于中。
4、国典型培 养物保藏中心， 保藏编号 CCTCC NO:V201309。 2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒， 其特征在于， 病毒纤突蛋白S基因的核苷 酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。 3.用于培养权利要求1或2所述猪流行性腹泻病毒的培养液， 其特征在于， 为含有浓度 为 38g/mL 胰蛋白酶和浓度为 13g/mL 氯化镁的无血清 DMEM。 4. 权利要求 1 或 2 所述猪流行性腹泻病毒的培养方法， 其特征在于， 步骤为 ： 1） 用细胞培养液培养 Vero 细胞使之形成细胞单层 ； 2） 将猪流行性腹泻病毒接种于 Vero 细胞单层， 并在细胞培养液中添加胰酶至终浓度 38。
5、g/mL 形成吸附液， 于 37和 5% 浓度 CO2的条件下进行吸附， 病毒吸附细胞后弃掉吸 附液， 加入含有浓度为 38g/mL 胰蛋白酶和浓度为 13g/mL 氯化镁的无血清 DMEM 作为 维持液， 37条件下继续培养 ； 3） 连续培养至第 3 天或出现 70% 细胞病变后， 将细胞培养物冻融 3 次， 取细胞培养物做 种毒进行下一轮传代， 重复 1） 、 2） 步骤。 5. 权利要求 1 或 2 所述猪流行性腹泻病毒在制备 PEDV 诊断试剂中的应用。 6. 权利要求 1 或 2 所述猪流行性腹泻病毒在制备 PEDV 疫苗中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103756974 A。
6、 2 1/5 页 3 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物病毒领域， 具体涉及一株新的猪流行性腹泻病毒， 及其培养方 法和应用。 背景技术 0002 猪流行性腹泻病毒 (Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV) 是引起猪呕吐、 腹泻和脱水为主要临床症状特征的猪肠道传染病病原 ( 殷震， 1997; B. E. 斯特劳， 2000)， 不同年龄和不同品种的猪均易感染， 但对哺乳仔猪的危害最为严重， 死亡率最高可达 100%， 给养猪业造成巨大的经济损失， 是我国当前防治猪传染病中的重点疫病之一。 0003 目前尚无治疗猪。
7、流行性腹泻的特效药物， 常规治疗效果不佳， 因此仍以疫苗预防 为主， 而病毒株及其培养的成功与否是疫苗研制的关键因素。 0004 由于 PEDV 适应细胞培养难度高， 自 20 世纪 70 年代初发现以来， 许多学者先后以 猪肾细胞、 BHK 细胞 （仓鼠肾细胞） 、 牛睾丸细胞、 人肺细胞等进行培养实验， 尽管经过多年的 努力， 但是一直没有获得成功， 成为病毒学上的一道难题。直到 1984 年长春兽医大学以猪 体传 24 代吉毒株和 45 代的华毒株在胎猪肠组织原代单层细胞培养获得成功， 这在国内外 尚属首次(宣华， 邢德坤， 王殿派等1984)。 1988年瑞典Hoffman等首次在Ve。
8、ro （非洲绿猴肾 细胞） 传代细胞培养液中加入胰酶使培养获得成功， 连续传 5 代出现细胞病变 (Hofmann, M et al, 1988)， 日本和韩国也相继报道 PEDV 在 Vero 细胞上的培养特性 (DS, Song, 2003 ； W Zhang et al, 1996)， PEDV 在 Vero 细胞上传 90 代以上病变特征仍不明显， 必须借助于 PCR 检测方法才能确定病毒是否生存。2010 年东北农业大学利用从猪流行性腹泻临床疑似 病猪的粪便样品制备的待检含毒材料在 Vero 细胞上连续盲传， 分离到 LJB/03 毒株， 该毒 株盲传 20 代时很难观察到明显的细胞。
9、病变， 随着传代继续进行， 则开始出现细胞的轻微脱 落， 以后细胞的 CPE（细胞病变效应） 变化逐渐明显， 稳定的 CPE 变化在第 30 代之后出现。 主要的 CPE 表现类型是细胞肿胀变圆， 折光性增强， 颗粒物质增多， 培养后期出现拉网状和 细胞的大量脱落。 0005 目前， 由于国内几个厂家生产的疫苗都是较早分离到的 PEDV CV777 毒株 （本发明 中简称 CV777 毒株） ， 缺乏广泛免疫原性， 生产实践中选择范围十分有限。 发明内容 0006 本发明的目的在于针对现有技术中的上述问题， 提供一株猪流行性腹泻病毒。 0007 本发明的另一目的是提供上述猪流行性腹泻病毒株的培。
