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1、(10)申请公布号 CN 103816207 A (43)申请公布日 2014.05.28 CN 103816207 A (21)申请号 201410066575.3 (22)申请日 2014.02.25 A61K 36/424(2006.01) A61K 9/127(2006.01) A61K 9/00(2006.01) A61K 47/34(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 3/06(2006.01) C08G 65/48(2006.01) (71)申请人 盐城师范学院 地址 224002 江苏省盐城市开放大道 50 号 (72)发明人 喻樊 (54) 发。
2、明名称 一种绞股蓝皂苷长循环脂质体制剂及其制备 方法 (57) 摘要 一种绞股蓝皂苷长循环脂质体制剂及其制备 方法。本发明公开了提供一种利用聚乙二醇对 - 谷甾醇进行修饰后制备绞股蓝皂苷长循环脂 质体的方法， 与普通磷脂聚乙二醇修饰的长循环 脂质体相比， 材料合成成本大幅度降低， 分离变得 更为容易， 收率大大提高， 大幅降低了长循环脂质 体的成本。 该新型长循环脂质体原料易得， 来源丰 富， 价廉， 稳定性好， 能显著延长绞股蓝皂苷在体 内的滞留时间， 使绞股蓝皂苷被动靶向于肿瘤细 胞， 提高肿瘤治疗的效果， 降血脂作用优的特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 11 页。
3、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书11页 (10)申请公布号 CN 103816207 A CN 103816207 A 1/2 页 2 1. 一种聚乙二醇修饰 - 谷甾醇为膜材的绞股蓝皂苷长循环脂质体， 其特征在于， 材 料中含有如式 I 所示的化合物， 该化合物的制备方法包括步骤 ： (1)将-谷甾醇、 丁二酸酐、 4-二甲氨基吡啶混合于二氯甲烷中， 在30-60反应得到 如式 II 所示的化合物 ； (2)将式化合物、 聚乙二醇、 4-二甲氨基吡啶、 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚 胺盐酸盐混合于二氯甲烷中， 在 30-60反应得。
4、到如式 I 所示的化合物 ； 步骤 (1) 的反应中 - 谷甾醇、 丁二酸酐、 4- 二甲氨基吡啶的摩尔比为 1 ： 0.810 ： 0.8-5 ； 步骤 (2) 中式 II 化合物、 聚乙二醇、 4- 二甲氨基吡啶、 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为 1 ： O.83 ： O.83 ： O.83 ； 其中， n=3-125。 2. 如权利要求 l 所述的长循环脂质体， 其特征在于它主要是由绞股蓝皂苷、 磷脂材料、 式 I 化合物所组成。 3. 如权利要求 1、 2 所述的长循环脂质体， 其特征在于， 所述磷脂材料为 ： 二硬脂酰磷脂 酰乙醇胺、 磷脂酰胆碱、。
5、 磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰甘油、 甘油磷脂 酸、 二磷脂酰甘油、 鞘磷脂中的一种或几种的混合物。 4. 如权利要求 1、 2 所述的脂质体， 其特征在于， 所述脂质体的组成还包括甘露醇、 葡萄 糖、 吐温 -80、 维生素 E 或聚乙二醇中的一种或几种。 5. 如权利要求 1、 2 所述的脂质体， 其特征在于按重量百分比该脂质体含如下组分 ： 绞 股蓝皂苷 2 45， 磷脂材料 40 85， 式 I 化合物占制剂重量的 10 40。 6. 权利要求 1-5 任一项所述脂质体的制备方法， 其特征在于它包括如下步骤 ： (1) 将绞股蓝皂苷溶解于 pH 为 6.8 8.。
6、0 磷酸冲液中， 制成质量浓度为 O.1 20mg mL 绞股蓝皂苷缓冲液 ； (2)当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。 磷脂材料 ： 式I化合物 ： 乙醚 ： 绞股蓝皂苷缓冲液溶液的比例按 100 300 份 ： 15 200 份 ： 2 5 份 ： 5 30 份选取， 备 权 利 要 求 书 CN 103816207 A 2 2/2 页 3 用 ； (3) 绞股蓝皂苷脂质体的制备 ： 将磷脂材料、 式 I 化合物和乙醚混合， 然后旋转蒸发使 其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部， 向瓶中加入绞股蓝皂苷缓冲液溶液， 加入玻璃珠， 在 30 60下旋转振荡 15 60min 后。
