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1、(10)申请公布号 CN 103983735 A (43)申请公布日 2014.08.13 CN 103983735 A (21)申请号 201410228670.9 (22)申请日 2014.05.26 G01N 30/90(2006.01) G01N 30/02(2006.01) (71)申请人 江西民济药业有限公司 地址 336200 江西省宜春市铜鼓县城定江西 路 188 号 (72)发明人 李明辉 王刚 (54) 发明名称 一种制备宫炎平胶囊的检测方法 (57) 摘要 本发明涉及一种制备宫炎平胶囊的检测方 法， 该方法涉及地稔、 两面针、 五指毛桃的薄层色 谱鉴别， 阿魏酸酸的高效液。
2、相色谱含量测定及其 限度。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 10 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书10页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103983735 A CN 103983735 A 1/2 页 2 1. 一种制备宫炎平胶囊的检测方法， 其中所述宫炎平胶囊由地稔、 两面针、 当归、 五指毛桃、 柘木制成， 所述地稔、 两面针、 当归、 五指毛桃、 柘木的重量比为 450 170 140 100 140 ； 所述宫炎平胶囊采用如下制备方法获得 ： 地稔 450g 两面针 170g 当归 140g 。
3、五指毛桃 100g 柘 木 140g 以上五味， 加水煎煮二次， 每次加水 12 倍量， 煎煮 2 小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩至相对 密度在5560测定为1.25， 加乙醇至含醇量达50， 静置24小时， 滤过， 滤液回收乙醇， 浓缩至相对密度在 60测定为 1.35 1.40 的稠膏， 干燥， 粉碎成细粉， 加适量辅料， 混匀， 制粒， 装入胶囊， 制成本品 1000 粒 ； 制备所述宫炎平胶囊的检测方法为 ： (1) 取本品 10 粒， 倾出内容物， 研细， 加甲醇 30ml， 超声处理 30 分钟， 滤过， 滤液蒸干， 残渣加水10ml使溶解， 加盐酸2ml， 加热回流30分钟， 。
4、立即冷却， 用乙酸乙酯振摇提取2次， 每次 20ml， 合并乙酸乙酯液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 ； 另取地稔对照 药材 1g， 加甲醇 10ml， 同法制成对照药材溶液 ； 再取没食子酸对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作对照品溶液， 照薄层色谱法试验， 吸取上述三种溶液各 10ul， 分别点于同 一硅胶G薄层板上， 以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(931)为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 1三氯化铁乙醇溶液， 供试品色谱中， 在与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上， 显相同颜色的斑点 ； (2) 取本品内容物 2g， 研细， 加水 。
5、30ml， 研磨 2 分钟， 滤过， 滤液用三氯甲烷振摇提取 2 次， 每次 20ml， 合并三氯甲烷液， 蒸干， 残渣加三氯甲烷 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 ； 另取 两面针对照药材 1g， 加水煎煮 20 分钟， 滤过， 滤液同供试品溶液制备方法制成对照药材溶 液， 照薄层色谱法试验， 吸取上述两种溶液各 10l， 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏 合剂的硅胶 G 薄层板上， 以三氯甲烷 - 丙酮 - 甲酸 (18 2 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾 干， 置 365nm 波长紫外光灯下检视， 供试品色谱中， 在与对照药材色谱相应的位置上， 显相 同颜色的荧光主斑点 ； (3)。