10、养方法。 0008 本发明的又一目的是提供上述猪流行性腹泻病毒株的应用。 0009 本发明通过以下技术方案实现上述目的 ： 一株猪流行性腹泻病毒， 名称为冠状病毒科冠状病毒属猪流行性腹泻病毒 GDSJ/2012 (Porcine epidemic diarrhea virus)， 于 2013 年 5 月 15 日保藏于中国典型培养物保藏中 心， 保藏编号 CCTCC NO:V201309。保藏地址 ： 中国 . 武汉 . 武汉大学。本发明中该株病毒 说 明 书 CN 103756974 A 3 2/5 页 4 简称为 GDSJ/2012。 0010 优选地， 上述猪流行性腹泻病毒， 其病毒纤。
11、突蛋白 S 基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。 0011 一种用于培养上述猪流行性腹泻病毒的培养液， 为含有浓度为 38g/mL 胰蛋白 酶和浓度为 13g/mL 氯化镁的无血清 DMEM。 0012 上述猪流行性腹泻病毒的培养方法， 步骤为 ： 1） 用细胞培养液培养 Vero 细胞使之形成细胞单层 ； 2） 将猪流行性腹泻病毒接种于 Vero 细胞单层， 并在细胞培养液中添加胰酶至终浓度 38g/mL 形成吸附液， 于 37和 5% 浓度 CO2的条件下进行吸附， 病毒吸附细胞后弃掉吸 附液， 加入含有浓度为 38g/mL 胰蛋白酶和浓度为 13g/mL 氯化镁的无血清 D。
12、MEM 作为 维持液， 37条件下继续培养 ； 3） 连续培养至第 3 天或出现 70% 细胞病变后， 将细胞培养物冻融 3 次， 取细胞培养物做 种毒进行下一轮传代， 重复 1） 、 2） 步骤。 0013 上述培养方法中， 所述细胞培养液为本领域培养 Vero 细胞的常用培养液， 或者为 以下成分 ： 含3.7g/L碳酸氢钠， 0.1mM非必需氨基酸， 1.0mM丙酮酸钠， 2mM L-谷氨酰胺和Earles BSS 的 DMEM， 占培养液体积的 90% ； 胎牛血清或新生牛血清， 占培养液体积的 10%。 0014 上述猪流行性腹泻病毒在制备 PEDV 诊断试剂中的应用。 0015 上。
13、述猪流行性腹泻病毒在制备 PEDV 疫苗中的应用。 0016 与现有技术相比， 本发明具有以下有益效果 ： GDSJ/2012 毒株与 CV777 毒株 S 基因的同源性只有 94.4%， S 基因又含有流行性腹泻病 毒主要的中和介导抗原决定部位， 因此 DSJ/2012 毒株的成功分离及其稳定传代对新疫苗 的开发具有重要作用。本发明不仅对我国流行性腹泻病毒毒种保存是一种补充， 对该病引 起的疾病诊断， 感染监测体系完善和所致疾病流行的控制等都有重要作用。 附图说明 0017 图 1 ： 病料的 RT-PCR 检测结果电泳照片， 其中 M: DL2000Marker; 1 和 2 为阴性粪 样。
14、 , 3-7 为阳性粪样 , 8 为阳性对照 , 9 为阴性对照。 0018 图 2 ： Vero 细胞病变图片 （100） ， 其中 A ： 正常对照细胞， 细胞未出现病变 ； B ： 病 料传第 8 代时， Vero 细胞感染病毒 48 小时后的病变照片， 显示细胞出现大量融合， 病变稳 定。 0019 图 3 ： RT-PCR 检测不同代次的感染 GDSJ/2012 毒株的 Vero 细胞培养物 , 1-5 为 第 3、 5、 8、 15、 20 代细胞培养上清， 6 为阴性对照。 0020 图 4 ： GDSJ/2012 病毒颗粒电镜负染色结果， 箭头指示为病毒。 0021 图 5 ：。
15、 间接免疫荧光染色 （200） 鉴定照片， 其中 A 为未接毒细胞阴性对照 ； B 为 GDSJ/2012 毒株感染的细胞。 具体实施方式 说 明 书 CN 103756974 A 4 3/5 页 5 0022 下面结合具体实施例进一步对本发明进行解释， 以使本领域技术人员能更好地理 解本发明并能予以实施， 但实施例并不作为对本发明的限定。 0023 实施例 1 GDSJ/2012 病毒株获得 1. 病料采集与处理 采集广东省某猪场的疑患病毒性腹泻仔猪的新鲜粪便 7 份， 编号后分别用 PBS （磷酸盐 缓冲液） 以 1 ： 10 的重量体积比进行稀释， 震荡混合均匀， 反复冻融 3 次， 于。