7、， 放置 0.5 2h 充分水合即得。 7. 权利要求 1-5 任一项所述脂质体的制备方法， 其特征在于它包括如下步骤 ： (1)油相的制备 ： 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。 绞股蓝皂苷 ： 磷 脂材料 ： 式 I 化合物 ： 乙醇的比例按 10 30 份 ： 40 300 份 ： 10 100 份 ： 5 50 份的比 例选取材料， 混合均匀， 制备油相 ； (2) 水相的制备 ： 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。水相为磷酸盐 缓冲液 5 50 份， 缓冲液的 pH 为 6.8 8.0 ； (3) 脂质体的制备 ： 在恒温搅拌状态下， 将油相用针头。
8、匀速注入到温度为 35 60的 水相中， 恒温搅拌 1 4h 除乙醇， 即得。 8. 权利要求 15 任一项所述脂质体的制备方法， 其特征在于它包括如下步骤 ： (1) 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。磷脂材料 ： 式 I 化合物 ： 二氯 甲烷的比例为40300份 ： 10200份 ： 50500份制备油相， 将油相置于圆底烧瓶中， 旋 转蒸去二氯甲烷 ； (2) 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。10 200 份绞股蓝皂苷溶解 于 10 500 份磷酸盐缓冲液中， 制成水相 ； (3) 将水相加入油相中， 冰浴下， 探头超声 5 30min， 形成均匀。
9、的乳剂 ； (4)旋蒸除去有机相， 形成胶态后加入磷酸盐缓冲液10150份， 继续减压蒸发0.5 2h， 探头超声 3 20min， 即得。 9. 如权利要求 1 所述的脂质体， 其特征在于其可以制成冻干针剂、 注射剂、 透皮制剂、 气雾剂、 口服液、 溶液剂、 眼用制剂、 片剂或胶囊剂。 权 利 要 求 书 CN 103816207 A 3 1/11 页 4 一种绞股蓝皂苷长循环脂质体制剂及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及药物制剂领域， 尤其涉及一种生产绞股蓝皂苷长循环脂质体的方法， 更具体地说， 本发明涉及绞股蓝皂苷长循环脂质体和含有绞股蓝皂苷长循环脂质体的药物 制剂。 背景技术。
10、 0002 脂质体是靶向给药系统的一种新剂型， 它是由脂质双分子层构成的内部为水相的 封闭囊泡。脂质体作为一种智能给药载体， 具有靶向性， 生物相容性， 提高药物稳定性以及 降低毒副作用等显著优点， 因而得到人们越来越多的关注。普通脂质体虽然能够改善药物 的疗效， 但是进入体内后很快被体内网状内皮系统吞噬， 主要靶向在肝、 脾、 骨髓等网状内 皮系统器官中， 药物在体内滞留时间短， 且在体内易受蛋白、 酶等的作用而发生渗漏， 影响 疗效， 使毒性增大。 0003 近年来， 长循环脂质体成为国内外的研究热点。长循环脂质体是靶向制剂的一 种， 它具有长效、 降低毒性及稳定包封药物等优点， 用长循环。
11、脂质体包封后提高了药物的 靶向性， 降低了毒性。长循环脂质体是一种表面修饰了天然或合成亲水性聚合物的新型 脂质体， 这些聚合物形成的立体柔性亲水表面， 增加了脂质体的亲水性和空间位阻， 防止 生物分子、 细胞与脂质体相互作用， 使脂质体不易被血液中的调理素识别， 从而可以降低 体内网状内皮系统对脂质体的吞噬， 增加其在体内环境中的稳定性， 使其具有更长的体 内循环时间， 更高的血药浓度， 因此可以更好的发挥疗效， 降低毒性。长循环脂质体中， 研究最多的就是聚乙二醇 (PEG) 修饰的脂质体 (Advanced Drug Delivery Reviews， 1997， 24， 235-242)，。
