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1、(10)申请公布号 CN 103695411 A (43)申请公布日 2014.04.02 CN 103695411 A (21)申请号 201310720334.1 (22)申请日 2013.12.20 CGMCC No5115 2011.08.05 CGMCC No5116 2011.08.05 CGMCC No5117 2011.08.05 C12N 11/14(2006.01) C12N 11/02(2006.01) C02F 3/34(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/085(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (71)申请人。
2、 大连赛姆生物工程技术有限公司 地址 116620 辽宁省大连市经济技术开发区 双 D 港生命一路 58 号大连赛姆生物工 程技术有限公司 (72)发明人 徐永平 尤建嵩 李淑英 李纪彬 周俊龙 徐牧 马欣 高玉平 刘士茹 (74)专利代理机构 大连智高专利事务所 ( 特殊 普通合伙 ) 21235 代理人 胡景波 (54) 发明名称 菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参 养殖水质改良剂及其制法和用途 (57) 摘要 本发明公开了一种菌群存活繁殖适应性强的 混菌发酵法制海参养殖水质改良剂及其制法和 用途， 属于水产养殖及海洋微生物技术领域。本 发明针对海参的生理习性和养殖特点， 应用海洋 微。
3、生物技术， 由海参养殖环境中分离筛选的弯曲 芽孢杆菌 CGMCC No.5115、 枯草芽孢杆菌 CGMCC No.5116和蜡状芽孢杆菌CGMCC No.5117所组成， 以玉米粉和豆粕粉为主要培养原料， 28-37发酵 24-48h， 再以凹凸棒石、 海泡石和稻壳作为吸附和 悬浮复合载体， 加工制得菌群存活繁殖适应性强 的混菌发酵法制海参养殖水质改良剂。本产品对 水体环境耐受性强， 漂浮性、 悬浮性以及沉浮可控 性好， 有利于海水养殖水体三维立体的净化效果， 避免水体酸化和臭底， 有效抑制病原微生物， 预防 海参病害的发生， 提高海参养殖的产量和质量。 (83)生物保藏信息 (51)Int。
4、.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103695411 A CN 103695411 A 1/1 页 2 1. 一种菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖水质改良剂的制备方法， 包括 以下操作步骤 ： 制备益生菌原液 将在 LB 琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌 YB-1CGMCC No.5116、 蜡状芽孢 杆菌 YB-2CGMCC No.5117 和弯曲芽孢杆菌 XH-1CGMCC No.5115， 分别加入 2116E 培养基， pH7.07.5， 333。
5、7震荡培养1216h， 再以1:1:1的体积比混合， 制备成益生菌原液 ； 液态发酵培养 向在密闭式发酵反应器中加入发酵液， 并按 0.1 1% 的体积比加入营养物质， 再将步 骤制备的益生菌原液， 按3-5%的体积比接种， 进行发酵， 压力为0.10.25Mpa， 37发酵 24h， 制得发酵产物 ； 喷雾干燥处理 上述步骤所得的发酵产物喷雾到吸附和悬浮复合载体， 干燥处理 ； 其中， 步骤所说的海水 LB 琼脂培养基和 2116E 培养基， 均为 分子克隆实验指南 中 培养基配方 ； 步骤所说的营养物质由玉米粉 ： 豆粕粉 ： 海水按 （1.5 3） ：（0.5-1.5） ： 100 的重。
6、量 比组成 ； 步骤所述的复合载体的组成为 ： 凹凸棒石粉、 海泡石粉和稻壳按 2:2:1 的体积比混 合。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤所述的复合载体， 凹凸棒石粉 和海泡石粉为 150 200 目。 3. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于， 步骤中菌悬液的菌体浓度均为 1108cfu/ml。 4. 根据权利要求 1、 2 或 3 中任一项所述的制备方法， 其特征在于还包括 ： 向步骤制 得的产物中加入复合载体， 混合并使菌含量的终浓度为约为 108-1010cfu/g。 5. 根据权利要求 4 所述的制备方法， 其特征在于， 向步骤制得的产物中。
