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1、(10)申请公布号 CN 103837630 A (43)申请公布日 2014.06.04 CN 103837630 A (21)申请号 201410012726.7 (22)申请日 2014.01.10 G01N 30/88(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 杨京霞 地址 236000 安徽省阜阳市颍州区临泉路 288 号 477 户 (72)发明人 杨京霞 黄银生 兰伟 王中亮 杨一红 屈长青 (74)专利代理机构 安徽信拓律师事务所 34117 代理人 鞠翔 (54) 发明名称 一种病人血液中百草枯的快速检测方法 (57) 摘要 一种病人血液中百草。
2、枯的快速检测方法， 1）百草枯高效液相色谱法的建立 ： HPLC 条件 ： 高效液相色谱仪， 色谱柱 shim-pack:vp-ODS 柱 （4.6mm*250mm,5m） ， 流动相 ： 乙腈 -0.02mol/L 辛烷基磺酸钠， 辛烷基磺酸钠用 0.26moL/L 的磷 酸调 pH 值为 2.5 ； 流速 ： 1.0mLmin-1； 柱温 25； 检测波长 254nm ； 2） PQ 含药血清的制备 ： 对照品 的制备 ： 精密吸取健康人血清 200L， 加入已知 浓度的 PQ 水溶液 100L， 加入乙腈 400L 混 漩， 离心 10min， 取上清液 , 离心 10min， 取上清液。
3、 进行 HPLC 分析 ； 3）样品的制备 ： 精密吸取病人 血清 200L， 加入乙腈 400L 混漩 1min， 离心 10min， 取上清液,离心10min， 取上清液进行HPLC 分析 ； 4） 空白溶液的制备 ： 精密吸取健康人血清 200L， 加入蒸馏水 100L， 加入乙腈 400L 混 漩 1min， 离心 10min， 取上清液 , 离心 10min， 取上 清液进行 HPLC 分析。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 (10)申请公布号 。
4、CN 103837630 A CN 103837630 A 1/1 页 2 1. 一种病人血液中百草枯的快速检测方法， 其特征在于 ： 包括以下方法步骤 1） 百草枯高效液相色谱法的建立 条件 ： 高效液相色谱仪， 色谱柱 shim-pack:vp-ODS 柱 4.6mm*250mm， 5m ； 流动相 ： 乙 腈 -0.02mol/L 辛烷基磺酸钠， 辛烷基磺酸钠用 0.26moL/L 的磷酸调 pH 值为 2.5 ； 流速 ： 1.0mLmin-1； 柱温 25 ； 检测波长 254nm ； 2） PQ 含药血清的制备 对照品的制备 精密吸取健康人血清 200L， 加入已知浓度的 PQ 水。
5、溶液 100L， 加入乙腈 400L 混 漩 1min， 3500r/min-1离心 10min， 取上清液 ,10000r/min-1离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析 ； 得对照品峰面积 Ar ； 样品的制备 精密吸取病人血清 200L， 加入乙腈 400L 混漩 1min， 3500r/min-1离心 10min， 取上 清液 ,10000r/min-1离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析 ； 得样品峰面积 Ax ； 空白血清的制备 精密吸取健康人血清 200L， 加入蒸馏水 100L， 加入乙腈 400L 混漩 1min， 3500r/ min-1离心 10m。
6、in， 取上清液 ,10000r/min-1离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析 ； 3） PQ 标准曲线 用空白血清分别配制 0.1， 0.2， 0.5， 1， 5， 10， 25， 50 和 100g/ml 的百草枯血清标准系 列液 , 分装后于 4保存备用 , 在上述色谱条件下进样分析， 以百草枯浓度 （x） 为横坐标 , 百草枯面积 （y） 为纵坐标 , 进行线性回归， 得 PQ 的回归方程 (y=ax+b)。 根据计算公式 ： Cx=Cr*Ax/Ar， 其中 ： Cx 为样品浓度 Cr 为对照品浓度 Ax 为样品峰面积 Ar 为对照峰品面积 根据上述公式进行计算， 得到病。