6、 取本品内容物 3g， 加三氯甲烷 30ml， 加热回流 2 小时， 放冷， 滤过， 滤液浓缩至 0.5ml， 作为供试品溶液 ； 另取补骨脂素对照品加三氯甲烷制成每1ml含1mg的溶液， 作为对 照品溶液， 照薄层色谱法试验， 吸取上述供试品溶液 20l， 对照品溶液 5l， 分别点于同 一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G 薄层板上， 以正己烷 - 乙酸乙酯 (9 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10氢氧化钾溶液显色， 置 365nm 波长紫外光灯下检视， 供试品色谱 中， 在与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点 ； (4) 含量测定 色谱条件与系统适用性试验用。
7、十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 乙腈 -1冰醋酸 (15 85) 为流动相， 检测波长为 323nm， 理论板数按阿魏酸峰计算不低于 1500， 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥 24 小时的阿魏酸对照品适量， 精密称定， 加甲醇制成每 1ml 含 6.0g 的溶液， 供试品溶液的制备取本品内容物， 研细， 精密称取约 5g， 置于 100ml 具塞锥形瓶中， 加 入 50ml 水， 超声处理 40 分钟， 放冷， 过滤， 精密吸取续滤液 25ml 至分液漏斗中， 用盐酸调 节 pH 值至 2， 用乙醚振摇提取 5 次， 每次 15ml， 合并乙醚液， 用 5碳酸氢钠溶液振摇提取 5 权。
8、 利 要 求 书 CN 103983735 A 2 2/2 页 3 次， 每次 30ml， 合并碳酸氢钠溶液， 用盐酸调节 pH 值至 2， 用乙醚振摇提取 5 次， 每次 15ml， 合并乙醚液， 挥干， 残渣用甲醇溶解移至 5ml 棕色量瓶中， 加甲醇定容至刻度， 摇匀， 用微孔 滤膜滤过， 取续滤液即得， 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 2. 如权利要求 1 所述的检测方法， 其中每粒含当归以阿魏酸 (C10H10O4) 计， 不少于 2.5g。 3. 如权利要求 1 所述的检测方法， 其中超声处理的功率 90W， 频率 59KHz。
9、。 权 利 要 求 书 CN 103983735 A 3 1/10 页 4 一种制备宫炎平胶囊的检测方法 技术领域 0001 本发明涉及一种制备宫炎平胶囊的检测方法。 背景技术 0002 盆腔炎 (Pelvic inflammatory diseade， PID) 指女性上生殖道及其周围组织的 炎症， 主要包括子宫内膜炎 (endometritis)、 输卵管炎 (salpingitis)、 输卵管卵巢脓肿 (tubo-ovarian abscess， TOA)、 盆腔腹膜炎 (peritonitis)。炎症可局限于一个部位， 也可 同时累及几个部位， 最常见的是输卵管炎、 输卵管卵巢炎。盆腔。
10、炎多发生在性活跃期、 有月 经的妇女， 初潮前、 绝经后或未婚者很少发生盆腔炎， 若发生盆腔炎也往往是邻近器官炎症 的扩散。按其发病过程、 临床表现可分为急性与慢性两种。 0003 急性盆腔炎是指女性内生殖器及其周围结缔组织、 盆腔腹膜发生的急性炎症， 可 局限于一个部位， 也可几个部位同时发病。 常见致病菌为葡萄球菌、 链球菌、 大肠杆菌、 厌氧 菌及性传播病原体， 如淋菌、 支原体、 衣原体等。经淋巴、 血行或直接蔓延至盆腔而引起。常 见急性子宫内膜炎、 子宫肌炎、 输卵管炎、 输卵管积脓、 输卵管卵巢脓肿、 盆腔结缔组织炎、 盆腔腹膜炎， 严重者可引起败血症及脓毒血症。如不及时控制， 可。