7、加入复合载 体的重量比为 1 ： 1 1000。 6.根据权利要求1、 2或5中任一项所述的制备方法， 其特征在于， 步骤中发酵产物喷 雾干燥到复合载体的方法为 ： 发酵培养液与载体重量比为 1 ： 1 4， 干燥时间为 12 24h， 产物水份含量不高于 5%。 7. 如权利要求 1 所述的方法制备的菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖 水质改良剂。 8. 如权利要求 7 所述的菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖水质改良剂 在海参养殖方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 103695411 A 2 1/5 页 3 菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖水质改良 剂及其制法。
8、和用途 技术领域 0001 本发明于水产养殖及海洋微生物技术领域， 具体涉及一种菌群存活繁殖适应性强 的混菌发酵法制海参养殖水质改良剂及其制法和用途。 背景技术 0002 海水是海参等海珍品赖以生存的基本环境条件， 俗话说 ：“三分养鱼， 七分养水” 。 水质的好坏直接影响到海参的生长状况和养殖户的经济效益。随着经济和科学的发展， 人 们对海参的需求日益增加， 在天然捕捞不能满足市场需求的情况下， 海参养殖业已由传统 的粗放型经营、 资源依赖型养殖方式转化为现在的集约化和工厂化的养殖方式， 刺参养殖 已成为中国水产养殖业的支柱产业之一。 然而， 随着刺参集约化和规模化养殖迅速的发展， 出现了一。
9、些严重问题， 制约了其产业的发展， 比如残存饵料以及排泄物和动物死体在水体 中沉积， 分解生成很多的有害物质， 恶化了水质， 病原菌大量繁殖， 致使海参产生强烈的应 激反应， 出现了摇头不食、 口肿、 身体收缩僵直、 排脏、 体表溃疡等现象， 最后体壁大面积腐 烂而死。 为了对抗海参病疫， 长期和大量滥用抗生素以及化学合成药物， 不仅导致了海参对 病原微生物的易感性以及细菌病原微生物等的耐药性， 还会使抗生素检测超标， 并造成整 个生态环境的污染， 严重影响了节约减排、 食品安全和阻碍了无公害刺参养殖业的可持续 发展。 0003 凹凸棒石粘土在矿物学分类上隶属于海泡石族， 为含水的层链状镁质硅。
10、酸盐， 具 有独特的层链状结构特征， 其理想的化学分子式为 ： Mg5Si8020(OH)2(OH2)24H2O。凹凸棒石由 于具有呈针状、 纤维状集合体的晶体结构， 其比表面积大、 化学稳定性好、 吸附能力强等特 点， 它在吸附重金属离子、 有机污染物、 放射性元素等方面表现出良好的性能， 在水处理方 面具有良好的应用前景。 0004 海泡石是一种富镁纤维状硅酸盐粘土矿物， 具有非金属矿物中最大的比表面积 （最高可达 800m2/g） 和独特的内容孔道结构， 是公认的吸附能力最强的粘土矿物。故有极 强的吸附性、 脱色性、 分散性、 热稳定性、 良好的抗盐性和阳离子交换性， 无论是在常温或高 。
11、温、 高压条件下， 在海水盐水中其结构均不发生变化。由于海泡石具有比表面积大的特性， 使其具有强大胶体吸附和离子交换吸附能力， 在水处理过程中， 不但能吸附颗粒态和胶体 态的污染物质， 还能有效地降低水体浊度和去除水体富营养化的主要污染物氨氮与 COD， 以 及 Hg2+、 Pb2+、 Cr6+、 Cd2+、 Cu2+等重金属离子等有害物质， 在水处理载体应用方面具有良好的 市场前景。 0005 稻壳是稻谷外面的一层壳， 由内颖及较大的外颖组成。 稻壳长5-10mm、 2.5-5mm、 厚 23-30 微米， 其色泽一般呈金黄色， 被粉碎后， 堆积密度可达 384-400kg/m3， 作为本产。