7、人血样中百草枯的浓度， 或者根据 PQ 标准曲线， 将 Ax 代入曲线， 也可得到病人血样中百草枯的浓度。 权 利 要 求 书 CN 103837630 A 2 1/4 页 3 一种病人血液中百草枯的快速检测方法 技术领域 0001 本发明涉及医学技术领域， 具体涉及一种病人血液中百草枯的快速检测方法。 背景技术 0002 我国是世界上农药生产和消费的大国， 由于大量的使用农药， 农药中毒现象也 越来越多。百草枯 （paraquat， PQ） ， 又名克无踪、 对草快， 化学名称为 1， 1 - 二甲基 -4， 4 - 联吡啶二氯化物， 分子量 257.2， 为中等毒性的有机杂环类接触性脱叶剂。
8、及除草剂， 对 人畜有较强的毒性， 可经皮肤、 呼吸道、 消化道吸收造成急性中毒， 由于目前尚无特效解毒 剂， PQ 中毒后死亡率较高， 其血浆浓度与死亡率密切相关。临床上， 口服百草枯中毒病情可 分为以下三型 ：（1） 轻度 ： 口服百草枯 20mg/kg， 患者仅有轻度胃肠道症状， 一般能完全恢 复， 没有明显的后遗症。（2） 重度 ： 服毒量20-40mg/kg， 仅有部分患者能存活。 一般病程 ： 1-4 天内出现肾功能损害、 肝损害、 血压下降、 心动过速等症状和体征， 1-2 周内出现咳嗽、 咳血、 胸腔积液、 肺纤维化， 2-3 周后进一步发展为呼吸窘迫综合征而死亡。 （3） 极。
9、重度 ： 服毒量 40mg/kg， 几天内出现肝、 肾功能衰竭、 消化道溃疡、 胰腺炎、 心肌炎、 低血压、 昏迷、 抽搐， 1-4 天内死于多器官功能衰竭。由于百草枯中毒机制尚不完全明确， 而且缺乏有效特异的治疗 手段， 其中毒可导致极高的病死率， 给急诊医疗工作者带来了巨大的挑战。因此， 了解百草 枯中毒预后相关因素对于指导临床治疗有重要意义， 在过去 30 年中， 许多关于百草枯中毒 预后的动物实验和临床研究相继开展， 但多数实验均未找到一个评价百草枯中毒预后的早 期、 有效、 实用的特异性指标。 0003 1966年英国医学家Bullivant首先描述了2例PQ意外中毒死亡事件， 随后。
10、世界各 地相继报道了 PQ 中毒病例并对 PQ 毒性进行了深入的研究。虽然各国学者对此作了广泛深 入的研究， 但至今仍未完全明了 PQ 中毒机制， 亦无有效拮抗药物， 人口服致死量约为 3.0g， 因而死亡率达 90%。若在摄入后 6h、 8h、 24h, 血液中 PQ 浓度超过 2mgL-1、 1.2mgL-1、 0.2mgL-1, 则难以存活。国外早在上世纪 70 年代， 就开始对百草枯残留的检测方法进行 研究， 近年来在这方面的研究工作取得了较快的进展。高灵敏度的仪器分析法和快速有效 的免疫分析法正逐渐被应用于百草枯残留的检测， 其中最广泛的当属高效液相色谱仪。国 内虽已有关于血气分析与。
11、百草枯中毒预后相关的研究报道， 目前临床上常通过连二亚硫酸 钠间接测定中毒者血中百草枯浓度。但对血液中百草枯浓度测要求较高， 国内多数医院尚 无法开展该检查。血浆百草枯浓度 0.5 2 小时即可达到峰值， 而后迅速分布到周围组织， 故中毒早期监测其浓度意义更大。 0004 随着 PQ 在我国生产和使用量的增加， 急性 PQ 中毒人数也逐年增加。中毒致死患 者约 90% 是自杀性口服所致， 而且主要发生在农村。PQ 口服病死率达 60%-90%， 且存活者中 绝大多数存在肺纤维化， 预后极差， 基层地区由于缺乏对 PQ 中毒认识病死率更高。PQ 中毒 已成为严重影响我国人民群众健康的急危重症， 。
12、超越毒鼠强和有机磷中毒成为致死性最高 的农药中毒事件。因此， 建立快速、 灵敏、 准确的检测技术是目前迫切需要解决的问题。 说 明 书 CN 103837630 A 3 2/4 页 4 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题在于提供一种病人血液中百草枯的快速检测方法， 主 要采用高效液相色谱法对病人血液中百草枯的浓度进行含量测定， 并研究一种快速、 准确 的制备含药血清的方法， 建立安全、 有效、 快速的百草枯检测方法。 0006 本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现 ： 0007 一种病人血液中百草枯的快速检测方法 0008 1） 百草枯高效液相色谱 （HPLC） 法的建立 。