12、 表面修饰聚乙二醇的脂质体在静脉注射后具有 “隐形” 的特点， 即可 逃避血浆中的调理素的调理， 从而减少巨噬细胞对药物的吞噬， 阻碍血液蛋白成分及磷脂 的结合， 延长药物在体内的循环时间 (Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology,2006,33,557-562)。 由于聚乙二醇修饰的一般为磷脂， 聚乙二醇与磷脂分子量 均较大， 磷脂价格昂贵， 且分子链上仅包含少量的活性基团， 在合成的过程中， 反应活性很 低， 且在与副产物分离时， 很容易吸附在树脂柱上， 分离也很困难， 造成磷脂聚乙二醇修饰 的长循环脂质体在实际应用中成本。
13、过高， 得不到广泛应用。 0004 绞股蓝又名七叶胆、 五叶参， 主要有效成分为多糖类、 黄酮类、 皂苷类及微量元素 类， 其功效主要是促进人体脂肪类物质代谢、 营养人体细胞， 同时具有不错的解毒消炎作 用， 广泛应用于高血脂、 脂肪肝、 肥胖、 便秘、 失眠、 乙肝、 慢性呼吸道炎症 ( 咽喉炎、 肠胃炎 等 ) 的治疗与保健。皂苷是其中一种有效成分。绞股蓝皂苷之所以 “神奇” 是因为其皂苷类 成分(84种)超过人参所含的数倍， 其对治疗和预防高血压等心血管疾病、 糖尿病、 便秘、 痔 疮、 哮喘、 偏头痛、 痤疮、 色斑等症状有显著功效， 并有较为明显的镇静、 催眠、 消除疲劳、 增 进食。
14、欲、 抗衰老的作用， 对肿瘤、 肝炎、 胃炎、 胃及十二指肠溃疡、 胃下垂、 口腔炎、 冠心病、 动 脉硬化、 胆结石、 肢体麻木、 皮肤粗糙、 男性不育、 性功能衰退、 肥胖及白发秃顶等具有较佳 疗效。绞股蓝皂苷还可能成为 21 世纪人类征服心血管疾病、 糖尿病、 紧张症、 癌症和艾滋病 说 明 书 CN 103816207 A 4 2/11 页 5 的主要生理活性物质。 0005 绞股蓝皂苷长循环脂质体首次以聚乙二醇修饰的 - 谷甾醇为膜材， 制备绞股蓝 皂苷长循环脂质体， 使药物以最小的损失到达作用部位， 可以提高绞股蓝皂苷的药效， 减少 用量， 是一种新型的剂型， 是技术创新的结果， 。
15、具有良好的市场前景。 因为它具有靶向性， 能 准确地达到作用部位， 这种给药方法是其他方法所不能比拟的。 本实验采用逆向蒸发法， 薄 膜分散法， 乙醇注入法制备了绞股蓝皂苷长循环脂质体， 并考察了其包封率， 筛选出一种制 备绞股蓝皂苷长循环脂质体的最优方法， 使其利用效率达到最高。绞股蓝皂苷长循环脂质 体能以最少的用量， 达到最好的治疗效果， 可能作为未来一种给药的主要发展方向。 0006 目前尚未见有关绞股蓝皂苷长循环脂质体的相关报道。 发明内容 0007 本发明的目的在于提供一种利用对 - 谷甾醇进行聚乙二醇修饰生产长循环 绞股蓝皂苷脂质体的处方和方法， 该方法工艺简单。出于该方法中介绍方。
16、法是对小分子 - 谷甾醇进行聚乙二醇修饰， 避免了对大分子量磷脂的修饰， 合成过程大为简化。且在分 离过程中， 本方法中聚乙二醇修饰的 - 谷甾醇也比聚乙二醇修饰的磷脂对色谱柱的吸附 要少， 从而分离变得更为容易， 收率大大提高， 与普通磷脂聚乙二醇修饰的长循环脂质体相 比， 成本大幅度降低， 不仅如此， 与普通磷脂聚乙二醇修饰的长循环脂质体相比， 该新型长 循环脂质体还能显著延长绞股蓝皂苷在体内的滞留时间， 使绞股蓝皂苷更有效地被动靶向 于肿瘤细胞， 提高抑瘤率， 减少绞股蓝皂苷的用药量， 提高治疗效率。稳定性实验表明该新 型长循环脂质体与普通长循环脂质体相比稳定性大大增加。降血脂实验也表明。
17、， 该新型长 循环脂质体的降血脂效果也显著优于普通长循环脂质体与单一的 - 谷甾醇组。 0008 本发明中提供一种如式 I 所示的聚乙二醇化 - 谷甾醇的制备方法， 所述的方法 不仅可以有效进行， 而且可以得到产率较高的、 易于分离的、 价格便宜的式 I 化合物。 0009 0010 其中， n=3-125 ； 优选 n=30-60。 说 明 书 CN 103816207 A 5 3/11 页 6 0011 本发明中， 提供了一种如式 I 所示的化合物的制备方法， 所述的方法包括步骤 ： (1)将-谷甾醇、 丁二酸酐、 4-二甲氨基吡啶混合于二氯甲烷中， 在30-60反应得到如式 II 所示的。
18、化合物 ； 0012 (2) 将式 II 化合物、 聚乙二醇、 4- 二甲氨基吡啶、 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙基 ) 碳二亚胺盐酸盐混合于二氯甲烷中， 在 30-60反应得到如式 I 所示的化合物 ； 0013 步骤 (1) 的反应中 - 谷甾醇、 丁二酸酐、 4- 二甲氨基吡啶的摩尔比为 1 ： 0.8 10 ： 0.8-5 ； 0014 步骤 (2) 中式 II 化合物、 聚乙二醇、 4- 二甲氨基吡啶、 1- 乙基 -(3- 二甲基氨基丙 基 ) 碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为 1 ： 0.8-3 ： 0.8-3 ： 0.8-3 ； 0015 本发明中， 提供了用式 I 化合物制备的。
