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1、(10)申请公布号 CN 103776913 A (43)申请公布日 2014.05.07 CN 103776913 A (21)申请号 201210442647.0 (22)申请日 2012.10.25 G01N 30/02(2006.01) (71)申请人 鲁南新时代生物技术有限公司 地址 273400 山东省临沂市费县北外环路 1 号 (72)发明人 赵志全 王军 李娜 (54) 发明名称 替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法 (57) 摘要 本发明公开了一种替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法， 是将替考拉宁发酵液加碱处 理后， 经过超声与两次离心， 取澄清液过一次性滤。
2、 膜后上机检测分析 ； 高效液相色谱仪的主要配置 为反相 C18 柱， 检测器为紫外检测器 ； 所用流动 相为乙酸铵溶液 - 乙腈缓冲液进行梯度洗脱， 在 277nm 条件下进行数据采集分析。本发明的检测 方法简便快捷， 灵敏度高， 准确性好。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103776913 A CN 103776913 A 1/1 页 2 1. 一种替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法， 其特征在于 ： 取替考拉宁发。
3、酵液， 用 NaOH 溶液调节 pH 至碱性， 超声 0.2-1h 后离心 1-3 次， 取上清液， 过 0.22m 滤膜后进行 HPLC 检测， 检测条件为 ： (1) 色谱柱 ： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相 C18 柱 ； (2) 检测器 ： 紫外检测器 ； (3) 检测波长 ： 277nm ； (4) 流动相 ： A ： 0.01mol/L 乙酸铵溶液， B ： 90乙腈水溶液， 过滤超声后使用， 梯度洗 脱 ； 极性有机溶剂的浓度为连续性递增， 0min 至 17min 由 5递增至 50， 17min 至 25min 由 50递减至 5 ； (5) 流速 ： 1.0mL/m。
4、in ； (6) 柱温 ： 25 ； (7) 进样体积 ： 20L。 2. 根据权利要求 1 所述的替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法， 其特征在于 ： 取 替考拉宁发酵液， 用NaOH溶液调节pH至8-12， 超声30min后置于离心管中， 于10000rpm下 离心 10min， 取上清液置于另一离心管中， 于 10000rpm 下离心 10min， 取上清液， 过 0.22m 滤膜， 按所述检测条件进行 HPLC 检测。 3. 根据权利要去 2 所述的替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法， 其特征在于 ： 用 浓度为 10 NaOH 溶液调节替考拉宁发酵液的 pH 至 。
5、10。 权 利 要 求 书 CN 103776913 A 2 1/3 页 3 替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法 技术领域 0001 本发明属于检测方法技术领域， 具体而言， 涉及一种替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法。 背景技术 0002 替考拉宁属于糖肽类抗生素， 对革兰氏阳性菌具有强大的抗菌活性， 临床上常用 于严重的革兰氏阳性菌感染， 对金葡菌的作用常优于糖肽类抗生素万古霉素， 因此替考 拉宁的生产与研发日益受到重视。最早替考拉宁是国外 Parenti 等从一株游动放线菌 A.teichomyceticus nov.sp. 发酵得到的， 该菌种即现在常用的 ATCC。