13、0009 高效液相色谱法条件 ： 岛津 LC-20AT 高效液相色谱仪， 色谱柱 shim-pack:vp-ODS （其中 shim-pack:vp-ODS 所代表的的是柱子的型号， 是岛津公司的一款反相高效液相色谱 柱） ， 柱 ： 4.6mm*250mm， 5m， 流动相 ： 乙腈 -0.02mol/L 辛烷基磺酸钠 （40:60） ， 辛烷基磺酸 钠用 0.26moL/L 的磷酸调 pH 值为 2.5 ； 流速 ： 1.0mLmin-1； 柱温 25 ； 检测波长 254nm ； 0010 2） PQ 含药血清的制备 0011 对照品的制备 0012 精密吸取健康人血清200L， 加入已。
14、知浓度的PQ水溶液100L， 加入乙腈400L 混漩1min， 3500r/min-1离心10min， 取上清液,10000r/min-1离心10min， 取上清液进行HPLC 分析， 得对照品峰面积 Ar ； 0013 样品的制备 0014 精密吸取病人血清 200L， 加入乙腈 400L 混漩 1min， 3500r/min-1离心 10min， 取上清液 ,10000r/min-1离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析， 得样品峰面积 Ax ； 0015 空白血清的制备 0016 精密吸取健康人血清 200L， 加入蒸馏水 100L， 加入乙腈 400L 混漩 1min， 35。
15、00r/min-1离心 10min， 取上清液 ,10000r/min-1离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析 ； 0017 3） PQ 标准曲线 0018 用空白血清分别配制 0.1， 0.2， 0.5， 1， 5， 10， 25， 50 和 100g/ml 的百草枯血清标 准系列液 , 分装后于 4保存备用 , 在上述色谱条件下进样分析， 以百草枯浓度 （x） 为横坐 标 , 百草枯面积 （y） 为纵坐标 , 进行线性回归， 得 PQ 的回归方程 (y=ax+b)。 0019 根据计算公式 ： Cx=Cr*Ax/Ar， 0020 其中 ： Cx 为样品浓度 0021 Cr 为对。
16、照品浓度 0022 Ax 为样品峰面积 0023 Ar 为对照峰品面积 0024 根据上述公式进行计算， 得到病人血样中百草枯的浓度， 或者根据 PQ 标准曲线， 将 Ax 代入曲线， 也可得到病人血样中百草枯的浓度。 0025 本发明的有益效果是 ： 0026 1. 创新含药血清的制备方法， 改变传统繁琐的操作工艺， 缩短血样制备时间， 以更 大限度的来为病人增加救治时间， 挽救病人生命。 0027 2. 以更加创新的方法缩短样品分析时间， 使整个液相色谱分析过程在 7min 内完 成， 更快的为临床提供实验数据。 说 明 书 CN 103837630 A 4 3/4 页 5 附图说明 00。
17、28 图 1 为本发明空白血清色谱图 ； 0029 图 2 为本发明对照品色谱图 （tR=5.194min 为 PQ 峰） ； 0030 图 3 为本发明病人血清色谱图。 具体实施方式 0031 为了使本发明实现的技术手段、 创作特征、 达成目的与功效易于明白了解， 下面结 合具体实施例， 进一步阐述本发明。 0032 一种病人血液中百草枯的快速检测方法 0033 1） 百草枯高效液相色谱 （HPLC） 法的建立 0034 高效液相色谱法条件 ： 岛津 LC-20AT 高效液相色谱仪， 色谱柱 shim-pack:vp-ODS （其中 shim-pack:vp-ODS 所代表的的是柱子的型号，。