19、绞股蓝皂苷长循环脂质体， 它主要是由绞 股蓝皂苷、 磷脂材料、 式 I 化合物所组成。 0016 其中， 所述磷脂材料为 ： 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 磷脂酰胆碱、 磷脂酰乙醇胺、 磷脂 酰丝氨酸、 磷脂酰肌醇、 磷脂酰甘油、 甘油磷脂酸、 二磷脂酰甘油、 鞘磷脂中的一种或几种的 混合物。 0017 其中， 所述脂质体的组成还包括甘露醇、 葡萄糖、 吐温 -80、 维生素 E 或聚乙二醇中 的一种或几种。 0018 其中， 按重量百分比该脂质体含如下组分 ： 绞股蓝皂苷245， 磷脂材料40 85， 式 I 化合物占制剂重量的 10 40。 0019 其中， 绞股蓝皂苷长循环脂质体的制备可以包括。
20、如下步骤 ： 0020 (1) 将绞股蓝皂苷溶解于 pH 为 6.8 8.0 磷酸缓冲液中， 制成质量浓度为 O.1 20mg mL 绞股蓝皂苷缓冲液 ； 0021 (2) 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。磷脂材料 ： 式 I 化合物 ： 乙醚 ： 绞股蓝皂苷缓冲液溶液的比例按 100 300 份 ： 15 200 份 ： 2 5 份 ： 5 30 份选 取， 备用 ； 0022 (3) 绞股蓝皂苷脂质体的制备 ： 将磷脂材料、 式 I 化合物和乙醚混合， 然后旋转蒸 发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部， 向瓶中加入绞股蓝皂苷缓冲液溶液， 加入玻 璃珠， 在 30 60。
21、下旋转振荡 15 60min 后， 放置 0.5 2h 充分水合即得。 0023 其中， 绞股蓝皂苷长循环脂质体的制备可以包括如下步骤 ： 0024 (1) 油相的制备 ： 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。绞股蓝皂 苷 ： 磷脂材料 ： 式 I 化合物 ： 乙醇的比例按 10 30 份 ： 40 300 份 ： 10 100 份 ： 5 50 份的比例选取材料， 混合均匀， 制备油相 ； 0025 (2) 水相的制备 ： 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。水相为磷 酸盐缓冲液 5 50 份， 缓冲液的 pH 为 6.8 8.0 ； 0026 (3) 脂质体。
22、的制备 ： 在恒温搅拌状态下， 将油相用针头匀速注入到温度为 35 60的水相中， 恒温搅拌 1 4h 除乙醇， 即得。 0027 其中， 绞股蓝皂苷长循环脂质体的制备可以包括如下步骤 ： 0028 (1) 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。磷脂材料 ： 式 I 化合物 ： 二氯甲烷的比例为 40 300 份 ： 10 200 份 ： 50 500 份制备油相， 将油相置于圆底烧瓶 中， 旋转蒸去二氯甲烷 ； 说 明 书 CN 103816207 A 6 4/11 页 7 0029 (2) 当固体单位为毫克时， 液体单位以毫升计， 以此类推。10 200 份绞股蓝皂苷 溶解于。
23、 10 500 份磷酸盐缓冲液中， 制成水相 ； 0030 (3) 将水相加入油相中， 冰浴下， 探头超声 5 30min， 形成均匀的乳剂 ； 0031 (4) 旋蒸除去有机相， 形成胶态后加入磷酸盐缓冲液 10 150 份， 继续减压蒸发 0.5 2h， 探头超声 3 20min， 即得。 0032 其中， 绞股蓝皂苷长循环脂质体可以进一步制成冻干针剂、 注射剂、 透皮制剂、 气 雾剂、 口服液、 溶液剂、 眼用制剂、 片剂或胶囊剂。 0033 本发明是一种能显著延长绞股蓝皂苷在体内循环时间的长循环脂质体， 大鼠药动 学研究表明本发明中的长循环脂质体比普通磷脂修饰的长循环脂质体循环时间存在。
