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1、(10)申请公布号 CN 103760246 A (43)申请公布日 2014.04.30 CN 103760246 A (21)申请号 201310712472.5 (22)申请日 2013.12.23 G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 广州绿萃生物科技有限公司 地址 510663 广东省广州市广州科学城掬泉 路3号广州国际企业孵化器A区904房 (72)发明人 曹庸 李双祁 刘飞 彭维 郭斌 吴成顺 (54) 发明名称 一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法 (57) 摘要 一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法， 步 骤包括 ： 将待。
2、检牛奶加入酪蛋白磷酸肽制成成 10100ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液， 脱蛋白后 过阳离子交换树脂柱脱钙， 将脱钙后所得洗脱液 过阳离子交换树脂柱， 除杂和富集， 将收集液在温 度 60 70， 转速为 50 60rpm 下真空旋转蒸 发， 过膜后作为液相检测样品 ； 然后进行液相检 测， 按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白 磷酸肽的浓度。 本发明在减少了实验初期试剂、 仪 器等资金投入的同时， 运用相对简单高效的纯化 步骤进行操作， 实现酪蛋白磷酸肽的分离， 保证了 定量精度， 并有效去除其他蛋白质和脂类等杂志 干扰， 提高了最终检测的灵敏度， 有利于酪蛋白磷 酸肽含量相对较低的样品检测。
3、。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103760246 A CN 103760246 A 1/2 页 2 1. 一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法， 其特征在于， 步骤包括 ： （1） 将待检牛奶置于烧杯中， 加入浓度为 5 mg/mL 的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准溶液， 混 匀， 加标成 10100ppm 的酪蛋白磷酸肽分散溶液 ； （2）脱蛋白， 方法是取 510g 酪蛋白磷酸肽分散溶液于 50mL 塑料离心管中， 加入 。
4、510g 水， 混匀后再加入 5 1.5% 三氯乙酸 510g， 漩涡混匀并超声 515min， 然后以 40004800rpm 离心 515min， 离心后将离心管放入 6575的水浴锅中水浴 515min， 再以 40004800rpm 离心 515min， 取上清液滤纸过滤后备用 ； （3） 将预先处理好的阳离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 35mL， 用 23 倍 柱体积的水洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 关闭活塞 ； 将步骤 （2） 处理好的样品缓慢地加入 层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 12 滴每秒 ； 用水做洗脱剂， 洗脱体积为 12 倍柱体积， 收集。
5、洗脱液 ； （4） 将预先处理好的阴离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 35mL， 用 23 倍 柱体积的水洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 洗涤完成后、 关闭活塞 ； 将步骤 （3） 收集的洗脱 液处理好的样品缓慢地加入层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 12 滴每秒 ； 首 先用23倍柱体积的水洗脱， 除去杂质， 然后用浓度为0.10.4mol/L HCl做洗脱剂， 洗脱体 积为 23 倍柱体积， 收集洗脱液 ； （5） 将收集液转到浓缩瓶中， 以浓缩温度为 6070， 转速为 5060rpm， 进行真空旋转 蒸发至 12mL， 准确记录浓缩后的体积， 过膜后作为液相检。
6、测样品 ； （6） 液相检测 ： 色谱柱Diamosil C18(2) 5u， 2504.6mm， 流动相A ： 0.1%三氟乙酸水溶 液， 流动相 B ： 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液， 流速 1mL/min ； 梯度洗脱程序 ： 从 0 到 45min， 流动相 B浓度由5%梯度洗脱到35%， 洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数， 进样量20L， 柱 温常温， 波长， 215nm ； （7） 按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。 2. 根据权利要求 1 所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法， 其特征在于， 步骤 （2）中， 所述脱蛋白的方法是 ： 取 510g 事先配置好。
