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1、(10)申请公布号 CN 103830752 A (43)申请公布日 2014.06.04 CN 103830752 A (21)申请号 201310641990.2 (22)申请日 2013.12.04 A61K 49/22(2006.01) A61K 47/32(2006.01) A61K 9/51(2006.01) A61K 31/704(2006.01) A61P 35/00(2006.01) C08F 120/06(2006.01) C08F 120/28(2006.01) C08F 120/54(2006.01) C08J 3/24(2006.01) (71)申请人 复旦大学 地址。
2、 200433 上海市杨浦区邯郸路 220 号 (72)发明人 杨朋 汪长春 (74)专利代理机构 上海正旦专利代理有限公司 31200 代理人 张磊 (54) 发明名称 一种可降解聚合物纳米微囊的制备方法及其 应用 (57) 摘要 本发明涉及一种可降解聚合物纳米微囊的制 备方法及其应用。 以丙烯酸类为单体， 通过回流沉 淀先制备未交联聚合物纳米微球， 然后以含二硫 键的N,N- 双 ( 丙烯酰 ) 胱胺为交联剂， 在未交 联聚合物纳米微球表面通过回流沉淀包覆一层二 硫键交联聚合物壳层， 将制备的核壳复合微球转 移至乙醇或水中刻蚀未交联的聚合物内核， 便可 制备单分散性的可降解的纳米聚合物纳米。
3、微囊， 本制备方法快速， 后处理简单， 且不需要经过强酸 或者强碱刻蚀， 安全高效。 制备的聚合物纳米微囊 经冻干处理后， 可负载抗癌药物阿霉素， 然后在其 空腔内进一步填充具有超声响应的全氟己烷， 可 有效地用作超声造影剂和药物载体。造影剂可在 谷胱甘肽或二硫苏糖醇还原剂的存在下快速降解 成很低分子量的线性分子 (Mn5000)。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103830752 A CN 103830752 A 1/2 页 。
4、2 1. 一种可降解聚合物纳米微囊的制备方法， 其特征在于具体步骤如下 ： (1) ： 在溶 剂中加入聚合单体和引发剂， 进行回流沉淀反应， 其中聚合单体与引发剂重量比为 100 ： 1-100 ： 10， 控制反应温度为 60-160oC， 反应时间为 0.5-24h ； 反应结束后离心除去溶剂和未 反应单体， 用乙腈反复洗涤 3-5 次， 真空烘箱内 45oC 干燥 24 h, 即得到未交联的聚合物纳 米微球 ； (2) ： 将步骤 (1) 得到的未交联的聚合物纳米微球， 加入聚合单体、 引发剂和二硫键 交联剂， 在溶剂中进行回流沉淀反应， 其中未交联聚合物微球与聚合单体的重量比为 1 ：。
5、 0.1-1 ： 20， 聚合单体与引发剂的重量比为 100 ： 1-100 ： 10， 聚合单体与二硫键交联剂的重量 比为 100 ： 5-100 ： 150， 控制反应温度为 60-160oC， 反应时间为 0.5-24h ； 在步骤 (1) 得到的 未交联的聚合物纳米微球外面包覆一层二硫键交联的聚合物壳层 ； 离心除去溶剂和未反应 原料， 用乙腈反复洗涤 3-5 次， 真空烘箱内 45oC 干燥 24 h, 即得到形成核壳结构的聚合物 纳米微球 ； (3) ： 将步骤 (2) 得到的核壳结构的聚合物纳米微球加入到刻蚀溶剂中， 刻蚀去除未交 联的聚合物内核， 用水反复离心洗涤3-5次， 真。