24、显著 性差异， 半衰期大大延长。 且由于制备材料中不含有胆固醇， 不仅没有高胆固醇摄入引起的 心脑血管疾病的副作用， 反而 - 谷甾醇能降低血液中胆固醇的含量， 降血脂作用也较普 通长循环脂质体作用明显， 能降低发生心脑血管疾病的机率。 药效学研究表明， 本发明的抑 瘤作用显著强于 普通长循环脂质体， 相同剂量下， 抑瘤作用显著优于普通长循环脂质体， 稳定性实验也表明该发明中的长循环脂质体对绞股蓝皂苷的渗漏率要显著低于普通长循 环脂质体， 稳定性优于普通磷脂修饰的长循环脂质体组。 0034 综上所述， 本发明制备的绞股蓝皂苷长循环脂质体， 式 I 化合物的疏水链部分能 进入脂质体的疏水层， 增。
25、强脂质体内部结构的稳定性， 亲水链段部分位于脂质体亲水外层， 能发挥立体稳定作用和体内长循环作用。 在制备过程中， 由于选用-谷甾醇制备式I化合 物作为膜材， 不含胆固醇， 有效降低有害低密度胆固醇的水平 ( 减少了胆固醇对人体的影 响 )， 起到预防心血管疾病的作用， 扩大了脂质体这一剂型在心血管疾病领域的应用。用该 方法中介绍的式 I 化合物生产的绞股蓝皂苷长循环脂质体， 与普通磷脂修饰的长循环脂质 体相比， 成本大幅度降低， 对小分子 - 谷甾醇的聚乙二醇修饰比对大分子磷脂的修饰要 简单， 在分离过程中， 聚乙二醇修饰的 - 谷甾醇也比聚乙二醇修饰的磷脂对色谱柱的吸 附要少， 从而分离变。
26、得更为容易， 收率大大提高， 大幅降低了长循环脂质体的成本。实验表 明， 与普通磷脂修饰的长循环脂质体相比， 该新型长循环脂质体原料易得， 来源丰富， 价廉， 稳定性好， 能显著延长绞股蓝皂苷在体内的滞留时间， 使绞股蓝皂苷被动靶向于肿瘤细胞， 提高肿瘤治疗的效果， 降血脂明显的特点。 具体实施方式 0035 下属实例用来说明本发明的技术方案的具体实施方式， 但不用于限制本发明的保 护范围。 0036 实施例 l 0037 处方用量 二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE)200mg 式 I 化合物100mg 乙醚3mL 绞股蓝皂苷20mg 说 明 书 CN 103816207 A 7 5/11 页。
27、 8 磷酸盐缓冲液 (pH=7.0)15mL 0038 工艺 0039 (1) 原料的选取 ： 按上述处方取磷酸盐缓冲液和绞股蓝皂苷， 将绞股蓝皂苷溶解 于磷酸盐缓冲液中， 备用 ； 0040 (2) 绞股蓝皂苷脂质体的制备 ： 按上述处方取二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、 式 I 化合物 和乙醚， 混合均匀， 然后旋转蒸发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部， 向瓶中加入 含绞股蓝皂苷的磷酸盐缓冲液， 加入玻璃珠， 在 60下旋转振荡 30min 后， 放置 2h 充分水 合， 即得。 0041 实施例 2 0042 处方用量 绞股蓝皂苷20mg 卵磷脂200mg 式 I 化合物50mg 乙醇10mL。
28、 磷酸盐缓冲液 (pH=6.8)10mL 0043 工艺 0044 (1) 油相的制备 ： 按上述处方取绞股蓝皂苷、 卵磷脂、 式 I 化合物、 乙醇， 混合均匀， 作为油相 ； 0045 (2) 水相的制备 ： 按上述处方取磷酸盐缓冲液作为水相 ； 0046 (3) 脂质体的制备 ： 在恒温搅拌状态下， 将油相用针头匀速注入到温度为 45的 水相中， 恒温搅拌 2h 除乙醇， 即得。 0047 实施例 3 0048 处方用量 绞股蓝皂苷200mg 磷脂酰丝氨酸200mg 式 I 化合物50mg 二氯甲烷50mL 磷酸盐缓冲液 (pH=8.0)40mL 0049 工艺 0050 (1) 按上述。
29、处方取磷脂酰丝氨酸 ： 式 I 化合物 ： 二氯甲烷 =200mg ： 50mg ： 50mL 制备 油相， 将油相置于圆底烧瓶中， 旋转蒸去二氯甲烷 ； 0051 (2)200mg 绞股蓝皂苷溶于 20mL 磷酸盐缓冲液 (pH=8.0) 中， 作为水相 ； 0052 (3) 油相中加入 20mL 含绞股蓝皂苷 200mg 的磷酸盐缓冲液 (pH=8.0)， 冰浴下， 探 头超声 10min， 形成均匀的乳剂 ； 0053 (4) 旋蒸除去有机相， 形成胶态后继续加入磷酸盐缓冲液 20mL， 继续减压蒸发 0.5h， 探头超声 10min， 即得。 0054 实施例 4 0055 处方用量 。