7、的样品于 50mL 塑料离心管中， 加入 510g 水， 混匀后再加入 5 1.5% 三氯乙酸 510g 漩涡混匀并超声 515min， 然后以 40004800rpm 离心 515min, 取上清液滤纸过滤后备用。 3. 根据权利要求 1 所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 所述脱蛋白的方法是取 510g 事先配置好的样品于 50mL 塑料离心管中， 加入 510g 的水， 混匀后再加入氯仿和正丁醇混合溶液 2.55mL， 漩涡混匀并超声 515min， 然后以 40004800rpm 离心 515min， 取出上层重复上述操作处理 3 次， 取上清液滤。
8、纸过滤后备用， 所述氯仿和正丁醇混合溶液的体积配比为 4:1。 4. 根据权利要求 1 所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 所述脱蛋白的方法是 ： 取 510g 事先配置好的样品于 50mL 塑料离心管中， 加入 510g 的水， 漩涡混匀并超声 515min， 将离心管放入 6575的水浴锅中水浴 515min， 然后以 40004800rpm 离心 515min， 取上清液滤纸过滤后备用。 5. 根据权利要求 1 所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法， 其特征在于， 步骤 （3） 中， 所述阳离子交换树脂为 0017(732) 强酸性苯乙烯系阳离子交换。
9、树脂、 罗门哈斯 AMBERJET UP6040 阳离子交换树脂、 三菱 WK60L 阳离子交换树脂中的一种。 权 利 要 求 书 CN 103760246 A 2 2/2 页 3 6. 根据权利要求 1 所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法， 其特征在于， 步骤 （4） 中， 所述阴离子交换树脂为 FPA98Cl 罗门哈斯离子交换树脂、 德国 Lewatit M500 阴离子交 换树脂， 美国 Amberlite IRA-400 阴离子交换树脂、 阿拉丁阴离子交换树脂中的一种。 权 利 要 求 书 CN 103760246 A 3 1/7 页 4 一种牛奶中酪蛋白磷酸肽液相检测方法 技术领域。
10、 0001 本发明属于食品检测技术领域， 尤其涉及一种酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的液相检测方 法。 背景技术 0002 酪蛋白磷酸肽 (CPP) 是以牛乳酪蛋白为原料， 通过生物技术制得， 再经分离纯化 而得到的含有磷酸丝氨酸族的天然生物活性的多肽， 可用于各种营养、 保健食品中， 能有 效促进人体对钙、 铁、 锌等二价矿物营养素的吸收和利用。德国和日本已把酪蛋白磷酸肽 （CPP） 定性为功能性食品。我国目前已广泛的把酪蛋白磷酸肽 （CPP） 作为食品添加剂应用 于婴幼儿奶粉和保健食品中。 0003 虽然人们对酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的功能组分、 化学特点、 生理功效等方面进行了广 泛深入的。
11、研究， 但其在添加酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的食品及保健品中的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 检测方面报道较少。 据文献报道， 目前普遍采用乙醇沉淀法测定酪蛋白磷酸肽的含量， 但该 种方法只能检测原料中酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量大于 10% 的样品， 不能检测牛奶中微量酪 蛋白磷酸肽 （CPP） 的含量。在牛奶中酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量检测方面， 存在一些难点问 题， 如牛奶中的蛋白质及一些盐类成分会严重干扰测定结果。目前国内已有大公司将酪蛋 白磷酸肽 （CPP） 添加在乳制品中， 如内蒙古伊利实业集团股份有限公司等， 但都没有建立有 效的评价酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的检测方法， 因此急。
12、需找到一种能检测牛奶中微量酪蛋白磷 酸肽 （CPP） 含量的方法。基于目前的方法不能检测牛奶中微量酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的含量， 已经不能满足方便、 快捷、 灵敏度高的检测方法的需求， 建立一种高效液相色谱法测定牛奶 中酪蛋白磷酸肽 (CPP) 含量的方法迫在眉睫， 这也显示出了高效液相色谱一定的优势。 0004 发明内容 0005 本发明的目的 ： 针对现有检测酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的技术中不适用于测定牛奶中 添加的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量的不足， 提供一种可有效地检测出牛奶中添加的酪蛋白磷 酸肽 （CPP） 含量的高效液相色谱方法， 该方法旨在将基本包括现有牛奶所可能涉及的各。