6、空冻干,即得到形成纳米级的二硫键交联的 可降解的聚合物纳米微囊。 2. 根据权利要求 1 所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法， 其特征在于步骤 (1) 和 步骤 (2) 所用聚合单体为甲基丙烯酸、 丙烯酸、 N-2- 羟丙基 - 甲基丙烯酰胺、 羟乙基甲基丙 烯酸酯、 乙烯基吡啶、 乙烯基咪唑、 N-乙烯基吡咯烷酮、 N-乙烯己内酰胺或N-异丙基丙烯酰 胺中任一种， 或为均聚物， 或者它们之间以不同组合共聚。 3. 根据权利要求 1 所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法， 其特征在于步骤 (1) 和 步骤 (2) 所用引发剂为偶氮二异丁腈、 偶氮二异戊腈、 偶氮二异庚腈或过氧化二苯甲酰中 任。
7、一种。 4. 根据权利要求 1 所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法， 其特征在于步骤 (2) 中 所用的二硫键交联剂为含二硫键的二烯类单体。 5. 根据权利要求 1 所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法， 其特征在于步骤 (1) 和 步骤 (2) 中回流沉淀所用溶剂为单一溶剂或混合溶剂， 所述单一溶剂为乙腈、 乙醇、 水、 四 氢呋喃、 甲基异丁基酮或甲苯中任一种 ； 所述混合溶剂为不同比例的乙腈乙醇、 乙腈四 氢呋喃、 乙腈水、 乙醇甲苯或甲基异丁基酮乙腈的组合物中任一种。 6. 根据权利要求 1 所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法， 其特征在于步骤 (3) 中 所述刻蚀溶剂为乙醇或水中。
8、任一种。 7. 根据权利要求 1 所述的可降解聚合物纳米微囊的制备方法， 其特征在于所述含二硫 键的二烯类单体浓度为 0.01 wt %-50 wt%。 8.一种如权利要求1所述制备方法得到的聚合物纳米微囊大小为50-1000 nm， 聚合反 应体系壳层交联度为 5% 到 60% 之间。 9. 一种如权利要求 1 所述制备方法制备得到的聚合物纳米微囊在超声造影剂和药物 载体方面应用。 10. 根据权利要求 8 所述的应用， 其特征在于所述药物载体为抗癌药物阿霉素。 11. 根据权利要求 8 所述的应用， 其特征在于所述超声造影剂采用的超声响应物为全 氟已烷。 权 利 要 求 书 CN 1038。
9、30752 A 2 2/2 页 3 12. 根据权利要求 11 所述的应用， 其特征在于所述聚合物纳米微囊作为超声造影剂采 用还原剂降解， 所述还源剂为二还原型谷胱甘肽或二硫苏糖醇。 权 利 要 求 书 CN 103830752 A 3 1/5 页 4 一种可降解聚合物纳米微囊的制备方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种制备新型可降解的聚合物纳米微囊的制备方法， 及其在超声造影 剂和药物载体方面应用， 属于新材料及生物医药技术领域。 背景技术 0002 超声成像 (US) 技术利用超声波在人体组织界面发生的反射和散射信号强弱差异 来传递生物内部信息， 从而达到诊断的技术， 是目前全世。
10、界应用最广泛的影像技术之一。 由 于低强度超声对人体组织产生损伤小， 具有安全、 适用面广、 实时、 可反复检查、 对软组织鉴 别能力强、 灵活性高及价廉等优点， 使超声图像诊断成为医学图像诊断的首选技术。但是， 与 CT 成像、 磁共振成像相比， 超声成像的灵敏度和分辨率都很低， 当两个软组织界面具有 相似的声学阻抗时， 两者之间的反射回声十分相近， 因此仅采用超声诊断技术本身很难辨 别健康组织和病变组织， 需加入超声造影剂来增强病变部位和正常组织超声图像问的对比 度， 提高诊断的准确性。超声造影剂 (Ultrasound contrast agents， UCAs) 理论上包括一 切能够引。