16、 8000r/min （转每 分钟） 离心 10 min（分钟） ， 取上清， 用孔径 0.22m（微米） 的滤器除菌， 所得处理液 -70 冰箱储存备用。 0024 2. 病料的 RT-PCR（反转录聚合酶链式扩增反应） 检测 编号 17 的上述处理液各取 200L（微升） ， 用上海百赛生物技术有限公司生产的 AxyPrep 体液病毒 DNA/RNA 小量试剂盒进行 RNA 提取。提取后的 RNA 用下面的反应体系 和条件进行反转录 ： 8L 的 RNA 与 1L 10mM dNTP mix 和 1L Radom 9mer 混匀， 65 5min， 然后迅速置于冰上 2min。此混合溶液再。
17、加入 4.5L 的 RNase-Free H2O， 4L RNase H- Buffer， 1L 的 RNase H-， 0.5L 的 RNase Inhibitor， 混匀后置于 PCR 仪上， 按如下条 件反应 ： 30 10min ； 42 60min ； 70 15min。 0025 反 转 录 后 获 得 的 cDNA 用 下 述 引 物 进 行 PCR，扩 增 N 基 因 （上 游 引 物 P1 ： 5-GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3，SEQ ID NO:2 ； 下游引物 P2 ： 5- GCTCACGAACAGCCACATTA-3 ， SEQ ID NO:3)。反应。
18、体系为 25L ： Premix Taq(DNA 聚合酶， MgCl2， PCR 缓冲液， dNTP 混合物 )12.5L， 10 pmol/L 上、 下游引物各 0.5L， 模板 cDNA 2L， 加去离子水至 25L， 混合均匀， 同时设立水阴性对照和 CV777 毒株阳性对照。PCR 反 应条件为 ： 95预变性5min ； 94变性40s， 51退火40s， 72延伸50s的程序， 30个循环 ； 最后 72延伸 10min。 0026 反应结束后取 5L PCR 产物进行 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测， 检测结果见图 1， 可 见编号 12 的病料未出现扩增产物， 而编号 37 的病。
19、料均有扩增产物。选取能扩增出与阳 性对照条带一致的约 492 bp 片段病料上清液作为待分离样品备用。 0027 3. 猪流行性腹泻病毒的传代分离 选取 RT-PCR 检测阳性的病料上清液 （编号 37） 分别进行传代分离。 0028 分别取 6 孔板上 48h 生长良好的本实验室保存、 广东省农业科学院兽医研究所和 东北农业大学赠送的 Vero 细胞， 弃去培养液， 用 PBS 液清洗细胞单层 2 次， 再用含 38g/ mL胰酶的DMEM洗一遍， 每孔加入200L病料上清液， 并添加胰酶至终浓度38g/mL形成 吸附液， 放置于 37的 5% CO2条件下吸附 1h， 其间轻摇 2 次， 。
20、待吸附结束后， 弃掉吸附液， 加入 pH 值为 7.2， 分别含有终浓度 38g/mL 胰蛋白酶和 13g/mL 氯化镁的无血清 DMEM 作为维持液， 37条件下继续培养， 逐日观察， 以 72h 为一个传代周期。传代前将上一代的 细胞培养物反复冻融 3 次， 重复以上操作进行传代。整个传代过程期间， 设置不接种病毒的 含有相同浓度胰酶的细胞培养物作阴性对照。若无细胞病变， 可继续传 6 代， 每代在收毒时 取上清用上述步骤 2 的 RT-PCR 方法进行检测， 若为阳性继续传代， 若为阴性则弃去。 0029 经过反复传代筛选， 最终在接种本实验室保存的 Vero 细胞、 编号 4 的病料上。
21、清中 分离到一株可稳定传代的病毒株， 命名为 GDSJ/2012， 该毒株在第 3 代即可看见明显细胞病 变， 在第 8 代就可使病变稳定存在， 主要表现为细胞出现大量融合， 具体病变见图 2B。将出 说 明 书 CN 103756974 A 5 4/5 页 6 现 70% 以上病变的细胞冻融一次， 于 8000r/min 离心 10min， 取上清放入 -70冰箱进行保 存， 上清中即含有 GDSJ/2012 毒株。 0030 将 GDSJ/2012 第 8 代、 第 15 代、 第 20 代和第 25 代分别接种广东省农业科学院兽 医研究所和东北农业大学赠送的 Vero 细胞， 第 20 。