18、 是岛津公司的一款反相高效液相色谱 柱） ， 柱 ： 4.6mm*250mm， 5m， 流动相 ： 乙腈 -0.02mol/L 辛烷基磺酸钠 （40:60） ， 辛烷基磺酸 钠用 0.26moL/L 的磷酸调 pH 值为 2.5 ； 流速 ： 1.0mLmin-1； 柱温 25 ； 检测波长 254nm ； 0035 2） PQ 含药血清的制备 0036 对照品的制备 0037 精密吸取健康人血清200L， 加入已知浓度的PQ水溶液100L， 加入乙腈400L 混漩1min， 3500r/min-1离心10min， 取上清液,10000r/min-1离心10min， 取上清液进行HPLC 分析。
19、， 得对照品峰面积 Ar ； 参见图 2 ； 0038 样品的制备 0039 精密吸取病人血清 200L， 加入乙腈 400L 混漩 1min， 3500r/min-1离心 10min， 取上清液 ,10000r/min-1离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析， 得样品峰面积 Ax ； 0040 空白血清的制备 0041 精密吸取健康人血清 200L， 加入蒸馏水 100L， 加入乙腈 400L 混漩 1min， 3500r/min-1离心 10min， 取上清液 ,10000r/min-1离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析 ； 参 见图 1 ； 0042 根据计算公。
20、式 ： Cx=Cr*Ax/Ar， 0043 其中 ： Cx 为样品浓度 0044 Cr 为对照品浓度 0045 Ax 为样品峰面积 0046 Ar 为对照峰品面积 0047 根据上述公式进行计算， 得到病人血样中百草枯的浓度， 或者根据 PQ 标准曲线， 将 Ax 代入曲线， 也可得到病人血样中百草枯的浓度。 0048 如病人 XX 于 2013 年 9 月 18 日送来第二份经过灌流后的血液， 要求检测血液中百 草枯浓度。 0049 实验方法 ： 0050 精密吸取病人血清 200L， 加入乙腈 400L 混漩 1min， 3500r/min-1 离心 10min， 取上清液 ,10000r。
21、/min-1 离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析 , 得到样品峰面积 Ax， 样品 浓度 Cx ； 说 明 书 CN 103837630 A 5 4/4 页 6 0051 精密吸取健康人血清200L， 加入已知浓度的PQ水溶液100L， 加入乙腈400L 混漩 1min， 3500r/min-1 离心 10min， 取上清液 ,10000r/min-1 离心 10min， 取上清液进行 HPLC 分析， 得到对照品峰面积 Ar， 对照品浓度 Cr ； 参见图 3 ； 0052 计算公式 ： Cx=Cr*Ax/Ar， 0053 其中 ： Cx 为样品浓度 0054 Cr 为对照品浓。
22、度 0055 Ax 为样品峰面积 0056 Ar 为对照峰品面积 0057 根据上述公式进行计算， 得到病人血样中百草枯的浓度， 或者根据 PQ 标准曲线， 将 Ax 代入曲线， 也可得到病人血样中百草枯的浓度。 0058 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。 本行业的技术 人员应该了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本 发明的原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变 化和改进都落入要求保护的本发明范围内。 本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其 等效物界定。 说 明 书 CN 103837630 A 6 1/3 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103837630 A 7 2/3 页 8 图 2 说 明 书 附 图 CN 103837630 A 8 3/3 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 103837630 A 9 。