13、种 主要酪蛋白磷酸肽 （CPP） ， 使其能更加快速、 灵敏、 简便地检测酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的含量， 以满足实际工作的需要。 0006 本发明的目的是实现所述的利用高效液相色谱， 测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量的方法， 具体步骤为 ： （1） 将待检牛奶置于烧杯中， 加入浓度为 5 mg/mL 的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准溶液， 混 匀， 加标成 10100ppm 的酪蛋白磷酸肽分散溶液 ； （2）脱蛋白， 方法是取 510g 酪蛋白磷酸肽分散溶液于 50mL 塑料离心管中， 加入 510g 水， 混匀后再加入 5 1.5% 三氯乙酸 510g， 漩涡混匀并超声 5。
14、15min， 然后以 40004800rpm 离心 515min， 离心后将离心管放入 6575的水浴锅中水浴 515min， 再以 说 明 书 CN 103760246 A 4 2/7 页 5 40004800rpm 离心 515min， 取上清液滤纸过滤后备用 ； （3） 将预先处理好的阳离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 35mL， 用 23 倍 柱体积的水洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 关闭活塞 ； 将步骤 （2） 处理好的样品缓慢地加入 层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 12 滴每秒 ； 用水做洗脱剂， 洗脱体积为 12 倍柱体积， 收集洗脱液 ； （4） 将。
15、预先处理好的阴离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 35mL， 用 23 倍 柱体积的水洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 洗涤完成后、 关闭活塞 ； 将步骤 （3） 收集的洗脱 液处理好的样品缓慢地加入层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 12 滴每秒 ； 首 先用23倍柱体积的水洗脱， 除去杂质， 然后用浓度为0.10.4mol/L HCl做洗脱剂， 洗脱体 积为 23 倍柱体积， 收集洗脱液 ； （5） 将收集液转到浓缩瓶中， 以浓缩温度为 6070， 转速为 5060rpm， 进行真空旋转 蒸发至 12mL， 准确记录浓缩后的体积， 过膜后作为液相检测样品 ； （6） 液。
16、相检测 ： 色谱柱Diamosil C18(2) 5u， 2504.6mm， 流动相A ： 0.1%三氟乙酸水溶 液， 流动相 B ： 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液， 流速 1mL/min ； 梯度洗脱程序 ： 从 0 到 45min， 流动相 B浓度由5%梯度洗脱到35%， 洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数， 进样量20L， 柱 温常温， 波长， 215nm ； （7） 按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。 0007 步骤 （2）中， 所述脱蛋白的方法也可以是 ： 取 510g 事先配置好的样品于 50mL 塑料离心管中， 加入 510g 水， 混匀后再加入 5 1.5%。
17、 三氯乙酸 510g 漩涡混匀并超声 515min， 然后以 40004800rpm 离心 515min。取上清液滤纸过滤后备用。 0008 或取 510g 事先配置好的样品于 50mL 塑料离心管中， 加入 510g 的水， 混匀后再 加入氯仿 ： 正丁醇溶液 （预先配成体积比 4:1 混合液） 2.55mL， 漩涡混匀并超声 515min， 然 后以 40004800rpm 离心 515min， 取出上层重复上述操作处理 3 次。取上清液滤纸过滤后 备用。 0009 或取 510g 事先配置好的样品于 50mL 塑料离心管中， 加入 510g 的水， 漩涡混匀 并超声 515min， 将离。