11、出现感染性休克甚至死 亡。 0004 慢性盆腔炎是指女性内生殖器及其周围结缔组织、 盆腔腹膜的慢性炎症。其主要 临床表现为月经紊乱、 白带增多、 腰腹疼痛及不孕等， 如已形成慢性附件炎， 则可触及肿块。 0005 目前治疗急、 慢性盆腔炎的药物多为宫炎平片剂。由于片剂易吸湿、 易被氧化， 稳 定性不高， 药效较差。 0006 宫炎平胶囊是由宫炎平片改变剂型而来， 临床上用于急、 慢性盆腔炎的治疗， 有较好的效果。目前现有技术中已经有涉及宫炎平胶囊的制备方法等专利申请， 例如 2005101214259， 2005100032342， 2005100352266， 2008100028798， 。
12、以 及 2012101521990 等 专利申请中， 均公开了涉及宫炎平胶囊的制备方法或质量控制方法。 0007 然而上述专利申请中公开的相关方法仍然存在两个方面的主要缺陷 ： 0008 一方面， 仍然存在缺乏专属性导致的给鉴别造成困难的缺陷， 或者由于薄层色谱 鉴别方法检出不明显导致的杂质干扰过大的缺陷， 以及缺少含量测定检测导致的不能很好 的控制成品质量的缺陷。 0009 而另一方面， 为了实现控制成品质量， 针对宫炎平胶囊全部的成份采用薄层色谱 法对地稳、 两面针、 当归和五指毛桃等全部进行药材鉴别， 又极大的增加了生产成本， 虽然 能控制质量， 但并不能满足实际生产的要求。 因此， 目。
13、前现有技术中相关产品的制备方法都 无法满足实际生产的需要。 发明内容 0010 本发明正是从现有技术出发， 提供了一种制备宫炎平胶囊的检测方法， 即能实现 精确控制成品质量， 又能控制生产成本， 适于广泛应用实际生产过程中。 说 明 书 CN 103983735 A 4 2/10 页 5 0011 本发明提供一种制备宫炎平胶囊的检测方法， 其中所述宫炎平胶囊由地稔、 两 面针、 当归、 五指毛桃、 柘木制成， 所述地稔、 两面针、 当归、 五指毛桃、 柘木的重量比为 450 170 140 100 140 ； 所述宫炎平胶囊采用如下制备方法获得 ： 0012 地稔 450g 两面针 170g 。
14、当归 140g 0013 五指毛桃 100g 柘 木 140g 0014 以上五味， 加水煎煮二次， 每次加水 12 倍量， 煎煮 2 小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩至 相对密度在 55 60测定为 1.25， 加乙醇至含醇量达 50， 静置 24 小时， 滤过， 滤液回收 乙醇， 浓缩至相对密度在 60测定为 1.35 1.40 的稠膏， 干燥， 粉碎成细粉， 加适量辅料， 混匀， 制粒， 装入胶囊， 制成本品 1000 粒 ； 0015 制备所述宫炎平胶囊的检测方法为 ： 0016 (1) 取本品 10 粒， 倾出内容物， 研细， 加甲醇 30ml， 超声处理 30 分钟， 滤过， 滤液。
15、蒸 干， 残渣加水 10ml 使溶解， 加盐酸 2ml， 加热回流 30 分钟， 立即冷却， 用乙酸乙酯振摇提取 2 次， 每次 20ml， 合并乙酸乙酯液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 ； 另取地 稔对照药材 1g， 加甲醇 10ml， 同法制成对照药材溶液， 再取没食子酸对照品， 加甲醇制成每 1ml含0.5mg的溶液， 作对照品溶液， 照薄层色谱法试验， 吸取上述三种溶液各10ul， 分别点 于同一硅胶 G 薄层板上， 以三氯甲烷 - 乙酸乙酯 - 甲酸 (9 3 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 1三氯化铁乙醇溶液， 供试品色谱中， 在与对照药材。
16、色谱和对照品色谱相应位 置上， 显相同颜色的斑点 ； 0017 (2) 取本品内容物 2g， 研细， 加水 30ml， 研磨 2 分钟， 滤过， 滤液用三氯甲烷振摇提 取 2 次， 每次 20ml， 合并三氯甲烷液， 蒸干， 残渣加三氯甲烷 1ml 使溶解， 作为供试品溶液 ； 另取两面针对照药材 1g， 加水煎煮 20 分钟， 滤过， 滤液同供试品溶液制备方法制成对照药 材溶液， 照薄层色谱法试验， 吸取上述两种溶液各 10l， 分别点于同一以羧甲基纤维素钠 为黏合剂的硅胶 G 薄层板上， 以三氯甲烷 - 丙酮 - 甲酸 (18 2 1) 为展开剂， 展开， 取 出， 晾干， 置 365nm。