30、磷脂酰胆碱200mg 式 I 化合物120mg 说 明 书 CN 103816207 A 8 6/11 页 9 乙醚4mL 绞股蓝皂苷30mg 磷酸盐缓冲液 (pH=7.0)20mL 0056 工艺 0057 (1) 原料的选取 ： 按上述处方取磷酸盐缓冲液和绞股蓝皂苷， 将绞股蓝皂苷溶解 于磷酸盐缓冲液中， 备用 ； 0058 (2) 绞股蓝皂苷脂质体的制备 ： 按上述处方取磷脂酰胆碱、 式 I 化合物和乙醚， 混 合均匀， 然后旋转蒸发使其成均匀类脂薄膜覆盖在梨形瓶内底部， 向瓶中加入含绞股蓝皂 苷的磷酸盐缓冲液， 加入玻璃珠， 在 600下旋转振荡 30min 后， 放置 2h 充分水合。
31、， 即得。 0059 实施例 5 0060 处方用量 绞股蓝皂苷100mg 卵磷脂1000mg 式 I 化合物300mg 乙醇50mL 磷酸盐缓冲液 (pH=6.8)50mL 0061 工艺 0062 (1) 油相的制备 ： 按上述处方取绞股蓝皂苷、 卵磷脂、 式 I 化合物、 乙醇， 混合均匀， 作为油相 ； 0063 (2) 水相的制备 ： 按上述处方取磷酸盐缓冲液作为水相 ； 0064 (3) 脂质体的制备 ： 在恒温搅拌状态下， 将油相用针头匀速注入到温度为 45的 水相中， 恒温搅拌 2h 除乙醇， 即得。 0065 实施例 6 0066 处方用量 绞股蓝皂苷200mg 磷脂酰甘油2。
32、00mg 式 I 化合物50mg 二氯甲烷50mL 磷酸盐缓冲 液 (pH=8.0) 40mL 0067 0068 工艺 0069 (1) 按上述处方取磷脂酰甘油 ： 式 I 化合物 ： 二氯甲烷 =200mg ： 50mg ： 50mL 制备油 相， 将油相置于圆底烧瓶中， 旋转蒸去二氯甲烷 ； 0070 (2)200mg 绞股蓝皂苷溶于 20mL 磷酸盐缓冲液 (pH=8.0) 中， 作为水相 ； 0071 (3) 油相中加入 20mL 含绞股蓝皂苷 200mg 的磷酸盐缓冲液 (pH=8.0)， 冰浴下， 探头超声 10min， 形成均匀的乳剂 ； 0072 (4) 旋蒸除去有机相， 形。
33、成胶态后继续加入磷酸盐缓冲液 20mL， 继续减压蒸发 0.5h， 探头超声 10min， 即得。 0073 包封率的测定 0074 精确吸取制备好的绞股蓝皂苷长循环脂质体溶液 4mL， 16000Rmin-1高速离心 说 明 书 CN 103816207 A 9 7/11 页 10 15min。吸取上清液， 用 pH 为 7.0 的 PBS 缓冲液定容到 10mL 容量瓶中。取 O， 1000L 上述 溶液分别置于具塞的试管中， 各精密加入 5香草醛 - 冰醋酸与高氯酸混合液 2mL(2 ： 8)， 摇匀， 密塞， 置 60水浴中加热 15min， 立即用流水冷却至室温， 各精密加入冰醋酸 。
34、10mL， 摇 匀， 在555nn处用紫外法测得吸光度。 另取离心后的沉淀， 溶于10的Trition X-100乙醇 溶液(0.5mL)中破乳， 用乙醇定容到10mL， 摇匀。 分别取0、 1000L破乳溶液置于具塞试管 中， 同理加入显色剂， 测吸光度。根据标准曲线， 计算包封率。 0075 样品包封率 ( ) 实施例 1 53.2 实施例 2 91.9 实施例 3 48.4 实施例 4 62.5 实施例 5 91.4 实施例 6 47.9 0076 粒径、 Zeta 电位测定 0077 取实施例中的绞股蓝皂苷长循环脂质体及普通磷脂修饰的绞股蓝皂苷长循环脂 质体溶液， 激光粒径测定仪测定其。
35、粒径及其 Zeta 电位。 0078 0079 稳定性试验 ： 0080 (1) 泄漏率试验 ： 本发明中的实施例 1 中的绞股蓝皂苷长循环脂质体与普通磷脂 修饰的长循环脂质体制剂放在不同 pH 值的磷酸缓冲液中 (pH3， 4， 5， 6， 7， 8， 9， 10)， 脂质体 中残留的皂苷量 ( ) 于不同天数后进行测定 (0， 7， 14， 21， 28， 35， 42， 49， 56， 63 天 )。 0081 说 明 书 CN 103816207 A 10 8/11 页 11 0082 A ： 表示本发明中的含式 I 化合物的实施例 l 中的绞股蓝皂苷长循环脂质体。 0083 B ： 。
36、表示普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000) 修饰的 绞股蓝皂苷长循环脂质 体。 0084 (2) 氧化稳定性试验 ： 本发明中的绞股蓝皂苷长循环脂质体与普通磷脂修饰的长 循环脂质体制剂放在 25中， 放置规定天数后用硫代巴比妥反应物法 (TBARS) 测定 (0， 7， 14， 21， 28， 35， 42， 49， 56， 63 天 ) 测定脂质体的氧化程度， 值越高表明氧化程度越严重。 0085 样品 AB 0 天0.26 0.42 7 天0.29 0.59 14 天 0.35 0.61 21 天 0.39 0.78 28 天 0.43 0.81 。
