《一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103604790 A (43)申请公布日 2014.02.26 CN 103604790 A (21)申请号 201310615554.8 (22)申请日 2013.11.28 G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 中南林业科技大学 地址 410004 湖南省长沙市韶山南路 498 号 (72)发明人 孙术国 林亲录 杨涛 徐友志 丁玉琴 罗非君 周慧 翁光辉 (74)专利代理机构 长沙星耀专利事务所 43205 代理人 宁星耀 许伯严 (54) 发明名称 一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的 方法 (57) 摘要 一种基于量子点快速测定大米谷蛋。
2、白含量 的方法， 包括以下步骤 ：（1） CdTe 量子点的制备 ； （2） 用于检测反应的母液配制 ；（3） 量子点快速测 定大米谷蛋白含量的方法的建立 ；（4） 检测大米 谷蛋白样品时的前处理。 本发明中的制备CdTe量 子点的原料价格较低， 量子点制备简单， 采用量子 点快速测定大米谷蛋白含量时用量少， 检测成本 低。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图5页 (10)申请公布号 CN 103604790 A CN 103604790 A 1/1 页 2 1.。
3、 一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法， 其特征在于， 包括以下步骤 ： （1） CdTe 量子点的制备 称取 1530 mg Te 粉、 2060 mg NaBH4放入小玻璃瓶中， 用注射器向小玻璃瓶中注入 1 mL 蒸馏水， 低温 28避光反应 26 小时， 获反应前体物质 ； 称取 200260 mg CdCl2和 280360mg 2- 巯基乙胺， 将其溶于 160 mL 蒸馏水， 然后采 用 0.51.5 mol/L 盐酸将混合溶液 pH 调至 56.5， 混合溶液再转入三颈烧瓶中 ； 向三颈烧瓶通入 N2， 磁力搅拌混合溶液， 待混合溶液温度上升至 8598， 冷凝回流， 反。
4、 应 2040min 后， 注入反应前体物质， 反应 60120 min， 获得 CdTe 量子点 ； （2） 用于检测反应的母液配制 在 100mL 三酸混合液中， 加入 84.7 mL 0.2mol/L 的 NaOH 溶液， 获得 pH11 的检测反应 的母液 ； 三酸混合液即磷酸、 乙酸、 硼酸的混合液， 浓度均为 0.04mol/L ； （3） 量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立 大米谷蛋白校准液的制备， 即将大米谷蛋白溶于步骤 （2） 所得母液中， 配制成浓度为 0.0040.132 mg/L 的大米谷蛋白校准液 （0、 0.004、 0.02、 0.036、 0.052、 0。
5、.068、 0.084、 0.1、 0.116 和 0.132 mg/L） ， 利用不同浓度的大米谷蛋白校准液与量子点 （浓度 0.1 g/L） 在 10mL棕色瓶避光的条件下反应2040 min， 采用荧光光谱仪在激发波长365 nm， 夹缝宽度5 nm， 发射波长 550 nm， 夹缝宽度 5 nm， 根据量子点的荧光强度变化建立标准曲线， 并进行非 线性拟合， 以此作为大米谷蛋白检测标准方法 ； （4） 检测大米谷蛋白样品时的前处理 大米粉碎 ： 每次称取准备好的原料大米， 放入粉碎机里研磨 13 min， 磨成粉末状后， 取 50 g 大米粉末， 加 pH11 的 NaOH 溶液浸泡提。
6、取 23h， 再用离心机 45006500 r/min 离心 1525 min， 收集蛋白上清液， 采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量。 权 利 要 求 书 CN 103604790 A 2 1/4 页 3 一种基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种测定大米谷蛋白含量的方法， 尤其是涉及一种基于量子点快速测 定大米谷蛋白含量的方法。 背景技术 0002 大米蛋白被公认为优质食用蛋白， 最初 Osborne ( 1924 年 ) 根据溶解性质将大 米蛋白分为清蛋白、 球蛋白、 醇溶蛋白和谷蛋白， 其中谷蛋白和醇溶蛋白也叫贮藏蛋白， 是大米中的主要蛋白。