17、 波长紫外光灯下检视， 供试品色谱中， 在与对照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光主斑点 ； 0018 (3) 取本品内容物 3g， 加三氯甲烷 30ml， 加热回流 2 小时， 放冷， 滤过， 滤液浓缩至 0.5ml， 作为供试品溶液 ； 另取补骨脂素对照品加三氯甲烷制成每1ml含1mg的溶液， 作为对 照品溶液， 照薄层色谱法试验， 吸取上述供试品溶液 20l， 对照品溶液 51， 分别点于同 一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G 薄层板上， 以正己烷 - 乙酸乙酯 (9 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10氢氧化钾溶液显色， 置 365nm 波长紫外光灯下检视， 供。
18、试品色谱 中， 在与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光斑点 ； 0019 (4) 含量测定 0020 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 乙腈 -1冰醋酸 (15 85) 为流动相， 检测波长为 323nm， 理论板数按阿魏酸峰计算不低于 1500， 0021 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥 24 小时的阿魏酸对照品适量， 精密 称定， 加甲醇制成每 1ml 含 6.0g 的溶液， 0022 供试品溶液的制备取本品内容物， 研细， 精密称取约 5g， 置于 100ml 具塞锥形瓶 中， 加入 50ml 水， 超声处理 40 分钟， 放冷， 过滤， 精密吸取。
19、续滤液 25ml 至分液漏斗中， 用盐 酸调节 pH 值至 2， 用乙醚振摇提取 5 次， 每次 15ml， 合并乙醚液， 用 5碳酸氢钠溶液振摇 说 明 书 CN 103983735 A 5 3/10 页 6 提取 5 次， 每次 30ml， 合并碳酸氢钠溶液， 用盐酸调节 pH 值至 2， 用乙醚振摇提取 5 次， 每次 15ml， 合并乙醚液， 挥干， 残渣用甲醇溶解移至 5ml 棕色量瓶中， 加甲醇定容至刻度， 摇匀， 用微孔滤膜滤过， 取续滤液即得， 0023 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 201， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0024 优选的， 其中每粒含当归以。
20、阿魏酸 (C10H10O4) 计， 不少于 2.5g。 0025 优选的， 其中超声处理的功率 90W， 频率 59KHz。 0026 采用本发明的检测方法， 方法中主要涉及地稔、 两面针、 五指毛桃的薄层色谱鉴 别， 阿魏酸酸的高效液相色谱含量测定及其限度， 一方面， 解决了之前长期存在的由于缺乏 专属性导致的给鉴别造成困难的缺陷， 另一方面， 也排了除了干扰过大的缺陷以及由于缺 少含量测定检测导致的不能很好的控制成品质量的缺陷。同时， 在控制质量的同时也降低 了检测成本， 完全能满足实际生产的要求。 附图说明 0027 图 1 地稔的薄层色谱图 0028 图 2 薄层板的适用性试验 002。
21、9 图 3 温度的适用性试验 0030 图 4 宫炎平胶囊两面针药材 TLC 图谱 0031 图 5 宫炎平胶囊五指毛桃药材 TLC 图谱 具体实施方式 0032 下面， 给出本发明制备宫炎平胶囊的检测方法的具体实施例。 0033 实施例 1 0034 地稔 450g 两面针 170g 当归 140g 0035 五指毛桃 100g 柘 木 140g 0036 制法方法 ： 0037 以上五味， 加水煎煮二次， 每次加水 12 倍量， 煎煮 2 小时， 滤过， 合并滤液， 浓缩至 相对密度为1.25(5560)， 加乙醇至含醇量达50， 静置24小时， 滤过， 滤液回收乙醇， 浓缩至相对密度为1。