22、代能出现轻微的病变， 第 25 代能出现明 显的细胞病变， 说明从第 20 代开始， GDSJ/2012 已能广泛适应其他 Vero 细胞。以下的检测 均使用含有 GDSJ/2012 毒株的病料作为研究对象进行。 0031 4. 细胞培养物的 RT-PCR 检测 操作方法同步骤 2 中各病料的 RT-PCR 检测， 检测样品采用第 3、 5、 8、 15、 20 代接种含 GDSJ/2012 毒株的病料后的细胞上清， 检测结果见图 3， 显示不同代接种的病料都能检测到 较亮的目的条带。 0032 5. 电镜鉴定 将接种第 5 代 GDSJ/2012 毒株培养 48h 的 Vero 细胞培养物收。
23、获后， 反复冻融 3 次， 12000r/min 4离心 30min， 去除细胞碎片， 吸取少量滴加到用碳膜覆盖的铜网上， 待网上 液滴将干时， 再滴上pH值6.1的磷钨酸溶液进行染色， 一定时间后用滤纸吸去多余染液， 在 透射电镜下观察， 结果见图 4， 显示病毒直径在 80120nm， 呈球形或椭圆形， 有的病毒粒子 包膜上有棘突， 符合 PEDV 的已知形态。 0033 6. 间接免疫荧光检测 取 Vero 细胞长成单层的 96 孔细胞板， 接种第 5 代病毒， 同时设立不接毒的 Vero 细胞 为阴性对照， 24h 后在显微镜下观察， 接毒细胞发生病变， 轻轻吸弃上清， 用 PBS 轻。
24、轻洗涤 3 次。再用 -20冷丙酮 ( 丙酮 ： 超纯水体积比为 4 ： 1) 每孔加 200L 置于 4固定 15min。 PBS 洗涤 3 次， 每次 3min， 然后将细胞单层用 200L 5% 脱脂乳封闭 30min， 之后倒去脱脂 乳， 加入稀释的韩国JBT公司生产的兔抗PEDV二抗 （1:10000)200L， 于37温箱内作用1 小时， PBS 洗涤 3 次， 每次 3min ； 滴加 200L FITC( 异硫氰酸荧光素 ) 标记的上海生工生产 的兔抗猪 IgG 二抗 （1 ： 10000 稀释 )， 37作用 30min， PBS 洗涤 3 次， 每次 3min ； 最后用 。
25、1 ： 9 的磷酸甘油封底， 用倒置荧光显微镜观察结果。需设置只加一抗不加二抗、 只加二抗不加 一抗的阴性对照孔各两个以及接有鉴定好的病毒 （CV777 毒株） 阳性对照孔。结果显示， 阴 性对照均为阴性， CV777 毒株和本发明分离到的 GDSJ/2012 毒株均在细胞浆中被染色， 证实 分离到的是猪流行性腹泻病毒， 染色结果见图 5， 表明 GDSJ/2012 毒株具备非常好的免疫原 性。另外， 只加一抗不加二抗、 只加二抗不加一抗的阴性对照均未显示有荧光染色。 0034 7. S 基因序列测定 取 200L GDSJ/2012 的第 5 代 Vero 细胞培养物， RNA 提取和反转录。
26、体系及条件 同上述步骤 2。反转录后的 cDNA 用下述引物进行 PCR， 扩增 S 基因 （上游引物 P1 ： 5- ATGAGGTCTTTAATTTACTTC -3， SEQ ID NO:4 ； 下游引物 P2 ： 5 - TCAATCGTGTATTGAAAAAG -3 ， SEQ ID NO:5)。PCR 反应条件为 ： 95预变性 5min ； 94变性 40s， 50退火 40s， 72 延伸 4.5min 的程序， 28 个循环 ； 最后 72延伸 10 min。将 S 基因的 PCR 产物用 0.8% 琼脂 糖凝胶电泳回收， 切下约 43000bp 的目的条带， 用凝胶回收纯化试。
27、剂盒回收目的片断， 克隆 到 TaKaRa 公司生产的 pMD18-T 载体， 构建 pMD-S 重组质粒， 连接产物转化 TaKaRa 公司生产 的 JM109 感受态细胞， 菌液涂布在含 100g/L Amp 的 LB 平板上， 37培养 1618h， 挑取白 色菌落培养后抽提质粒， 进行 PCR、 酶切鉴定后送上海博亚公司进行测序。测序结果为 SEQ 说 明 书 CN 103756974 A 6 5/5 页 7 ID NO:1 所示的序列。 0035 利用 DNAStar 软件对测序结果进行分析， 结果显示 ： GDSJ/2012 毒株同 GD-A 毒株 的同源性最高， 为 98.7% 。