12、品的辅 料， 可以增加产品的漂浮性、 悬浮性以及沉浮可控性， 有利于海水养殖水体三维立体的净化 效果。 0006 水产微生态制剂， 是利用水产动物体内或养殖水体中的有益微生物经特殊加工工 说 明 书 CN 103695411 A 3 2/5 页 4 艺而形成的活菌制剂， 具有氨氧化、 硝化、 反硝化、 解磷、 除硫和脱氮等作用， 有效地降低水 中的 COD、 氨氮、 亚硝酸氮和硫化物的浓度， 从而有效地改善水质。目前， 应用于水产养殖的 微生态水质调节剂， 只限于单纯菌剂或载体化菌剂， 前者使用中存在菌群存活繁殖适应性 差和数量减少等劣势， 后者基本是大部分是沉在池底， 对中上层水体净化率低，。
13、 切池底环境 溶解氧低， 不利于微生态菌剂的繁殖。 所以， 急需一种微生态制剂既能三维立体全方位能去 除海参养殖水体中 COD、 氨氮、 亚硝酸氮和硫化物， 又能除去水体中重金属离子， 并抑制有害 微生物的繁殖， 达到同时一次完全净化养殖水体的水质修复剂。 发明内容 0007 本发明为了要解决现有技术中养殖水质污染严重、 病害频发、 海参高死亡率、 海参 体内重金属、 化学残留和抗生素残留超标等现状， 而发明一种菌群存活繁殖适应性强的混 菌发酵法制海参养殖水质改良剂及其制法和用途。本菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵 法制海参养殖水质改良剂主要由芽孢杆菌混合组成， 由海参养殖环境中分离并筛选的枯草。
14、 芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)YB-1CGMCC No.5116、 蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus) YB-2CGMCC No.5117 和弯曲芽孢杆菌 (Bacillus flexus)XH-1CGMCC No.5115， 以玉米粉和 豆粕粉为主要发酵培养基， 以凹凸棒石、 海泡石和稻壳作为吸附和悬浮载体， 加工成固体粉 剂。本发明中涉及的微生态制剂， 于 2011 年 08 月 05 号送到中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保藏 ( 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)， 地址为北京市朝阳区北 辰西路 1 号院 3 号。 0008 本。
15、发明的主要方面是 ： 一种菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖水质 改良剂的制备方法， 包括以下操作步骤 ： 0009 制备益生菌原液 0010 将在 LB 琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌 YB-1CGMCC No.5116、 蜡状芽 孢杆菌 YB-2CGMCC No.5117 和弯曲芽孢杆菌 XH-1CGMCC No.5115， 分别加入 2116E 培养基， pH7.07.5， 3337震荡培养1216h， 再以1:1:1的体积比混合， 制备成益生菌原液 ； 0011 液态发酵培养 0012 向在密闭式发酵反应器中加入发酵液， 并按 0.1 1% 的体积比加入营养物质， 再 。
16、将步骤制备的益生菌原液， 按3-5%的体积比接种， 进行发酵， 压力为0.10.25Mpa， 37 发酵 24h， 制得发酵产物 ； 0013 喷雾干燥处理 0014 上述步骤所得的发酵产物喷雾到吸附载体， 干燥处理 ； 0015 其中， 步骤所说的海水 LB 琼脂培养基和 2116E 培养基， 均为 分子克隆实验指 南 中培养基配方 ； 0016 步骤所说的营养物质由玉米粉 ： 豆粕粉 ： 海水按 （1.5 3） ：（0.5-1.5） ： 100 的 重量比组成 ； 0017 步骤所述的吸附载体的组成为 ： 凹凸棒石粉、 海泡石粉和稻壳 2:2:1 的体积比 混合。 0018 在优化条件下 。
17、： 上述的制备方法中， 步骤中菌悬液的菌体浓度均约为 1108cfu/ml。 说 明 书 CN 103695411 A 4 3/5 页 5 0019 在优化条件下 ： 上述的制备方法中， 步骤所述的吸附载体中， 凹凸棒石粉和海 泡石粉为 150 200 目 ； 终产物吸附载体和益生菌混合物， 载菌含量的终浓度约为 108 1010cfu/g。 0020 在优化条件下 ： 上述的制备方法中， 向步骤制得的产物中加入吸附载体的重量 比为 1 ： 1 1000。 0021 在优化条件下 ： 上述的制备方法中， 步骤中发酵产物喷雾干燥到吸附载体的方 法为 ： 发酵培养液与载体重量比为1 ： 14， 干。