11、起超声波回波增强的物质， 目前研究的超声造影剂主要是指包裹气体的微气泡造 影剂。超声微气泡造影剂一般是指直径在 1-10 m 的包膜气泡， 是良好的超声波反射介 质， 具有比其他液体或固体粒子高几个数量级的压缩性， 对超声波具有高的声学响应， 可产 生强散射。在诊断超声频率下 (1-15MHz)， 微气泡在血管或病灶部位聚集后发生共振， 产生 比生物组织更强的回波信号， 从而明显提高超声诊断图像的分辨率、 敏感度和特异性。 但临 床用的超声造影剂均为微米级的微泡， 粒径过大， 无法有效进入癌变等疾病部位， 不利于疾 病的检测。因此， 制备纳米级的超声造影剂成为现在的研究热点。然而， 最近合成的。
12、纳米级 造影剂多为 SiO2等不可降解的微泡， 容易在体内积累造成毒副作用。因此， 为了临床应用， 制备纳米级可降解的超声造影剂成为现阶段研究的难点。 超声造影剂除了在组织灌注和肿 瘤检测等方面的应用外， 在进行微气泡表面修饰靶向特异性分子实现分子显影以及装载药 物、 基因实现药物、 基因靶向治疗等方面发挥了越来越重要的作用。但是， 报道的超声造影 剂通常载药量过低， 不利于其治疗效果， 因此制备高载药量的超声造影剂也是十分关键的 问题。 发明内容 0003 为了克服现有技术所存在的问题， 本发明在于提供一种可降解聚合物纳米微囊的 制备方法及其应用。 0004 本发明提出的可降解聚合物纳米微囊。
13、的制备方法， 具体步骤如下 ： (1) ： 在溶剂中加入聚合单体和引发剂， 进行回流沉淀反应， 其中单体与引发剂重量比 为100 ： 1-100 ： 10， 控制反应温度为60-160oC， 反应时间为0.5-24h ； 反应结束后离心除去溶 剂和未反应单体， 用乙腈反复洗涤 3-5 次， 真空烘箱内 45oC 干燥 24 h, 即得到未交联的聚 合物纳米微球 ； (2) ： 将步骤 (1) 得到的未交联的聚合物纳米微球， 加入聚合单体、 引发剂和二硫键 说 明 书 CN 103830752 A 4 2/5 页 5 交联剂， 在溶剂中进行回流沉淀反应， 其中未交联聚合物微球与聚合单体的重量比为。
14、 1 ： 0.1-1 ： 20， 聚合单体与引发剂的重量比为 100 ： 1-100 ： 10， 聚合单体与二硫键交联剂的重量 比为 100 ： 5-100 ： 150， 控制反应温度为 60-160oC， 反应时间为 0.5-24h ； 在步骤 (1) 得到的 未交联的聚合物纳米微球外面包覆一层二硫键交联的聚合物壳层 ； 离心除去溶剂和未反应 原料， 用乙腈反复洗涤 3-5 次， 真空烘箱内 45oC 干燥 24 h, 即得到形成核壳结构的聚合物 纳米微球 ； (3) ： 将步骤 (2) 得到的核壳结构的聚合物纳米微球加入到刻蚀溶剂中， 刻蚀去除未交 联的聚合物内核， 用水反复离心洗涤3-5。
15、次， 真空冻干,即得到形成纳米级的二硫键交联的 可降解的聚合物纳米微囊。 0005 本发明中， 步骤 (1) 和步骤 (2) 所用聚合单体为甲基丙烯酸 （英文名称 ： Methacrylic acid ， 简称 ： MAA） 、 丙烯酸 （英文名称 ： Acrylic acid， 简称 ： AA） 、 N-2- 羟 丙 基 - 甲 基 丙 烯 酰 胺 （英 文 名 称 ： Hydroxypropyl methacrylate，简 称 ： HPMA） 、羟 乙 基 甲 基 丙 烯 酸 酯 （英 文 名 称 ： 2-Hydroxyethyl methacrylate，简 称 ： HEMA） 、乙 。
16、烯 基 吡 啶 （Vinylpyridine） 、乙 烯 基 咪 唑 （Vinylimidazole） 、 N- 乙 烯 基 吡 咯 烷 酮 （N-VinyPyrrolidone） 、 N- 乙烯己内酰胺 （英文名称 ： Vinyl caprolactam， 简称 ： VCL）或 N- 异丙基丙烯酰胺 （英文名称 ：N-Isopropyl acrylamide ， 简称 ： NIPAM） 中任一种， 或可 以均聚， 或者它们之间以不同组合共聚。 0006 本发明中， 步骤 (1) 和步骤 (2) 所用引发剂为偶氮二异丁腈 （英文名称 ： Azodiisobutyronitrile， 简称 ： 。