7、成分， 谷蛋白占总蛋白的 80% 以上 (Osborne T B. The Vegetable Proteins, 2nd edM. New York: Longmans, Green & Co, 1924, 154.)。 从营养学分析， 大米蛋白中只有谷蛋白和球蛋白能被人体消化吸收 (Kum amaru T, Satoh H, Lwata N, et al. Mutants for rice storage proteinsJ. THEOR APPL GENET, 1988, 76: 11-16.)， 而且， 在谷蛋白中 , 稻米第一限制性氨基酸赖氨酸 ( Lys) 含量最高 , 因而谷蛋白。
8、不但 本身具有较高的营养价值， 而且其在大米中的含量能间接反映大米整体的营养价值， 因此， 建立一种快速检测大米谷蛋白含量的方法可以便捷、 准确、 可靠的鉴定大米营养品质， 为大 米品质评级、 大米食品安全鉴定提供可靠依据。 0003 现有国内大米蛋白的检测方法主要为一凯氏定氮法 (Kjeldahl Method)， 国外有 少量利用考马斯亮蓝 G2250 和大米谷蛋白结合， 产物引起染料最大吸收峰， 反应的速率约 2 min， 产物稳定性也较好 ( 约 1 h)， 但存在灵敏度较低， 选择性较差且检测成本高等问题， 在 大规模工业生产应用上还存在很大的局限性。 发明内容 0004 本发明要解。
9、决的技术问题是， 克服现有技术的不足， 提供一种灵敏度和回收率高， 选择性和重复性好， 操作简便， 适于广泛使用的基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方 法。 0005 本发明解决其技术问题采用的技术方案是， 一种基于量子点快速测定大米谷蛋白 含量的方法， 包括以下步骤 ： （1） CdTe 量子点的制备 称取 1530 mg Te 粉、 2060 mg NaBH4放入小玻璃瓶中， 用注射器向小玻璃瓶中注入 1 mL 蒸馏水， 注射器针头留在玻璃瓶的盖子上， 且针头不能被玻璃瓶中溶液所掩盖， 低温 28避光反应 26 小时， 获反应前体物质 ； 称取 200260 mg CdCl2和 28036。
10、0mg 2- 巯基乙胺， 将其溶于 160 mL 蒸馏水， 然后采 用 0.51.5 mol/L 盐酸将混合溶液 pH 调至 56.5， 混合溶液再转入三颈烧瓶中 ； 向三颈烧瓶通入 N2， 磁力搅拌混合溶液， 待混合溶液温度上升至 8598， 冷凝回流， 反 应 2040min 后， 注入反应前体物质， 反应 60120 min， 获得 CdTe 量子点 ； CdTe 量子点的粒径大小、 形态和性质分析 ： 采用高分辨率透射电子显微镜 (HR-TEM) 对 CdTe 量子点粒径大小和形态进行表征 ； 将 说 明 书 CN 103604790 A 3 2/4 页 4 CdTe 量子点分别置于不。
11、同 pH、 温度和 NaCl 离子强度条件下， 分析 CdTe 量子点的荧光强度 变化 ； 将 CdTe 量子点分别置于不同 pH 条件下为 311（3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 和 11） ； 不同温度 条件下为 055 （0、 25、 35、 45和 55） ； 不同 NaCl 离子强度条件下为 0.10.9 mol/L（0.1 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5 mol/L、 0.7 mol/L、 0.9 mol/L） ； （2） 用于检测反应的母液配制 在 100mL 三酸混合液中， 加入 84.7 mL 0.2mol/L 的 NaOH 溶液， 获得 pH11。
12、 的检测反应 的母液 ； 三酸混合液即磷酸、 乙酸、 硼酸的混合液， 浓度均为 0.04mol/L ； （3） 量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立 大米谷蛋白校准液的制备， 即将大米谷蛋白溶于步骤 （2） 所得母液中， 配制成浓度为 0.0040.132 mg/L 的大米谷蛋白校准液 （0、 0.004、 0.02、 0.036、 0.052、 0.068、 0.084、 0.1、 0.116 和 0.132 mg/L） ， 利用不同浓度的大米谷蛋白校准液与量子点 （浓度 0.1 g/L） 在 10mL棕色瓶避光的条件下反应2040 min， 采用荧光光谱仪在激发波长365 nm， 夹缝。