18、燥时间为1224h， 产物水份含量不高于5%。 0022 本发明的另外一方面在于， 利用上述的方法制备菌群存活繁殖适应性强的混菌发 酵法制海参养殖水质改良剂产品。 0023 本发明的另外一方面在于， 利用上述的菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海 参养殖水质改良剂在海参养殖方面的应用。 0024 本发明的菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖水质改良剂环境耐受 性强， 漂浮性、 悬浮性以及沉浮可控性好， 对海参的养殖水体三维立体的净化效果显著， 尤 其在海参的育苗期和养成期定期泼洒该菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖 水质改良剂， 可以快速去除养殖水体中的重金属离子和降解氨氮、 亚。
19、硝酸盐、 硫化氢等有害 物质， 避免水体酸化和臭底， 有效抑制病原菌， 减轻环境对海参的应激反应， 有效预防海参 病害的发生， 提高海参养殖的质量和产量。 具体实施方式 0025 以下结合技术方案详细叙述本发明的实施例。 0026 实施例中所用原料均由常规方法制备或由商业途径获得。 0027 LB 琼脂斜面培养基 : 其组成每升中含 ： 胰酶解蛋白胨 5g， 酵母膏 1g， 海水晶 33g， 磷酸高铁 0.1g， 琼脂 15g， 1000mL 水， pH7.6。蛋白胨和酵母膏购于英国 Oxoid 公司， 琼脂 粉购于北京奥博星生物技术有限责任公司， 其他原料均购于上海生工生物工程股份有限公 司。
20、。 0028 2216E 液体培养基 : 其组成每升中含 ： 胰酶解蛋白胨 5g， 酵母膏 1g， 磷酸高铁 0.1g， 陈海水 1000mL， pH7.6。蛋白胨和酵母膏购于英国 Oxoid 公司， 其他原料均购于上海 生工生物工程股份有限公司。 0029 玉米粉和豆粕粉， 均为 100-200 目， 购于山东万得福实业集团有限公司。 0030 稻壳， 购于大连赛姆集团。 0031 凹凸棒石粉， 购于甘肃省靖远县昊地工贸有限责任公司， 150-200 目。 0032 海泡石粉， 购于河北省行唐县鑫磊矿物粉体加工厂， 150-200 目。 0033 本发明实施例中涉及的微生态制剂包括 ： 由海。
21、参养殖环境中分离筛选的芽孢杆菌 包括 ： 枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)YB-1CGMCC No.5116、 蜡状芽孢杆菌 (Bacillus cereus)YB-2CGMCC No.5117 和弯曲芽孢杆菌 (Bacillus flexus)XH-1CGMCC No.5115。 0034 三株菌株保藏于 2011 年 08 月 05 号送到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心 ( 中国科学院微生物研究所， 邮编 100101)， 地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。 0035 下面通过实例进一步详细描述本发明。 说 明 书 CN 103695411 A。
22、 5 4/5 页 6 0036 实施例 1 ： 0037 1. 制备益生菌原液 0038 将在 LB 琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌 YB-1CGMCCNo.5116、 蜡状芽 孢杆菌 YB-2CGMCC No.5117 和弯曲芽孢杆菌 XH-1CGMCC No.5115， 分别加入 2116E 培养基， pH7.0 7.5， 37震荡培养 12 16h， 再以 1:1:1 的体积比混合， 制备成益生菌原液， 菌体 浓度约为 1108cfu/ml。 0039 2. 液态发酵培养 0040 向在密闭式发酵反应器中加入发酵液， 并按 0.1 1% 的体积比加入营养物质， 再 将步骤制备的益。