17、AIBN） 、 偶氮二异戊腈 （英文名称 ： 2,2-Azobis-(2-methyl butyronitrile)， 简称 ： AMBN） 、 偶氮二异庚腈 （英文名称 ： 2,2-Azobis-(2,4-dimethylval eronitrile) ， 简称 ： ADVN） 或过氧化二苯甲酰 （英文名称 ： Benzoyl peroxide， 简称 ： BPO） 等中任一种。 0007 本发明中， 步骤(2)中所用的二硫键交联剂为含二硫键的二烯类单体， 如N,N-双 ( 丙烯酰 ) 胱胺 ( 英文名称 ： N, N-Bis(acryloyl)cystamine， 简称 ： BACy)。 。
18、0008 本发明中， 步骤(1)和步骤(2)中回流沉淀所用溶剂为单一溶剂或混合溶剂， 所述 单一溶剂为乙腈、 乙醇、 水、 四氢呋喃、 甲基异丁基酮或甲苯中任一种 ； 所述混合溶剂为不同 比例的乙腈乙醇、 乙腈四氢呋喃、 乙腈水、 乙醇甲苯或甲基异丁基酮乙腈的组合 物中任一种。 0009 本发明中， 步骤 (3) 中所述刻蚀溶剂为乙醇或水中任一种。 0010 本发明中， 所述含二硫键的二烯类单体浓度为 0.01 wt %-50 wt%。 0011 利用本发明方法制备得到的聚合物纳米微囊大小为 50-1000 nm， 聚合反应体系壳 层交联度为 5% 到 60% 之间， 具有良好的单分散性。 0。
19、012 利用本发明方法制备得到的聚合物纳米微囊在超声造影剂和药物载体方面应用。 0013 本发明中， 所述药物载体为抗癌药物阿霉素。 0014 本发明中， 所述超声造影剂采用的超声响应物为全氟已烷。 0015 利用本发明方法制备得到的聚合物纳米微囊作为超声造影剂采用还原剂降解， 降 解的测试条件为 ： 在25 mL的单口烧瓶里加入5 mg的聚合物纳米微囊和10 mL的磷酸盐缓 冲溶液 (pH=7.4), 然后加入 10 mM 的还原剂 , 然后放入恒温摇床 （200 rpm 摇速， 37.5oC） 匀速振荡。所述还源剂为二还原型谷胱甘肽 (GSH) 或二硫苏糖醇 （DTT） 。 说 明 书 C。
20、N 103830752 A 5 3/5 页 6 0016 载药的条件为 ： 50 mg的聚合物纳米微囊和30 mg盐酸阿霉素， 超声分散在100 mL 的磷酸盐缓冲溶液 (pH=7.4) 中， 磁力搅拌 24h, 然后离心移去上清液， 用磷酸盐缓冲溶液 (pH=7.4) 洗涤 3 次除去表面吸附的阿霉素， 即得物理负载阿霉素的聚合物纳米微囊。 0017 填充全氟己烷的条件 ： 50 mg 负载阿霉素的聚合物纳米微囊冻干后， 储存于 50 ml 容量的离心管中， 缓慢加入150 L的全氟己烷， 超声震荡， 再缓慢加入25 mL的磷酸盐缓冲 溶液 (pH=7.4)， 轻微震荡， 即可形成负载有药物。
21、和填充全氟己烷的聚合物纳米微囊悬浮液。 0018 释药的条件为 ： 将 10 mg 负载药物和填充全氟己烷的聚合物纳米微囊分散在 10 mL 的两种缓冲溶液中 （磷酸盐缓冲溶液， pH=7.4 ； 醋酸醋酸钠缓冲溶液， pH=5.0） , 超声分 散均匀， 然后分为 5 份， 每份 2 mL, 将一份溶液移入透析袋中 （透析分子量 Mn=14000） , 再放 入 80 mL 的含不同浓度的还原剂的缓冲溶液中， 即刻开始计时释药。在预订时间， 从瓶内取 出 3 mL 释药的缓冲溶液进行紫外测量， 再补充 3 mL 纯的缓冲溶液保持体积恒定。 0019 本发明所制备的可降解聚合物纳米微囊具有以下。