18、心管放入 6575的水浴锅中水浴 515min， 然后以 40004800rpm 离 心 515min。取上清液滤纸过滤后备用。 0010 步骤 （3） 中， 所述阳离子交换树脂为 0017(732) 强酸性苯乙烯系阳离子交换树 脂、 罗门哈斯 AMBERJET UP6040 阳离子交换树脂、 三菱 WK60L 阳离子交换树脂中的一种。 0011 步骤 （4）中， 所述阴离子交换树脂为 FPA98Cl 罗门哈斯离子交换树脂、 德国 Lewatit M500阴离子交换树脂， 美国Amberlite IRA-400阴离子交换树脂、 阿拉丁阴离子交 换树脂中的一种。 0012 本发明方法的检测限为大。
19、约 10g/mL（信噪比 3） ， 回收率在 85%105% 之间。 0013 本发明的检测方法的主要特点 ： 本发明方法灵敏度高、 准确度和精密度好， 专属性及确证性可靠， 而且非常简便并可易 于实际检测应用， 且可非常好地满足实际检测中的需要。采用高效液相色谱对牛奶中酪蛋 白磷酸肽 （CPP） 检测的方法， 目前尚未见有相应的报道。 0014 本发明优点为 ： 本发明建立了用高效液相色谱检测牛奶实际样品中酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的定量分析方法， 减少了实验初期在实验试剂、 仪器设备等方面的资金投入的同时， 说 明 书 CN 103760246 A 5 3/7 页 6 运用相对简单高效的纯。
20、化步骤进行操作， 实现酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的分离， 保证了定量精 度， 并有效去除其他蛋白质和脂类等杂志干扰， 提高了最终检测的灵敏度。 方法的检出限为 15g/mL， 有效地确保实验数据的准确度， 有利于酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量相对较低的样品 检测。 附图说明 0015 图 1 为酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准品色谱图。 0016 图 2 为牛奶中添加酪蛋白磷酸肽 （CPP） 色谱图。 0017 图 3 为牛奶中添加酪蛋白磷酸肽 （CPP） 后再加入酪蛋白磷酸肽 （CPP） 定性色谱图。 0018 图 4 为空白液态牛奶样品色谱图。 0019 图 5 为酪蛋白磷酸肽 （CPP） 。
21、标准品、 实际样品和空白液态牛奶样品重叠色谱图。 0020 图 6 为 10g/mL 的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准品色谱图。 具体实施方式 0021 下面结合实施实例对本发明进行详细说明。 0022 实验方法 1 材料、 试剂和仪器 乙腈 （色谱纯） ， 三氯乙酸 （分析纯） ， 酪蛋白磷酸肽 （CPP）标准品， 实验用水为超纯水 (18Mcm， TOC 3 ppb)， FPA98Cl 罗门哈斯离子交换树脂 （北京慧德易科技有限责任公 司） ， 0017(732) 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂 （杭州争光树脂有限公司） ， 德国 Lewatit M500 阴离子交换树脂， 罗门哈斯 AMB。
22、ERJET UP6040 阳离子交换树脂， 美国 Amberlite IRA-400 阴离子交换树脂， 阿拉丁阴离子交换树脂， 三菱 WK60L 阳离子交换树脂， 岛津 LC-15C 高效液相色谱仪配 SPD-15C 紫外检测器， XW-80A 型旋涡混合器， L530 台式低速离心 机， 电子天平， JP-040 型洁盟牌超声清洗机， R201 型旋转蒸发器， 恒温水浴锅。 0023 2 实验用试剂 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液 ： 吸取 1mL 三氟乙酸用乙腈稀释至 1000mL ； 0.1% 三氟乙酸水溶液 ： 吸取 1mL 三氟乙酸用水稀释至 1000mL ； 0.5% 三氯乙酸溶液 ：。
23、 称取 0.5g 三氯乙酸加水至 100g ； 酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准品用超纯水稀释， 配制成不同浓度的标样进行检测， 可得到较 好的色谱峰形， 并且配制简单。 0024 标准物质 ： 酪蛋白磷酸肽 （CPP） ， 纯度不低于 90%。 0025 按外标法以峰面积计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的浓度。 0026 实施例 1 ： 本发明所提供的测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量的方法， 包 括以下步骤 ： （1） 将待检牛奶置于烧杯中， 加入浓度为 5 mg/mL 的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准溶液， 混 匀， 加标成 100ppm 的酪蛋白磷酸肽分散溶液 ； （。