6、31121 ； 国内研究主要 有稀有放线菌 SIIA92-363、 A.teichomyceticus 98-1-227 及其 SIIA 05-03-136， 该三株菌 的发酵液中均可分离到替考拉宁。研究发现该药物是一组复杂的化合物， 由 5 个结构很相 近的 TA2-1、 TA2-2、 TA2-3、 TA2-4和 TA2-5组成。第 6 个活性物质是 TA3-1， 该化合物不存在于发酵 液中， 但在提取和纯化中均有微量存在。 0003 随着发酵技术的日益提高， 替考拉宁发酵液单位的检测分析在生产与研发中也日 益突出。目前常用的发酵液单位检测是高效液相色谱法 (HPLC)， 相对于生物检测或其。
7、他方 法， HPLC 法具有快速分析、 定量准确等优点， 所以应用也日益广泛。目前常用的 HPLC 法为 2001 年第十四版日本药典 (JP XIV) 规定的检测方法， 具体为 ： 流动相 A ： 15乙腈 - 磷酸 二氢钠溶液 (0.025mol/L)， B ： 70乙腈 - 磷酸二氢钠溶液 (0.025mol/L)， 两相均用 1mol/L NaOH 溶液调节 pH 至 6.0， 梯度洗脱， 流速为 1.8mL/min。该方法缺点在于 ： 每个样品分析时 间为 60min， 不便于快速检测 ； 流速较高， 长时间使用会导致色谱柱柱压升高， 增大泵损耗， 损坏色谱柱， 影响分析的准确度与灵。
8、敏度。 发明内容 0004 鉴于现有技术的不足， 本发明的目的在于缩短 HPLC 法检测替考拉宁发酵液单位 的分析时间， 同时提高高效液相色谱柱的分离效果与使用寿命， 从而提供一种快速检测替 考拉宁发酵液单位的方法。 0005 为了实现本发明的目的， 发明人通过大量试验研究， 最终获得如下技术方案 ： 0006 一种替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法， 包括如下步骤 ： 取替考拉宁发酵 液， 用 NaOH 溶液调节 pH 至碱性， 超声 0.2-1h 后离心 1-3 次， 取上清液， 过 0.22m 滤膜后 进行 HPLC 检测， 检测条件为 ： 0007 (1) 色谱柱 ： 以十八。
9、烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相 C18 柱 ； 0008 (2) 检测器 ： 紫外检测器 ； 0009 (3) 检测波长 ： 277nm ； 0010 (4)流动相 ： A ： 0.01mol/L乙酸铵溶液， B ： 90乙腈水溶液， 过滤超声后使用， 梯度 洗脱 ； 极性有机溶剂的浓度为连续性递增， 0min至17min由5递增至50， 17min至25min 由 50递减至 5 ； 说 明 书 CN 103776913 A 3 2/3 页 4 0011 (5) 流速 ： 1.0mL/min ； 0012 (6) 柱温 ： 25 ； 0013 (7) 进样体积 ： 20L。 0014 优选地。
10、， 所述替考拉宁发酵液单位的 HPLC 快速检测方法， 包括如下步骤 ： 取替考 拉宁发酵液， 用 NaOH 溶液调节 pH 至 8-12， 超声 30min 后置于离心管中， 于 10000rpm 下离 心 10min， 取上清液置于另一离心管中， 于 10000rpm 下离心 10min， 取上清液， 过 0.22m 滤 膜， 按所述检测条件进行 HPLC 检测。 0015 进一步优选地， 上述对替考拉宁发酵液进行前处理过程中， 采用浓度为 10 NaOH 溶液调节替考拉宁发酵液的 pH 至 10。 0016 利用本发明的方法对替考拉宁发酵液进行检测后， 替考拉宁浓度计算方法为 ： 用替考。
11、拉宁标准品配成一定梯度浓度的标准液， 20L 体积进样， 以 A25 个组分峰面积之 和 - 浓度作线性回归， 得出线性回归方程， 利用该方程和样品中替考拉宁的峰面积计算发 酵液中替考拉宁的含量。 0017 与现有技术相比， 本发明的检测方法简便快捷， 灵敏度高， 准确性好。 经试验， 线性 范围为 0.25 5.0mg/mL 范围内， 相关系数均在 0.999 以上。样品检测专一性强， 各项方法 学指标均可满足发酵液中替考拉宁的检测需要。 附图说明 0018 图 1 替考拉宁标准品色谱图 ； 0019 图 2 实施例 1 的发酵液样品色谱图。 具体实施方式 0020 下面结合具体实验对本发明。