23、生菌原液， 按3-5%的体积比接种， 进行发酵， 压力为0.10.25Mpa， 37 发酵 24h， 制得发酵产物 ； 0041 上述的营养物质由玉米粉 ： 豆粕粉 ： 海水按 （1.5 3） ：（0.5-1.5） ： 100 的重量比 组成。 0042 3. 喷雾干燥处理 0043 复合物吸附载体由 150-200 目的凹凸棒石粉、 海泡石粉和稻壳按体积比为 1:1:1 混合配制 ； 0044 上述步骤 2 所得的发酵产物喷雾干燥到上述吸附载体中， 发酵产物与载体重量比 为 1 ： 4， 干燥时间为 24h， 产物水份含量不高于 5%， 制得菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵 法制海参养殖水质改。
24、良剂。 0045 实施例 2 0046 1. 制备益生菌原液 0047 将在 LB 琼脂斜面培养基上生长良好的枯草芽孢杆菌 YB-1CGMCC No.5116、 蜡状芽 孢杆菌 YB-2CGMCC No.5117 和弯曲芽孢杆菌 XH-1CGMCC No.5115， 分别加入 2116E 培养基， pH7.0 7.5， 37震荡培养 12 16h， 再以 1:1:1 的体积比混合， 制备成益生菌原液， 菌体 浓度约为 1108cfu/ml。 0048 2. 液态发酵培养 0049 向在密闭式发酵反应器中加入发酵液， 并按 0.1 1% 的体积比加入营养物质， 再 将步骤制备的益生菌原液， 按3。
25、-5%的体积比接种， 进行发酵， 压力为0.10.25Mpa， 37 发酵 24h， 制得发酵产物 ； 0050 上述的营养物质由玉米粉 ： 豆粕粉 ： 海水按 （1.5 3） ：（0.5-1.5） ： 100 的重量比 组成。 0051 3. 喷雾干燥处理 0052 吸附载体由 150-200 目的凹凸棒石粉、 海泡石粉和稻壳按体积比为 2:2:1 混合配 制 ； 0053 上述步骤 2 所得的发酵产物喷雾干燥到上述吸附载体中， 发酵产物与载体重量比 为 1 ： 4， 干燥时间为 24h， 产物水份含量不高于 5%， 制得菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵 法制海参养殖水质改良剂。 0054 使。
26、用效果 0055 选取 3 处条件相同的海参养殖圈， 平均水深 1.5-2m， 参苗规格 30-50 头 /500g， 密 度在 9-10 头 /m2。 说 明 书 CN 103695411 A 6 5/5 页 7 0056 1 号圈为对照组 （未使用菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖水质改 良剂） ， 2、 3 号圈为实验组 （使用菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖水质改良 剂） ； 实验组除了定期泼洒实施例 1、 2 所述的菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养 殖水质改良剂之外， 饲喂方式和管理方法与对照组一样。 0057 实验周期为 2013 年 9 月到 10 月，。
27、 大约 45 天， 实验组每隔 3 天泼洒 1 次， 泼洒量为 5g/m3。 0058 实验期间， 定期检测水质， 观察海参摄食情况， 每隔 15 天下水摸探， 测量海参体 重。盐度为 35-38， 水温为 16-23， pH 为 7.6-8.5， 溶解氧不低于 4mg/L。 0059 1. 使用本实施例 1、 2 后第 45 天的海参养殖圈的水质指标比较结果 0060 0061 2. 使用本实施例 1、 2 后 45 天对海参生长和免疫机能的影响 0062 头数 /m2平均增重量 (g)呼吸爆发活力吞噬率 (%) 对照组7.64.850.1320.06236.850.43 实施例 18.37.680.4280.03643.060.79 实施例 28.912.650.6730.03549.870.63 0063 结果表明 ： 本发明的菌群存活繁殖适应性强的混菌发酵法制海参养殖水质改良 剂， 对海参养殖圈内的水质有明显的净化效果， 可以大幅降低氨氮、 亚硝酸盐、 硫化氢等有 害物质的含量， 稳定水体 pH， 有效抑制病原菌， 提高海参的免疫力， 预防海参病害的发生， 提 高养殖海参的质量和产量。 说 明 书 CN 103695411 A 7 。