24、2） 脱蛋白。方法是取 5g 事先配置好的酪蛋白磷酸肽分散溶液于 50mL 塑料离心管 中， 加入 5g 水， 混匀后再加入 5三氯乙酸 5g 漩涡混匀并超声 5min， 然后以 4800rpm 离心 10min， 离心后将离心管放入70的水浴锅中水浴10min， 再以4800rpm离心10min。 取上清 说 明 书 CN 103760246 A 6 4/7 页 7 液滤纸过滤后备用 ； （3）过 0017(732) 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱脱钙。将预先处理好的 0017(732) 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 5mL， 用 2 倍 柱体积的水洗涤填料， 。
25、除去树脂中的杂质， 关闭活塞。将步骤 （2） 处理好的样品缓慢地加入 层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 2 滴每秒。用水做洗脱剂， 洗脱体积为 1 倍柱 体积， 收集洗脱液 ； （4）将洗脱液过 FPA98Cl 罗门哈斯离子交换树脂柱， 除杂和富集。将预先处理好的 FPA98Cl 罗门哈斯离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 5mL。用 2 倍柱体积的水洗 涤填料， 除去树脂中的杂质， 洗涤完成后、 关闭活塞 ； 将步骤 （3） 收集的洗脱液处理好的样 品缓慢地加入层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为2滴每秒 ； 首先用2倍柱体积的 水洗脱， 除去杂质， 然后。
26、用浓度为 0.2mol/L HCl 做洗脱剂， 洗脱体积为 2 倍柱体积， 收集洗 脱液 ； （5） 将收集液转到浓缩瓶中， 以浓缩温度为 60， 转速为 50rpm， 进行真空旋转蒸发至 1mL， 准确记录浓缩后的体积， 过膜后作为液相检测样品 ； （6） 液相检测。色谱柱 Diamosil C18(2) 5u， 2504.6mm， 流动相 A ： 0.1% 三氟乙酸水 溶液， 流动相 B ： 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液， 流速 1mL/min ； 梯度洗脱程序 ： 从 0 到 45min， 流动 相B浓度由5%梯度洗脱到35%， 洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数， 进样量20L， 柱。
27、温常温， 波长， 215nm ； （7） 按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。 0027 实施例 2 ： 本发明所提供的测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量的方法， 包 括以下步骤 ： （1） 将待检牛奶置于烧杯中， 加入浓度为 5 mg/mL 的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准溶液， 混 匀， 加标成 10ppm 的酪蛋白磷酸肽分散溶液 ； （2） 脱蛋白。方法是取 10g 事先配置好的酪蛋白磷酸肽分散溶液样品于 50mL 塑料离心 管中， 加入 10g 水， 混匀后再加入 1三氯乙酸 10g 漩涡混匀并超声 10min， 然后以 4000rpm 离心15min， 离。
28、心后将离心管放入75的水浴锅中水浴15min， 再以4000rpm离心15min。 取 上清液滤纸过滤后备用 ； （3） 过三菱 WK60L 阳离子交换树脂柱脱钙。将预先处理好的三菱 WK60L 阳离子交换树 脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 3mL， 用 3 倍柱体积的水洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 关 闭活塞。将步骤 （2） 处理好的样品缓慢地加入层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速 为 1 滴每秒。用水做洗脱剂， 洗脱体积为 2 倍柱体积， 收集洗脱液 ； （4） 将洗脱液过阿拉丁阴离子交换树脂柱， 除杂和富集。将预先处理好的阿拉丁阴离 子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积。
29、为 3mL。用 3 倍柱体积的水洗涤填料， 除去树脂中 的杂质， 洗涤完成后、 关闭活塞。将步骤 （3） 收集的洗脱液处理好的样品缓慢地加入层析柱 中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 1 滴每秒。首先用 3 倍柱体积的水洗脱， 除去杂质， 然后用浓度为 0.4mol/L HCl 做洗脱剂， 洗脱体积为 3 倍柱体积， 收集洗脱液 ； （5） 将收集液转到浓缩瓶中， 以浓缩温度为 70， 转速为 60rpm， 进行真空旋转蒸发至 2mL， 准确记录浓缩后的体积， 过膜后作为液相检测样品 ； （6） 液相检测。色谱柱 Diamosil C18(2) 5u， 2504.6mm， 流动相 A 。