28、； 同 CV777 毒株只有 94.4% 的同源性， 证明分离到的毒株为新毒株。 说 明 书 CN 103756974 A 7 1/5 页 8 SEQUENCE LISTING 广东温氏食品集团股份有限公司 一株猪流行性腹泻病毒及其培养方法和应用 5 PatentIn version 3.3 1 4158 DNA GDSJ/2012 1 atgaggtctt taatttactt ctggttgttc ttaccagtac ttttaacact tagcctacca 60 caagatgtca ctaggtgctc ggctactact aattttaggc ggttcttttc aaaatt。
29、taat 120 gttcaggcac ctgccgtcgt cgtcctgtgc ggttatctac ctattggtat gaaccagggt 180 gtcaattcta cttggtactg tggcagccaa catccaactg ctagtggcgt tcatggtatc 240 tttcttagcc atatcgattg tggtcatggc tttgagattg gcatttcgca agagcctttt 300 gaccctagtg gttaccagct ttatttacat aaggctacta acggtaacac taatgctact 360 gcgcgactgc 。
30、gcatttgcca gtttcccgat aataaaccat tgggccccac tgctaataat 420 gatgttacaa caggtcgtaa ctgcctattt aacaaagcca tcccagctca tatgagtgaa 480 catagtgttg tcggcataac atgggataat gaccgtgtca ctgtcttttc tgacaagatc 540 tattattttt attttaaaaa tgattggtcc cgtgttgcga caaagtgtta caacagtgga 600 序 列 表 CN 103756974 A 8 2/5 页 9 。
31、ggttgtgcta tgcaatatgt ttatacaccc acttactaca ttcttaatgt tactagtgct 660 ggtgaggatg gtatttctta tcaaccctgt acagctaatt gcattggtta tgctgccaat 720 gtatttgcta ctgagcccaa tggccacata ccagaaggtt ttagttttaa taattggttt 780 cttttgtcca atgattccac tttggtgcat ggtaaggtgg tttccaacca accattgttg 840 gtcaattgtc ttttggcca。
32、t tcctaagatt tatggactag gccaattttt ctcctttaat 900 caaacgatcg atggtgtttg taatggagct gctgtgcagc gtgcaccaga ggctctgagg 960 tttaatatta atgacacctc tgtcattctt gctgaaggct caattgtact tcatactgct 1020 ttaggaacaa atttttcttt tgtttgcagt aattcctcag aacctcactt agccaccttt 1080 gccatacctc cgggtgctat ccaagtaccc tatta。
33、ttgtt ttcttaaagt ggatacttac 1140 aactccactg tttataaatt cttggctgtt ttacctccta ccgtcaggga aattgtcatc 1200 accaagtatg gtgatgttta tgtcaatggg tttggctact tgcatctcgg tttgttggat 1260 gctgtcacaa ttaatttcac tggtcatggc actgacgatg acgtttctgg tttttggacc 1320 atagcatcga ctaattttgt tgatgcactt aacgaagttc aaggaactgc。