22、特点 ：（1） 回流沉淀制备过程简 单、 高效 ；（2） 粒径为 50-1000 nm， 具有很好的单分散性 ；（3） 还原剂降解后， 分子量小于 5000 且分子量分布均匀， 远小于代谢阈值 （45 50 kDa） ， 可以很好的代谢排出体外 ；（4） 阿霉素的载药率和载药量均很高 ；（5） 阿霉素的释放过程可以通过调节环境的氧化还原环 境， pH 值和超声条件加以控制， 在超声、 谷胱甘肽浓度和较低 pH 值条件下展现出较快的释 放速度， 而在中性的 pH 值和谷胱甘肽浓度条件下释放量较小 ；（6） 加入的全氟己烷在超声 条件下可以产生良好的超声信号。说明所制备的聚合物纳米微囊具有良好的生。
23、物降解性， 是一种较好的药物载体和超声造影剂。 附图说明 0020 图1.制备的不同交联度的PMAA纳米微囊的透射电镜照片 ： A、 交联度10% ； B、 交联 度 20% ； C、 交联度 30% ； D、 交联度 40%。 0021 图2.实施例5是负载阿霉素的PMAA微囊在不同条件下的释药曲线。 其中 ： (A)在 pH=7.4 条件下的释药曲线， (B) 在 pH=7.4 条件下的释药曲线。 0022 图 3. 实施例 6 填充全氟己烷 (PFH) 的 PMAA 微囊在不同模式下的体外超声成像图 片。其中 ： 图 (A)- 图 (C) 为在传统 B 模式下的体外超声图像， 图 (D)。
24、- 图 (F) 为在能量多普 勒模式下的体外超声图像。 具体实施方式 0023 下面将通过实例对于本发明做进一步的详细说明。 0024 实施例 1 ： 壳层厚度为 25 nm， 交联度为 40% 的 PMAA 微囊的制备 （1） 未交联PMAA纳米微球的合成 ： MAA 2 g， AIBN 0.04 g, 80 mL乙腈， 加入到100 mL 单口瓶中， 加热到 100 oC， 回流反应 2 h。离心除去溶剂和未反应单体， 用乙腈洗涤 3 次， 真 空烘箱干燥 24 h。 0025 （2） 核壳结构的PMAA纳米微球的合成 ： 取PMAA纳米微球100 mg， MAA单体200 mg， BAC。
25、y 交联剂 80 mg， 10 mg AIBN 引发剂， 40 mL 乙腈， 加热到 100 oC， 回流反应 2 h。离心除 去未反应单体， 用乙腈洗涤 3 次， 真空烘箱干燥 24 h。 0026 （3） 将制备的核壳结构的 PMAA 纳米微球溶于 50 mL 乙醇溶液中， 加热到 50 oC， 刻 说 明 书 CN 103830752 A 6 4/5 页 7 蚀 3 h。离心分离， 用乙醇和水洗涤 3 次， 冷冻干燥， 将得到的样品取 1 mg 分散在 10 ml 去 离子水中， 进行透射电镜和动态光散射测试， 得粒径为340 nm， 壳层厚度为25 nm， 交联度为 40% 的核壳式 。
26、PMAA 微囊。 0027 实施例 2 ： 壳层厚度为 15 nm， 交联度为 30% 的 PAA 微囊的制备 （1） 未交联 PAA 纳米微球的合成 ： AA 1 g, AMBN 0.02 g, 80 mL 乙腈， 加入到 100 mL 单口瓶中， 加热到 100 oC， 回流反应 2 h。离心除去溶剂和未反应单体， 用乙腈洗涤 3 次， 真 空烘箱干燥 24 h。 0028 （2） 核壳结构的 PAA 纳米微球的合成 ： 取 PAA 纳米微球 50 mg， AA 单体 200 mg， BACy 交联剂 60 mg， 10 mg AMBN 引发剂， 40 mL 乙腈， 加热到 120 oC，。
27、 回流反应 1 h。离心除 去未反应单体， 用乙腈洗涤 3 次， 真空烘箱干燥 24 h。 0029 （3） 将制备的核壳结构的PAA纳米微球溶于50 mL水中， 加热到50 oC， 刻蚀3 h。 离 心分离， 用乙醇和水洗涤 3 次， 冷冻干燥， 将得到的样品取 1 mg 分散在 10 ml 去离子水中， 进行透射电镜和动态光散射测试， 得粒径为 300 nm， 壳层厚度为 15 nm， 交联度为 30% 的核 壳式 PAA 微囊。 0030 实施例 3 ： 壳层厚度为 10 nm， 交联度为 20% 的 PHEMA 微囊的制备 （1） 未交联PHEMA纳米微球的合成 ： HEMA 0.5 。