30、： 0.1% 三氟乙酸水 说 明 书 CN 103760246 A 7 5/7 页 8 溶液， 流动相 B ： 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液， 流速 1mL/min ； 梯度洗脱程序 ： 从 0 到 45min， 流动 相B浓度由5%梯度洗脱到35%， 洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数， 进样量20L， 柱温常温， 波长， 215nm ； （7） 按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。 0028 实施例 3 ： 本发明所提供的测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量的方法， 包 括以下步骤 ： （1） 将待检牛奶置于烧杯中， 加入浓度为 5 mg/mL 的酪蛋白磷酸肽 。
31、（CPP） 标准溶液， 混 匀， 加标成 50ppm 的酪蛋白磷酸肽分散溶液 ； （2） 脱蛋白。方法是取 5g 事先配置好的样品于 50mL 塑料离心管中， 加入 5g 水， 混匀后 再加入氯仿 ： 正丁醇溶液 （预先配成体积比 4:1 混合液） 2.5mL， 漩涡混匀并超声 15min， 然后 以 4800rpm 离心 5min， 取出上清重复上述操作处理 3 次。取上清液滤纸过滤后备用 ； （3） 过罗门哈斯 AMBERJET UP6040 阳离子交换树脂柱脱钙。将预先处理好的罗门哈斯 AMBERJET UP6040 阳离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 3mL， 用 3 倍柱体。
32、积的水 洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 关闭活塞。将步骤 （2） 处理好的样品缓慢地加入层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 1 滴每秒。用水做洗脱剂， 洗脱体积为 2 倍柱体积， 收集 洗脱液 ； （4） 将洗脱液过德国 Lewatit M500 阴离子交换树脂柱， 除杂和富集。将预先处理好的 德国 Lewatit M500 阴离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 3mL。用 2 倍柱体积的 水洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 洗涤完成后、 关闭活塞。将步骤 （3） 收集的洗脱液处理好 的样品缓慢地加入层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 1 滴每秒。首先用 3 。
33、倍柱 体积的水洗脱， 除去杂质， 然后用浓度为 0.4mol/L HCl 做洗脱剂， 洗脱体积为 3 倍柱体积， 收集洗脱液 ： （5） 将收集液转到浓缩瓶中， 以浓缩温度为 70， 转速为 60rpm， 进行真空旋转蒸发至 2mL， 准确记录浓缩后的体积， 过膜后作为液相检测样品 ； （6） 液相检测。色谱柱 Diamosil C18(2) 5u， 2504.6mm， 流动相 A ： 0.1% 三氟乙酸水 溶液， 流动相 B ： 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液， 流速 1mL/min ； 梯度洗脱程序 ： 从 0 到 45min， 流动 相B浓度由5%梯度洗脱到35%， 洗脱时段中均以流动相A补。
34、足余下的百分数， 进样量20L， 柱温常温， 波长， 215nm ； （7） 按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。 0029 实施例 4 ： 本发明所提供的测定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量的方法， 包 括以下步骤 ： （1） 将待检牛奶置于烧杯中， 加入浓度为 5 mg/mL 的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准溶液， 混 匀， 加标成 50ppm 的酪蛋白磷酸肽分散溶液 ； （2） 脱蛋白。方法取 10g 事先配置好的样品于 50mL 塑料离心管中， 加入 10g 水， 混匀 后再加入1.5三氯乙酸10g漩涡混匀并超声15min， 然后以4400rpm离心15min。
35、， 离心后将 离心管放入65的水浴锅中水浴15min， 再以4400rpm离心15min。 取上清液滤纸过滤后备 用 ； （3）过 0017(732) 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂柱脱钙。将预先处理好的 0017(732) 强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 5mL， 用 3 倍 说 明 书 CN 103760246 A 8 6/7 页 9 柱体积的水洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 关闭活塞。将步骤 （2） 处理好的样品缓慢地加入 层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 1 滴每秒。用水做洗脱剂， 洗脱体积为 2 倍柱 体积， 收集洗脱液 ； （4） 将洗脱液。