34、 cattcagcgt 1380 attctttatt gtgatgatcc tgttagccaa ctcaagtgtt ctcaggttgc ttttgacctt 1440 gacgatggtt tttaccgtat ttcctctaca aaccttctga gtcatgaaca gccaacttct 1500 tttgttactt tgccatcatt taatgatcat tcttttgtta atattactgt ctctgctgct 1560 tttggtggtc atagtggtgc caaccttatt gcatctgaca ctactatcaa tgggtttagt 1620。
35、 tctttctgtg ttgacactag acaatttacc atttcactgt tttataacgt tacaaacagt 1680 tatggttacg tgtctaaatc acaggacagt aattgccctt ttaccttgca atctgctaat 1740 gattacctgt cttttagcaa attttgtgtt tctaccagcc ttttggctag tgcctgtacc 1800 序 列 表 CN 103756974 A 9 3/5 页 10 atagatcttt ttggttaccc tgagtttggt agtggtgtta agttcacgtc。
36、 cctttacttt 1860 caattcacaa agggtgagtt gattactggc acgcctaaac cacttgaagg tgttacggac 1920 gtttctttta tgactctgga tgtgtgtacc aagtatacta tctatggctt taaaggtgag 1980 ggtatcatta cccttacaaa ttctagcttt ttggcaggtg tttattatac atctgattct 2040 ggacagttgt tagcttttaa gaatgtcact agtggtgctg tttattctgt tacgccatgt 2100。
37、 tctttttcag agcaggctgc atatgttaat gatgatatag tgggtgttat ttctagtttg 2160 tctagctcca cttttaacag tactagggag ttgcctggtt tcttctacca ttctaatgat 2220 ggctctaatt gtacagagcc tgtgttggtg tatagtaaca taggtgtttg taaatctggc 2280 agtattggct atgtccgatc tcagtctggc caagtcaaga ttgcacccac ggttactggg 2340 aatattagta ttcc。
38、caccaa ctttagtatg agtattagga cagaatattt acagctttac 2400 aacacgcctg ttagtgttga ttgtgctaca tatgtttgta atggtaactc tcgttgtaaa 2460 caattactca cccattacac tgcagcatgt aagaccatag agtcagcatt acaactcagc 2520 gctaggcttg agtctgctga agtcaactct atgcttacta tttctgaaga ggctctacag 2580 ttagccacca tcagttcgtt taatggtga。
39、t ggatataatt ttactaatgt gctgggtgtt 2640 tccgtgtatg accctgcaag tggcagggtg gtacacaaaa ggtctttcat tgaagacctg 2700 ctttttaata aagtggttac taatggcctt ggtactgttg atgaagacta taagcgctgt 2760 tctaatggcc gctctgtggc agatttagtc tgtgcgcagt attactctgg tgtcatggta 2820 ctacctggtg ttgttgacgc tgagaagctt catatgtata gtg。