28、g, AMBN 0.02 g, 50 mL乙腈， 加入到 100 mL 单口瓶中， 加热到 90 oC， 回流反应 2 h。离心除去溶剂和未反应单体， 用乙腈洗涤 3 次， 真空烘箱干燥 24 h。 0031 （2） 核壳结构的 PHEMA 纳米微球的合成 ： 取 PHEMA 纳米微球 50 mg， HEMA 单体 200 mg， BACy 交联剂 40 mg， 10 mg AIBN 引发剂， 40 mL 乙腈， 加热到 90 oC， 回流反应 1 h。离心 除去未反应单体， 用乙腈洗涤 3 次， 真空烘箱干燥 24 h。 0032 （3） 将制备的核壳结构的 PHEMA 纳米微球溶于 50 。
29、mL 水和乙醇中， 加热到 50 oC， 刻 蚀 3 h。离心分离， 用乙醇和水洗涤 3 次， 冷冻干燥， 将得到的样品取 1 mg 分散在 10 ml 去 离子水中， 进行透射电镜和动态光散射测试， 得粒径为350 nm， 壳层厚度为10 nm， 交联度为 20% 的核壳式 PHEMA 微囊。 0033 实施例 4 ： 壳层厚度为 35 nm， 交联度为 50% 的 PNIPAM 微囊的制备 （1） 未交联PNIPAM纳米微球的合成 ： NIPAM 3 g, AMBN 0.06 g, 50 mL乙腈， 加入到 100 mL 单口瓶中， 加热到 90 oC， 回流反应 2 h。离心除去溶剂和未。
30、反应单体， 用乙腈洗涤 3 次， 真空烘箱干燥 24 h。 0034 （2） 核壳结构的 PNIPAM 纳米微球的合成 ： 取 PNIPAM 纳米微球 200 mg， NIPAM 单 体 600 mg， BACy 交联剂 600 mg， 100 mg AIBN 引发剂， 100 mL 乙腈， 加热到 110 oC， 回流反 应 4 h。离心除去未反应单体， 用乙腈洗涤 3 次， 真空烘箱干燥 24 h。 0035 （3） 将制备的核壳结构的 PNIPAM 纳米微球溶于 50 mL 水和乙醇中， 加热到 50 oC， 刻蚀 3 h。离心分离， 用乙醇和水洗涤 3 次， 冷冻干燥， 将得到的样品取。
31、 1 mg 分散在 10 ml 去离子水中， 进行透射电镜和动态光散射测试， 得粒径为400 nm， 壳层厚度为35 nm， 交联度 为 50% 的核壳式 PNIPAM 微囊。 0036 实施例 5 ： 取实施例 1 中制得的 PMAA 微囊 50 mg， 加入 30 mg 的阿霉素， 配成 100 mL的溶液， 磷酸盐缓冲溶液， 常温下搅拌24 h， 产物用离心分离， 冷冻干燥， 制成负载有抗癌 阿霉素的PMAA药物载体， 载药率的重量比为93.5%， 载药量为36%， 纳米药物在pH、 谷胱甘肽 说 明 书 CN 103830752 A 7 5/5 页 8 （GSH） 及超声条件下可以快速释放 ( 见图 2)。 0037 实施例 6 ： 50 mg 负载阿霉素的 PMAA 微囊冻干后， 储存于 50 ml 容量的离心管中， 缓慢加入150 L的全氟己烷， 超声震荡， 再缓慢加入25 mL的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)， 轻 微震荡， 即可形成负载有药物和全氟己烷的微囊悬浮液， 该微囊的显影效果良好 ( 见图 3)。 说 明 书 CN 103830752 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103830752 A 9 2/2 页 10 图 3 说 明 书 附 图 CN 103830752 A 10 。