13、宽度5 nm， 发射波长 550 nm， 夹缝宽度 5 nm， 根据量子点的荧光强度变化建立标准曲线， 并进行非 线性拟合， 以此作为大米谷蛋白检测标准方法 ； 检测方法的特异性和回收率分析 ： 分别准确称取 1.00 mg 大米谷蛋白和 0.05 mg、 0.50 mg 和 5.00 mg 大米清蛋白， 将谷 蛋白和清蛋白一起添加到步骤 （2） 所得50 mL 反应的母液中， 混合均匀， 其余测定操作程序 参考大米谷蛋白检测标准方法， 确定各种浓度清蛋白对谷蛋白测定结果的干扰 ； 另外检验 Ca2+、 Mg2+、 Fe3+、 Na+、 Cl-和 SO42-对谷蛋白测定的干扰试验 ； （4） 。
14、检测大米谷蛋白样品时的前处理 大米粉碎 ： 每次称取准备好的原料大米， 放入粉碎机里研磨 13 min， 磨成粉末状后， 取 50 g 大米粉末， 加 pH11 的 NaOH 溶液浸泡提取 23h， 再用离心机 45006500 r/min 离心 1525 min， 收集蛋白上清液， 采用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量。 0006 本发明之基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法， 可以简便、 快速的测定大 米中的谷蛋白的含量， 和现有的凯氏定氮法和考马斯亮蓝法相比， 能提高灵敏度、 回收率和 抗干扰能力， 缩短检测时间， 提高检测效率。 0007 本方法采用 CdTe 量子点作为荧光。
15、探针与大米谷蛋白进行反应， 根据不同浓度的 大米谷蛋白与稍过量的 CdTe 量子点反应时， 导致 CdTe 量子点荧光强度有规律性的变化而 建立测定蛋白的含量方法， 与现有技术中采用的考马斯亮蓝 G2250 法相比， 具有以下优势 ： 其一、 灵敏度高， 最低蛋白质检测量可达 0.4g ； 其二、 抗干扰能力强， 特别是抗大米中清 蛋白的干扰， 这样能有效提高检测大米样品中谷蛋白的准确度 ； 其三、 CdTe 量子点制备简 单， 受环境温度的影响小， 因此对检测环境要求低， 而且每次检测用量少， 一次性制备的量 子点可常温避光长期贮藏备用 ； 其四、 量子点测定大米谷蛋白含量的操作简便， 使用。
16、时间较 短 （20 min） ， 提高了检测的效率。 0008 本发明中的制备 CdTe 量子点的原料价格较低， 量子点制备简单， 采用量子点快速 测定大米谷蛋白含量时用量少， 检测成本低。 说 明 书 CN 103604790 A 4 3/4 页 5 附图说明 0009 图 1 为本发明之 CdTe 量子点高分辨率透射电子显微镜 （HR-TEM） 观察图 ； 图 2 为 pH 对 CdTe 量子点荧光强度的影响图 ； 图 3 为温度对 CdTe 量子点荧光强度的影响图 ； 图 4 为 NaCl 浓度对 CdTe 量子点荧光强度的影响图 ； 图 5 为不同浓度的谷蛋白标准溶液对 CdTe 量子。
17、点荧光强度的影响 ； 注 ： a j 对应谷 蛋白标准溶液的浓度分布是 0、 0.004、 0.02、 0.036、 0.052、 0.068、 0.084、 0.1、 0.116、 0.132 mg/L ； 图 6 为量子点快速测定大米中谷蛋白含量的标准曲线图。 0010 具体实施方式 以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。 0011 实施例 1 本实施例包括以下步骤 ： （1） CdTe 量子点的制备 ： 称取 25 mg Te 粉、 40 mg NaBH4放入小玻璃瓶中， 用注射器向小玻璃瓶中注入 1mL 蒸 馏水， 注射器针头留在玻璃瓶的盖子上， 且针头不能被玻璃瓶中溶液。
18、所掩盖， 低温 4避光 反应 4 小时， 获反应前体物质 ； 称取 200 mg CdCl2和 280mg 2- 巯基乙胺， 将其溶于 160 mL 蒸馏水， 然后采用 1mol/L 盐酸将混合溶液 pH 调至 5.5， 混合溶液再转入三颈烧瓶中 ； 向三颈烧瓶通入 N2， 磁力搅拌混合溶液， 待混合溶液温度上升至 90， 冷凝回流， 反应 40min 后， 注入反应前体物质， 反应 60 min， 获得 CdTe 量子点 ； CdTe 量子点粒径大小、 形态和性质分析 采用高分辨率透射电子显微镜 (HR-TEM) 对 CdTe 量子点粒径大小和形态进行表征， 结 果如图 1， 表明 CdTe。