22、.351.40(60)的稠膏， 干燥， 粉碎成细粉， 加适量辅料， 混匀， 制粒， 装入胶囊， 制成 1000 粒， 即得。 0038 检测方法 ： 0039 (1) 取本品 10 粒， 倾出内容物， 研细， 加甲醇 30ml， 超声处理 30 分钟， 滤过， 滤液蒸 干， 残渣加水 10ml 使溶解， 加盐酸 2ml， 加热回流 30 分钟， 立即冷却， 用乙酸乙酯振摇提取 2 次， 每次 20ml， 合并乙酸乙酯液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品溶液。另取地 稔对照药材 1g， 加甲醇 10ml， 同法制成对照药材溶液。再取没食子酸对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0。
23、.5mg 的溶液， 作对照品溶液。照薄层色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 VIB) 试 验， 吸取上述三种溶液各 10ul， 分别点于同一硅胶 G 薄层板上， 以三氯甲烷 - 乙酸乙酯 - 甲 酸 (9 3 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 1三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中， 在 与对照药材色谱和对照品色谱相应位置上， 显相同颜色的斑点。 说 明 书 CN 103983735 A 6 4/10 页 7 0040 (2) 取本品内容物 2g， 研细， 加水 30ml， 研磨 2 分钟， 滤过， 滤液用三氯甲烷振摇 提取 2 次， 每次 20ml， 合并三氯甲烷液， 蒸干。
24、， 残渣加三氯甲烷 1ml 使溶解， 作为供试品溶 液。另取两面针对照药材 1g， 加水煎煮 20 分钟， 滤过， 滤液同供试品溶液制备方法制成对 照药材溶液。照薄层色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 VI B) 试验， 吸取上述两种溶 液各 10l， 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G 薄层板上， 以三氯甲烷 - 丙 酮 - 甲酸 (18 2 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 置紫外光灯 (365nm) 下检视， 供试品色 谱中， 在与对照药材色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧光主斑点。 0041 (3) 取本品内容物 3g， 加三氯甲烷 30ml， 加热回流 。
25、2 小时， 放冷， 滤过， 滤液浓缩至 0.5ml， 作为供试品溶液。另取补骨脂素对照品加三氯甲烷制成每 1ml 含 1mg 的溶液， 作为 对照品溶液。照薄层色谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 VI B) 试验， 吸取上述供试品溶 液 20l， 对照品溶液 5l， 分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶 G 薄层板上， 以正己烷 - 乙酸乙酯 (9 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾干， 喷以 10氢氧化钾溶液显色， 置 紫外光灯 (365nm) 下检视。供试品色谱中， 在与对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的荧 光斑点。 0042 (4) 含量测定 0043 照高效液相色。
26、谱法 ( 中国药典 2010 年版一部附录 VID)。 0044 色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂， 乙腈 -1冰醋酸 (15 85) 为流动相， 检测波长为 323nm。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于 1500。 0045 对照品溶液的制备取经五氧化二磷减压干燥 24 小时的阿魏酸对照品适量， 精密 称定， 加甲醇制成每 1ml 含 6.0g 的溶液， 。 0046 供试品溶液的制备取本品内容物， 研细， 取， 精密称取约 5g， 置于 100ml 具塞锥形 瓶中， 加入 50ml 水， 超声处理 ( 功率 90W， 频率 59KHz)40 分钟， 放冷， 过滤， 精密。