37、35 天 0.48 0.93 42 天 0.56 0.99 49 天 0.73 1.03 56 天 0.82 1.25 63 天 0.86 1.37 0086 A ： 表示本发明中的含式 I 化合物的实施例 l 中的绞股蓝皂苷长循环脂质体。 0087 B ： 表示普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000) 修饰的 绞股蓝皂苷长循环脂质体。 0088 根据本品的特点， 做了如下药动学试验和组织分布试验 ： 0089 药动学研究 0090 采用LC-MSMS， 以人参皂苷Rb1为对照， 同时测定大鼠不同时间段血液中人参皂 苷 Rbl的含量， 计算药动学参数。 。
38、0091 1) 给药与样品的采集 说 明 书 CN 103816207 A 11 9/11 页 12 0092 健康 Wistar 大鼠， 实验前 12h 禁食不禁水， 实验期间自由饮水， 实验 12h 后进食。 设高、 中、 低 3 个剂量组， 每个采血点有 6 只大鼠， 每只大鼠采血 1 次。给药后分别在不同时 间段眼眶后静脉丛取血， 置肝素化试管中， 离心， 分离血浆， 待测。 0093 2) 血浆样品处理 0094 取大鼠血浆样品， 加 1Mol L 的 Hcll00l 沉淀蛋白， 10000 转离心 10min， 取上 清液， 0.45m 微孔滤膜过滤， 进样 5l， 分析。 009。
39、5 3) 体内测定方法 0096 用大鼠空白血浆样品进样得到色谱图， 将人参皂苷 Rbl 对照品系列加入到空白 血， 依同法进行样品处理 ； 取大鼠给药后收集的血浆样品同法处理， 得到大鼠给药后血浆样 品色谱图， 分析。 0097 DAS 2.0 程序拟合结果表明， 本发明中的含式 I 化合物的绞股蓝皂苷长循环脂质 体和普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000) 修饰的绞股蓝皂苷 长循环脂质体后， 两种制剂在大鼠体内均符合二房室模型， 其平均药动学参数如下表所示。 0098 0099 A ： 表示本发明中的含式 I 化合物的实施例 1 中的绞股监皂甘长循环。
40、脂质体。 0100 B ： 表示普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 . 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000) 修饰的 绞股监皂甘长循环脂质体。 0101 * ： A 组与 B 组的药动学参数经 t 检验有显著性差异 (p0.05)。 0102 * ： A 组与 B 组的药动学参数经 t 检验有极显著性差异 (p0.01)。 0103 DAS 2.0 程序非房室模拟参数拟合结果表明， 经大鼠尾静脉两种长循环脂质体后， 本发明中的绞股蓝皂苷 AUC 明显大于普通磷脂修饰的长循环脂质体， 前者清除率明显低 于后者， MRT 分别为 3.352 和 1.856 小时， 半衰期长于后者， 是后者的 。
41、1.81 倍 ； AUCo-t 分 别为 387.826 和 159.830mgL-1min， 是后者的 2.426 倍， 如下表所示， 有极显著性意义 (p0.01)， 表明前者较后者有较长的血液中的消除半衰期， 其在体内的循环时间进一步延 长。 0104 参数单位AB MRTo t h3.3520.363*1.856O.133* AUCo t mg.L-1.h387.82623.974*1 59.83012.443* 0105 A ： 表示本发明中的含式 I 化合物的实施例 1 中的绞股蓝皂苷 K 循环脂质体。 0106 B ： 表示普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(D。
42、SPE-PEG2000) 修饰的 绞股监皂甘长循环脂质体。 0107 * ： A 组与 B 组的药动学参数经 t 检验有显著性差异 (p0.05)。 0108 * ： A 细与 B 组的约动学参数经 t 检验有极显著性差异 (p0.01)。 0109 根据本品的功能主治， 做了如下药效学试验 ： 说 明 书 CN 103816207 A 12 10/11 页 13 0110 (1) 抑瘤作用。将 45 只雄性荷瘤裸鼠按体重随机分为 3 组， 每组 15 只。腹腔内注 射无菌液体石蜡， 第 3 天腹腔内注射人 HepG2 肝癌细胞悬液适量。第 10 天， 对照组尾静脉 注射生理水， A组尾静脉注。