36、过美国 Amberlite IRA-400 阴离子交换树脂柱， 除杂和富集。将预先处 理好的美国 Amberlite IRA-400 阴离子交换树脂填料装入层析柱中， 装柱体积为 5mL。用 2 倍柱体积的水洗涤填料， 除去树脂中的杂质， 洗涤完成后、 关闭活塞。将步骤 （3） 收集的洗 脱液处理好的样品缓慢地加入层析柱中， 打开活塞， 使液体缓慢流下， 流速为 1 滴每秒。首 先用 3 倍柱体积的水洗脱， 除去杂质， 然后用浓度为 0.2mol/L HCl 做洗脱剂， 洗脱体积为 3 倍柱体积， 收集洗脱液 ； （5） 将收集液转到浓缩瓶中， 以浓缩温度为 65， 转速为 50rpm， 进行。
37、真空旋转蒸发至 2mL， 准确记录浓缩后的体积， 过膜后作为液相检测样品 ； （6） 液相检测。色谱柱 Diamosil C18(2) 5u， 2504.6mm， 流动相 A ： 0.1% 三氟乙酸水 溶液， 流动相 B ： 0.1% 三氟乙酸乙腈溶液， 流速 1mL/min ； 梯度洗脱程序 ： 从 0 到 45min， 流动 相B浓度由5%梯度洗脱到35%， 洗脱时段中均以流动相A补足余下的百分数， 进样量20L， 柱温常温， 波长， 215nm ； （7） 按外标法以峰面积法计算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的浓度。 0030 结果与讨论 1、 前处理方法讨论 前处理中有几个注意点， 首先是样品。
38、加入液态奶中需要充分混匀， 以免重复取样检测 时结果相差较大。其次脱蛋白时使用的三氯乙酸溶液的浓度及水浴温度要适宜， 防止产生 因三氯乙酸溶液浓度过高或温度过高对酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的影响及过低导致除杂效果不 好的问题。因此适宜的三氯乙酸溶液的浓度及水浴的温度是本方法的一个关键点。 0031 2、 方法的线性相关性及检出限 浓度分别为 0.0800、 0.1200、 0.1600、 0.2000、 0.2400、 0.2800mg/mL 的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准品溶液依次进样， 进样量均为20L， 外标法定量。 以峰面积A为纵坐标， 浓度C为 横坐标进行线性回归， 得到 A=9.。
39、9105C-21143， 相关系数 R2=0.9999。酪蛋白磷酸肽 （CPP） 在 0.0800mg/mL-0.2800mg/mL 范围内有良好的线性关系。 0032 经实验测定， 方法检测限为 10g/mL， 图 6 为 10g/mL 的酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标 准品色谱图， 此浓度下信噪比达到了 3。 0033 3、 实际样品检测结果 HPLC 检测结果见图 2 和表 5。 0034 表 5 牛奶中酪蛋白磷酸肽 （CPP） 检测结果 物质保留时间 （min）添加水平 （g/mL）测定出含量 （g/mL）回收率 酪蛋白磷酸肽 （CPP）36.14010095.1495.14% 由图 5。
40、 酪蛋白磷酸肽 （CPP） 标准品、 实际样品和空白液态牛奶样品重叠色谱图， 可以看 出， 在空白液态牛奶的的提取液中， 几乎不存在对样品中酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的干扰。另外 参见图 3 为牛奶中添加后再加入酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的色谱图， 可以进一步定性牛奶中添 加酪蛋白磷酸肽 （CPP） 后所提取的样品中酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的存在。 0035 4、 结论 说 明 书 CN 103760246 A 9 7/7 页 10 本文建立了用高效液相色谱检测牛奶实际样品中酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的定量分析方 法， 减少了实验初期在实验试剂、 仪器设备等方面的资金投入的同时， 运用相对简。
41、单高效的 纯化步骤进行操作， 实现酪蛋白磷酸肽 （CPP） 的分离， 保证了定量精度， 并有效去除其他蛋 白质和脂类等杂志干扰， 提高了最终检测的灵敏度。 方法的检出限为10g/mL， 有效地确保 实验数据的准确度， 有利于酪蛋白磷酸肽 （CPP） 含量相对较低的样品检测。 说 明 书 CN 103760246 A 10 1/4 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103760246 A 11 2/4 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103760246 A 12 3/4 页 13 图 5 说 明 书 附 图 CN 103760246 A 13 4/4 页 14 图 6 说 明 书 附 图 CN 103760246 A 14 。