27、吸取续滤液 25ml至分液漏斗中， 用盐酸调节pH值至2， 用乙醚振摇提取5次， 每次15ml， 合并乙醚液， 用 5碳酸氢钠溶液振摇提取 5 次， 每次 30ml， 合并碳酸氢钠溶液， 用盐酸调节 pH 值至 2， 用乙 醚振摇提取 5 次， 每次 15ml， 合并乙醚液， 挥干， 残渣用甲醇溶解移至 5ml 棕色量瓶中， 加甲 醇定容至刻度， 摇匀， 用微孔滤膜 (0.45M) 滤过， 取续滤液即得。 0047 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各 20l， 注入液相色谱仪， 测定， 即得。 0048 本品每粒含当归以阿魏酸 (C10H10O4) 计， 不得少于 2.5g。 0049。
28、 实验例 1 ： 地稔薄层鉴别 0050 供试品溶液的制备 ： 取本品 10 粒， 倾出内容物， 研细， 加甲醇 30ml， 超声处理 30 分 钟， 滤过， 滤液蒸干， 残渣加水10ml使溶解， 加盐酸2ml， 加热回流30分钟， 立即冷却， 用乙酸 乙酯振摇提取 2 次， 每次 20ml， 合并乙酸乙酯液， 蒸干， 残渣加甲醇 1ml 使溶解， 作为供试品 溶液。 0051 对照药材溶液的制备 ： 取地稔对照药材 1g， 加甲醇 10ml， 同法制成对照药材溶液。 0052 对照品溶液的制备 ： 取没食子酸对照品， 加甲醇制成每 1ml 含 0.5mg 的溶液， 作为 对照品溶液。 005。
29、3 阴性对照溶液的制备 ： 取缺地稔的阴性样品， 同供试品溶液制备方法制成缺地稔 阴性对照溶液。 说 明 书 CN 103983735 A 7 5/10 页 8 0054 薄层层析 ： 照薄层色谱法 ( 附录 B) 试验， 吸取上述四种溶液各 10l， 分别点于 同一硅胶 G 薄层板上， 以三氯甲烷 - 乙酸乙酯 - 甲酸 (9 3 1) 为展开剂， 展开， 取出， 晾 干， 喷以1三氯化铁乙醇溶液。 供试品色谱中， 在与对照药材和对照品色谱相应的位置上， 显相同颜色的斑点。通过多次试验， 重复性好， 阴性对照无干扰， 故列入正文。结果见图 1， 其中， 1 为阴性对照 2.3.4. 为供试品。
30、， 批号 ： 130606 130607 130608 ； 5 为地稔对照药材 ； 6 为没食子酸对照品， T 25， RH 58。 0055 耐用性考察 0056 不同薄层板的比较 0057 取同样的地稔对照药材溶液、 没食子酸对照品溶液、 3 批样品溶液 ( 按正文拟订的 方法制备)， 分别点于自制的硅胶G薄层板和普通预制硅胶G薄层板(上海东方药品科技实 业有限公司生产)上， 结果两种不同品牌的硅胶G薄层板均能达到良好的分离效果， 结果基 本一致， 结果见图 2。其中， 1.2.3. 为供试品， 批号 ： 130606 130607 130608 ； 4 为地稔对照 药材 ； 5 为没食子。
31、酸对照品， T 25， RH 58。 0058 不同温度的比较 0059 取同样的地稔对照药材溶液、 没食子酸对照品溶液、 3 批样品溶液 ( 按正文拟订的 方法制备 )， 点于自制的硅胶 G 薄层板上， 分别考察常温常湿 (A ： T 25， RH ： 58 ) 和低温常湿 (B ： T 8， RH 58 ) 两种条件下的分离情况， 结果表明在以上温度条件 下均能达到良好的分离效果， 温度对分离影响不大， 见图 3。其中， 1.2.3. 为供试品， 批号 ： 130606 130607 130608 ； 4 为地稔对照药材 ； 5 为没食子酸对照品， T 8， RH 58。 0060 不同湿。
32、度的比较 0061 取同样的地稔对照药材溶液、 没食子酸对照品溶液、 3 批样品溶液， 点于自制的硅 胶 G 薄层板上， 分别考察常温高湿 (B ： T 25， RH 88 ) 和常温低湿 (C ： T 25， RH 32 ) 三种条件下的分离情况， 结果表明在以上湿度条件下均能达到良好的分离效果， 湿度对分离影响不大， 见图3， 图3中， 1.2.3.为供试品， 批号 ： 130606 130607 130608 ； 4为 地稔对照药材 ； 5 为没食子酸对照品 ； T 25， RH 32。 0062 实验例 2 ： 两面针的薄层色谱鉴别 0063 两面针为方中臣药， 原方法中已建立该药材的。