43、射本发明中的含式I化合物的实施例1中的绞股蓝皂苷长循环脂 质体， B 组尾静脉注射普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺一聚乙二醇 2000(DSPEPEG2000) 修饰的绞股蓝皂苷长循环脂质体， 均为每周 4 次。肿瘤种植后 8 周处死动物， 观察淋巴结、 肝、 脾、 腹膜、 肾、 肠系膜的转移情况， 剥离肿瘤称瘤重， 计算抑瘤率以判断其抑瘤作用。计 算公式如下 ： 0111 抑瘤率()=(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)对照组平均瘤重100。 0112 各组药物对小鼠肿瘤抑制率如下表所示， 结果显示， 本发明中的长循环脂质体具 有最强的肿瘤抑制作用， 抑制率可达 78左右。而普通长循环脂质体， 抑。
44、瘤率在 50左右。 在注射相同剂量的情况下， 本发明中的长循环脂质体肿瘤抑制率显著高于普通长循环脂质 体。 0113 组别瘤重 (g) 抑瘤率 ( ) 对照组 1.930.00 A0.4178.69 BO.9450.90 0114 A ： 表示本发明中的含式 I 化合物的实施例 1 中的绞股蓝皂苷长循环脂质体。 0115 B ： 表示普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000) 修饰的 绞股蓝皂苷长循环脂质体。 0116 (2) 降血脂作用将健康大鼠随机分成 6 组， 每组 10 只， 分别为正常组、 模型组、 卵 磷脂组、 - 谷甾醇组、 本发明中的含式 。
45、I 化合物的实施例 1 中的绞股蓝皂苷长循环脂质体 A 组、 普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000) 修饰的绞股蓝皂苷 长循环脂质体 B 组。其中， 正常组饲喂基础饲料， 模型组、 模型组、 卵磷脂组、 - 谷甾醇组、 A 组、 B 组。饲养四周后， 测小鼠血清总胆固醇 (T C)、 甘油三酯 (TAG)、 高密度脂蛋白 - 胆固 醇 (HDL-C)、 低密度脂蛋白 - 胆固醇 (LDL-C) 等指标。 0117 GroupTCTAGHDL-CLDL-CLDL-C HDL-C 正常组3.540.280.670.071.880.221.420.290.7。
46、80.23 模型组4.790.411.030.091.19O.163.410.242.900.36 卯磷脂组4.770.321.020.041.180.153.430.222.900.36 - 谷甾醇组4.720.341.010.071.200.133.420.232.850.32 A3.240.270.720.081.530.111.520.1l1.000.15 B3.97O.32O.850.081.320.132.450.321.870.30 0118 A ： 表示本发明中的含式 I 化合物的实施例 l 中的绞股蓝皂苷长循环脂质体。 0119 B ： 表示普通磷脂二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 - 。
47、聚乙二醇 2000(DSPE-PEG2000) 修饰的 绞股蓝皂苷长循环脂质体。 0120 实验结果表明本发明中的含式 I 化合物的绞股蓝皂苷长循环脂质体较普通磷脂 修饰的绞股蓝皂苷长循环脂质体有更好的血清胆固醇作用、 降甘油三酯作用。 LDL-C与心血 管病发作呈正相关， 而HDL-C则与心血管病的发作呈负相关， 结果表明发明中的含式I化合 物的绞股蓝皂苷长循环脂质体较普通磷脂修饰的绞股蓝皂苷长循环脂质体能更好的降低 说 明 书 CN 103816207 A 13 11/11 页 14 心血管病发病的机率。 0121 综上所述 ： 本发明是一种新型长循环脂质体能延长脂质体在体内的滞留时间， 使 药物更好的达到靶器官， 且 - 谷甾醇能降低血液中胆固醇的含量， 降低发生心脑血管疾 病的机率。不同 pH 条件下的稳定性和氧化稳定性也比普通长循环脂质体要好， 药效学研究 表明， 本发明的抑瘤作用显著强于普通长循环脂质体， 降血脂作用也较普通长循环脂质体 优越， 可以减少给药的总剂量， 制备方法简单。 说 明 书 CN 103816207 A 14 。