40、cgtctct catcggtggt 2880 atggtgctag gaggttttac tgcagcagcg gcattgcctt ttagctatgc tgttcaagcg 2940 序 列 表 CN 103756974 A 10 4/5 页 11 agactgaatt atcttgctct acagacggat gttctacagc ggaaccagca attgcttgct 3000 gagtctttta attctgctat tggtaatata actccagcct ttgagagtgt taaagaggct 3060 attagtcaaa cttctaaggg tttgaaca。
41、ct gtggctcatg cgcttaccaa ggtccaagag 3120 gttgttaatt cgcagggtgc agctttgacc caacttaccg tacagctgca acacaacttc 3180 caagccattt ctagttctat tgatgacatt tactcccgac ttgacattct ttcagccgat 3240 gttcaggtag accgtctcat caccggcaga ttatcagcac ttaatgcttt tgttgctcaa 3300 acccttacta agtatactga ggttcaggct agcaggaaac ta。
42、gcacagca aaaggttaat 3360 gagtgcgtta aatcgcaatc tcagcgttat ggtttttgtg gtggtgatgg cgagcacatt 3420 ttctctctgg tacaggccgc acctctaggc ctgctgtttt tacacacagt acttgtaccg 3480 ggtgactttg taaatgttat tgccatcgct ggcttatgtg ttaacgatga aattgccttg 3540 actctacgtg agcctggttt agtcttgttt acgcatggac tccaagatac tgcgacg。
43、gaa 3600 tattttgttt catcgcgacg tatgtatgaa cctagaaaac ctaccgttgg tgattttgtt 3660 caaattgaga gttgtgtggt cacctatgtc aatttgacta gagaccaact accagaagta 3720 atcccagatt acatcgatgt taacaaaaca cttgatgaga ttttagcctc tctgcccaat 3780 agaactggtc caagtctttc tctagatgtt tttaatgcca cttatcttaa tcttactggt 3840 gaaattg。
44、cag atttagagca gcgttcagag tctctccgta atactacaga agagcctcga 3900 agtctcatat taaatatcaa caacacacta gttgaccttg agtggctcaa ccgagttgag 3960 acatatatca agtggccgtg gtgggtttgg ttgattattt ttattgttct catctttgtt 4020 gtgtcattac tagtgttctg ctgcatttcc acgggttgtt gtggatgctg cggttgctgc 4080 ggtgcttgtt tttcaggttg t。
45、tgtaggggt cctagacttc aaccttccga agcttttgaa 4140 序 列 表 CN 103756974 A 11 5/5 页 12 aaggtccacg tgcagtga 4158 2 20 DNA 人工序列 2 gaaataacca gggtcgtgga 20 3 20 DNA 人工序列 3 gctcacgaac agccacatta 20 4 21 DNA 人工序列 4 atgaggtctt taatttactt c 21 5 20 DNA 人工序列 5 tcaatcgtgt attgaaaaag 20 序 列 表 CN 103756974 A 12 1/2 页 13 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103756974 A 13 2/2 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 103756974 A 14 。