33、鉴别项， 但经多次试验发现对照药 材色谱在与供试品色谱斑点对应不够整齐， 对照药材出现四个斑点而供试品只能对应其中 二个斑点， 因此本方法在原方法的基础上进行修订。 供试品提取采用加水研磨、 氯仿萃取替 换原方法的乙醇水浴加热回流， 提取效率更高。 对照药材则采用水煎煮后用氯仿萃取， 因为 采用氯仿作为溶剂斑点成型性更好。展开剂更改为氯仿 - 丙酮 - 甲酸 (18 2 1)， 其他 检视方法保持不变。 另按处方取不含两面针的其它药味， 按制备方法制成阴性样品， 进行阴 性对照试验， 结果阴性无干扰， 对照药材与供试品斑点对应整齐、 圆整、 清晰， 表明本方法可 行。经多批样品实验观察， 供试。
34、品色谱中， 在与对照药品色谱相应的位置上， 显相同颜色的 荧光斑点， 均符合规定。附三批样品的 TLC 图谱图 4， 两面针对照药材由中国药品生物制品 检定所提供， 批号 ： 121014-200302。图中， 1、 两面针对照药材 2、 3、 4 三批样品 5、 阴性样品。 0064 实验例 3 ： 五指毛桃的特征成分补骨脂素薄层色谱鉴别 0065 参照有关文献中的展开系统， 以正己烷 - 醋酸乙酯 (7 3) 展开为最佳， 有紫外光 灯 (365nm) 下检视。另取除五指毛桃药材外的其余几味药材按制法制成阴性样品， 进行阴 说 明 书 CN 103983735 A 8 6/10 页 9 性。
35、试验， 试验结果表明阴性样品不干扰主斑点， 经数批样品实验观察， 对照药材与供试品斑 点对应整齐、 圆整、 清晰， 表明为方法简便、 可行。附三批样品的 TLC 图谱 5， 补骨脂素对照 品由中国药品生物制品检定所提供， 批号 ： 110739-200209。图中， 1、 补骨指素对照品 2、 3、 4 三批样品 5、 阴性样品。 0066 实验例 4 当归药材中的有效成分阿魏酸含量测定 0067 宫炎平胶囊由地稔、 两面针、 当归、 五指毛桃、 穿破石五味药组成， 现拟定含量测定 项以进一步控制本品质量。 地稔为方中君药， 由于地稔药材基础研究薄弱， 有效成分不甚明 确， 难以准确定量。 而。
36、两面针具有行气止痛， 活血化瘀， 祛风通络的功效， 但对其有效成分氯 化两面针碱采用 HPLC 方法进行了含量测定， 结果因本制剂试品中的氯化两面针碱含量极 低， 难以准确定量， 故转为对当归药材中的有效成分阿魏酸进行含量测定方法研究， 结果该 法具有准确、 重现性好、 专属性强， 快捷简便等特点， 可用于控制本品的内在质量。 0068 一、 当归药材阿魏酸含量测定 0069 表 1 十批当归药材阿魏酸含量测定结果 0070 0071 根据十批当归药材阿魏酸测定结果， 我公司制定当归药材内控质量标准阿魏酸含 量不得少于 0.01。 0072 二、 样品中阿魏酸的含量测定 0073 (1) 仪器。
37、与试药 0074 Agilent G1311A Qual Pump， G1314S VWD， G1379ADEGASSER， AT-330 柱 温 箱， Thermo-C18(250mm4.6mm， 5um) 色谱柱， 塞多利斯全自动电子天平， SG2200H 超声波清洗 器。 0075 阿魏酸对照品由中国药品生物制品检定所提供 ( 含量测定用 )， 批号 0773-9910。 0076 乙腈为色谱纯， 水为蒸馏水， 其它试剂均为分析纯。 说 明 书 CN 103983735 A 9 7/10 页 10 0077 (2) 色谱条件 0078 色谱柱 ： 十八烷基键合硅胶柱 (ODS)4.625。
38、0mm ； 流动相 ： 乙腈 -1冰醋酸 (15 85) ； 检测波长 ： 323nm ； 室温 ； 流速 1.0ml/min。理论板数均大于 1500。 0079 照此条件分析， 制剂中的阿魏酸的主峰和其它组分均能达到基线分离， 其中阿魏 酸的保留时间为 17.8 分。 0080 (3) 检测波长的确定 0081 取阿魏酸对照品溶液在上述色谱条件下进行检测， 在主峰浓度最高时进行停泵紫 外扫描， 得吸收曲线， 其最大吸收峰为 323nm， 与文献报道一致， 因此选用 323nm 波长作为检 测波长。 0082 (4) 供试品溶液的制备 0083 阿魏酸可溶于甲醇、 乙醇， 易溶于乙醚中， 曾。