19、 量子点呈现球状， 平均粒径大小为 7 nm， 粒度分布均匀。将 CdTe 量子 点分别置于不同 pH（3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10 和 11） 下测试荧光强度， 结果如图 2， 表明 CdTe 量 子点在碱性条件下荧光特性较好。 将CdTe量子点分别置于不同温度条件下 （0、 25、 35、 45和 55） 测试荧光强度， 结果如图 3， 表明 CdTe 量子点在温度 055 荧光强度高。将 CdTe 量 子点分别置于不同 NaCl 离子强度条件下 （0.1、 0.3、 0.5、 0.7、 0.9 mol/L） 测试荧光强度， 结 果如图 4 所示， 结果表明 NaCl 离。
20、子强度在 0.10.5 mol/L 内对 CdTe 量子点的荧光强度影 响不明显， NaCl 离子强度在 0.70.5 mol/L 内对 CdTe 量子点的荧光强度影响较大， 因此采 用大米谷蛋白检测标准方法检测大米谷蛋白含量要求 NaCl 浓度 0.5 mol/L。 0012 （2） 用于检测反应的母液配制 在 100mL 三酸混合液中， 加入 84.7 mL 0.2mol/L 的 NaOH 溶液， 获得 pH11 的检测反应 的母液 ； 三酸混合液即磷酸、 乙酸、 硼酸的混合液， 浓度均为 0.04mol/L。 0013 （3） 量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法的建立 在 10 个 25。
21、mL 容量瓶中， 编号为 0 9， 首先分别添加步骤 （2） 所制得的反应母液 2.0 mL （含约 3 g/L 量子点） ， 在编号 0 9 的容量瓶中分别加入谷蛋白， 并用 pH 11.0 的母 液稀释至刻度， 摇匀， 最终定容后编号 0 9 的容量瓶中谷蛋白浓度分别是， 0.000、 0.004、 0.020、 0.036、 0.052、 0.068、 0.084、 0.100、 0.116、 0.132 mg/L， 在 25温度下避光反应 说 明 书 CN 103604790 A 5 4/4 页 6 20min， 在激发波长 365nm（夹缝宽度 5nm） ， 发射波长 550nm（夹。
22、缝宽度 5nm） 的条件下测定， 实验重复三次， 结果如图 4， 结果表明量子点强度随谷蛋白浓度增加呈现有规律的增加， 且 呈线性关系， 结果如图 5， 回归系数R 2 为 0.9985， 说明线性关系良好， 建立检测谷蛋白的直 线回归方程为y=3143x+187.74。检测灵敏度达 4g， 检测范围为 0.004 0.132 mg/L。 0014 检测方法的特异性和回收率分析 分别准确称取 1.00 mg 大米谷蛋白和 0.05 mg、 0.50 mg 和 5.00 mg 大米清蛋白， 将谷 蛋白和清蛋白一起添加到50 mL的母液中， 混合均匀， 其余测定操作参考上述大米谷蛋白检 测标准方法。
23、， 确定各种浓度清蛋白对谷蛋白测定结果的干扰。另外检验 Ca2+、 Mg2+、 Fe3+、 Na+、 Cl-和 SO42-对谷蛋白测定的干扰试验。上述共存物质对检测的干扰如表 1。 0015 结果表明清蛋白和其它离子对该检测谷蛋白的含量方法干扰少， 且回收率较高。 0016 结果显示， 采用本发明所述的基于量子点快速测定大米谷蛋白含量的方法， 具有 操作简单， 灵敏度高， 检测范围宽， 抗干扰强和回收率高优势。 说 明 书 CN 103604790 A 6 1/5 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103604790 A 7 2/5 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103604790 A 8 3/5 页 9 图 4 说 明 书 附 图 CN 103604790 A 9 4/5 页 10 图 5 说 明 书 附 图 CN 103604790 A 10 5/5 页 11 图 6 说 明 书 附 图 CN 103604790 A 11 。