12、作进一步阐述， 但不限制本发明。 0021 1、 样品处理方法 0022 取一定量的发酵液， 用浓度为 10 NaOH 溶液调节 pH 至 10， 超声 30min 后置于离 心管中， 于 10000rpm 下离心 10min， 取上清液置于另一 10mL 离心管中， 于 10000rpm 下离心 10min， 取上清液， 过 0.22m 滤膜后上机检测。 0023 2、 色谱条件 0024 (1) 色谱柱 ： 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反相 C18 柱 ； 0025 (2) 检测器 ： 紫外检测器 ； 0026 (3) 检测波长 ： 277nm ； 0027 (4)流动相 ： A ： 。
13、0.01mol/L乙酸铵溶液， B ： 90乙腈水溶液， 过滤超声后使用， 梯度 洗脱 ； 极性有机溶剂的浓度为连续性递增， 0min至17min由5递增至50， 17min至25min 由 50递减至 5 ； 0028 (5) 流速 ： 1.0mL/min ； 0029 (6) 柱温 ： 25 ； 0030 (7) 进样体积 ： 20L 0031 3、 标准品储备液 0032 精密称取 100mg 替考拉宁标准品置于 10mi 容量瓶中， 用 50乙醇定容至刻度， 摇 说 明 书 CN 103776913 A 4 3/3 页 5 匀， 配制成浓度为 10mg/ml 的标准储备液， 置于 4冰。
14、箱中备用。 0033 4、 标准曲线 0034 用 50乙醇将 3 下的标准品储备液稀释至 0.25、 0.5、 1.0、 2.0、 5.0mg/mL， 取各浓 度下 20L 体积进样， 以 A25 个组分峰面积之和 - 浓度作线性回归， 得出线性回归方程， 利 用该方程和样品中替考拉宁的峰面积计算发酵液中替考拉宁的含量。 0035 5、 精密度 0036 将1.0mg/mL的替考拉宁标准品溶液连续进样5次， 每次进样20L， 按照2下的色 谱条件进行测定， 记录峰面积， 计算精密度。 0037 6、 重复性试验 0038 取同一批发酵液， 按照 1 中的样品处理方法处理得到 5 个样品， 进。
15、样并按照 2 下的 色谱条件进行测定， 计算相对标准偏差， 比较重现性。 0039 7、 加样回收率试验 0040 在已知含量的发酵液中， 分别精密加入替考拉宁标准品， 使其浓度为 1.0、 2.0、 4.0mg/mL 各 3 份， 按照 1 下的样品处理方法处理， 按照 2 下的色谱条件测定， 计算回收率。 0041 8、 稳定性试验 0042 取1.0mg/ml的替考拉宁标准品溶液室温下放置， 分别于0、 2、 4、 8、 12、 24h下进样， 每次进样 20L， 按照 2 下的色谱条件进行测定， 查看样品溶液在 24h 内的稳定性。 0043 9、 样品测定 0044 取移种后培养 1。
16、00h 的发酵液于锥形瓶中， 按照 1 下的样品处理方法进行处理， 按 照 2 下的色谱条件进行测定， 计算药物峰面积， 带入相应的标准曲线方程中， 经计算得出替 考拉宁的浓度。 0045 10、 结果分析 0046 按照 4 下的方法制备标准曲线， 以 A2 5 个组分峰面积之和 - 浓度作线性回归， 得 出线性回归方程 Y 2596000X+1200(Y 为峰面积， X 为药物浓度 mg/mL)， 线性相关系数为 R2 0.9999， 可见替考拉宁在 0.25 5.0mg/mL 浓度范围内线性良好。 0047 精密度试验 5 次进样后按照峰面积计算相对标准偏差为 1.1， 表明该方法精密 。
17、度较好 ； 重复性试验 5 次进样后按照峰面积计算相对标准偏差为 1.5， 表明该方法重现性 好 ； 经加样后测定回收率， 经过峰面积计算得到替考拉宁回收率为 99.3， 表明该方法真 实性较高 ； 在稳定性试验中， 经过检测后， 根据峰面积计算相对标准偏差为 0.9， 表明该 样品标准液在室温条件下放置 24h 比较稳定。 0048 取移种后培养 100h 的发酵液处理后上机检测， 计算出峰面积后代入线性回归方 程， 测得浓度为 1.3mg/mL。 0049 由以上试验结果可以看出， 该方法准确度高精密度好， 回收率、 线性关系、 稳定性 试验等指标均能满足常规发酵液中替考拉宁的快速检测。 说 明 书 CN 103776913 A 5 1/1 页 6 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103776913 A 6 。