39、采用甲醇直接超声提取， 因本品中阿 魏酸的含量较低， 要准确定量供试品的量需加大， 这样供试品溶液的颜色很深， 直接进样色 谱柱易受损， 故需进一步进行处理。本文则采用水超声提取， 然后用盐酸调节 PH 值至 2， 使 阿魏酸充分游离， 用乙醚将其从水中萃取出来， 再用 5碳酸氢钠溶液萃取， 盐酸调 PH 值至 2， 乙醚萃取， 这样提出的样品的颜色淡， 杂质少， 且响应高， 易于准确定量。 0084 (5) 空白试验 0085 按处方取去当归药材的阴性样品， 照正文中含量测定方法进行测定， 比较供试品 溶液色谱及阿魏酸对照品溶液色谱， 结果阴性样品中其他成分对阿魏酸色谱峰无干扰。 0086 。
40、(6) 线性关系的考察 0087 精密称取经五氧化二磷减压干燥 24 小时的阿魏对照品 11.6mg， 置 50ml 棕色量瓶 中， 加甲醇溶解， 并稀释至刻度， 摇匀 (232g/ml)， 再分别精密吸取 0.5ml， 1ml， 2ml， 3ml， 6ml 分别置于 50ml 的棕色量瓶中， 用甲醇稀释至刻度。配制成不同浓度的对照品溶液 ： 1.55g/ml、 3.10g/ml、 6.20g/ml、 9.28g/ml、 18.56g/ml。分别精密吸取上述不同 浓度对照品溶液各 20l， 照正文中方法测定， 结果见表 2。 0088 表 2 线性关系考察结果 0089 0090 以峰面积积分。
41、值为纵坐标， 阿魏酸量为横坐标绘制标准曲线， 计算得回归方程 ： Y 5419.1X-3.72， r 1.0000。表明阿魏酸量在 0.031g 0.3712g 范围内具有良好 线性关系。 0091 (7) 稳定性试验 0092 取上述标准曲线项下的对照品溶液 (6.20g/ml) 和供试品溶液各 20l， 注入液 相色谱仪， 每隔一定时间进样测定一次， 在避光放置 8 小时内， 峰面积基本一致。表明阿魏 对照品溶液和供试品溶液在避光放置 8 小时内稳定。( 见表 3、 4) 0093 表 3 对照品溶液稳定性试验结果 0094 说 明 书 CN 103983735 A 10 8/10 页 1。
42、1 0095 表 4 样品溶液稳定性试验结果 0096 0097 0098 (8) 精密度试验 0099 精密吸取对照品溶液 (9.28g/ml)， 重复进样 5 次， 阿魏酸面积积分值的相对标 准偏差小于 2， 表明此法精密度良好。( 见表 5) 0100 表 5 精密度试验结果 0101 0102 (9) 重现性试验 0103 分别取同一批样品 5 份， 按正文中含量测定项下方法试验， 测定阿魏酸的含量， 结 果见表 6， 阿魏酸含量的相对标准偏差小于 2， 表明此法重现性良好。 0104 表 6 重现性试验结果 0105 说 明 书 CN 103983735 A 11 9/10 页 12。
43、 0106 (10) 回收率试验实测阿魏酸量 - 取样相当阿魏酸量 0107 加入阿魏酸对照品量 0108 采用加样回收法。 取同一批已知含量的宫炎平胶囊(含量14.27g/g)， 精密称取 研细样品约 5g， 共 5 份， 各精密加入阿魏酸对照品溶液 (78g/ml)1ml， 再按正文中含量测 定项下方法测定阿魏酸含量。结果见表 7， 平均回收率为 9542。 0109 0110 表 7 回收率试验结果 0111 0112 (11) 样品含量测定及限度制定 0113 取本品 10 批， 按正文方法测定含量， 结果见表 8 0114 表 8 说 明 书 CN 103983735 A 12 10/10 页 13 0115 0116 根据上述测定结果， 暂定本品每粒含阿魏酸不得低于 2.5g。本品每粒含当归以 阿魏酸 (C10Hl0O4) 计， 不得少于 2.5g。 说 明 书 CN 103983735 A 13 1/2 页 14 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103983735 A 14 2/2 页 15 图 5 说 明 书 附 图 CN 103983735 A 15 。