《一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103900981 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103900981 A (21)申请号 201410154007.9 (22)申请日 2014.04.14 G01N 21/31(2006.01) (71)申请人 西北农林科技大学 地址 712100 陕西省杨凌西农路 22 号 (72)发明人 曹阳春 姚军虎 王腊梅 魏筱诗 李宗军 孙菲菲 刘凯 曹志昂 王卫涛 李飞 (54) 发明名称 一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法 (57) 摘要 本发明涉及一种发酵液中木聚糖酶的快速 测定方法， 包括以下步骤 ： 将发酵液 1000g 离 心 10min。
2、， 取上清液测定木聚糖酶活性， 将适当稀 释的上清液、 10g/L 木聚糖溶液和 50mM 磷酸钠缓 冲液 (pH7.0) 置于 39预热 15-30min， 然后向 75L 稀释后的上清液中加入 75L 磷酸钠缓冲 液和50L木聚糖溶液， 39反应15-30min后， 加 入300L DNS溶液终止反应。 沸水浴 5min 后， 冷 却至室温。取 200-300L 于干燥洁净的 96 孔酶 标板上， 用全自动酶标仪在 530-550nm 下检测吸 光值， 根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。 本 发明技术修订了发酵液中木聚糖酶的测定方法， 可快速大量且准确的测定木聚糖酶活性， 减少人 为误差。
3、。同时， 较少的样品量即可检测。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103900981 A CN 103900981 A 1/1 页 2 1. 一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法， 其特征在于 ： 具体方法为 ： 将发酵液在 1000g 离心 10min， 取上清液测定木聚糖酶活性， 将适当稀释的上清液、 10g/L 木聚糖溶液 和 50mM 磷酸钠缓冲液 (pH7.0) 置于 39预热 15-30min， 然后向 75L 稀释后的。
4、上清液中 加入 75L 磷酸钠缓冲液和 50L 木聚糖溶液， 39反应 15-30min 后， 加入 300L DNS 溶 液终止反应 ； 沸水浴 5min 后， 冷却至室温 ； 取 200-300L 于干燥洁净的 96 孔酶标板上， 用 全自动酶标仪在 530-550nm 下检测吸光值， 根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。 2. 根据权利要求 1 所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法， 其特征在于 ： 所述 10g/ L 木聚糖溶液的配制方法为 ： 准确称取 10g 木聚糖标准品溶于 800mL 去离子水中， 然后定容 至 1L。 3. 根据权利要求 1 所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方。
5、法， 其特征在于 ： 所述 50mM 磷酸钠缓冲溶液为 pH7.0 的磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲液， 配制方法为 ： 200mM 磷酸氢二 钠溶液， 称取28.396g磷酸氢二钠， 用去离子水充分溶解， 并定容至1L ； 200mM磷酸二氢钠溶 液， 称取 23.996g 磷酸二氢钠， 用去离子水充分溶解， 并定容至 1L ； 将 200mM 磷酸氢二钠和 磷酸二氢钠溶液分别用去离子水稀释至 50mM， 所述磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液的使用比 例为 61 39。 4. 根据权利要求 1 所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法， 其特征在于 ： 所述 DNS 溶液的配制方法为 ： 将10g的3。
6、,5-二硝基水杨酸溶于800mL去离子水中， 然后依次加入10g 氢氧化钠、 208g 酒石酸钾钠、 2.0g 苯酚和 0.5g 亚硫酸氢钠， 溶解并搅拌均匀后， 定容至 1L。 5.根据权利要求5所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法， 其特征在于 ： DNS溶液需 要置于棕色瓶中避光保存。 6. 根据权利要求 1 所述的发酵液中木聚糖酶的快速测定方法， 其特征在于 ： 木聚糖酶 的 1 个酶活力单位 (U) 可被定义为在上述酶促反应条件下， 1mL 检测发酵液在 1min 内自标 准底物木聚糖中释放 1mol 木糖所需的酶量。 权 利 要 求 书 CN 103900981 A 2 1/3 页。
7、 3 一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法 技术领域 0001 本发明涉及一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 木聚糖是一种多聚五碳糖， 是植物半纤维素的重要组分， 它占植物碳水化合物总 量的三分之一， 在自然界中是继纤维素之后含量第二丰富的再生生物质资源。虽然木聚糖 是一类广泛存在于植物体内的半纤维素， 但是， 由于木聚糖在动物消化道内不能被消化吸 收， 同时提高食糜的黏稠度， 阻碍营养物质， 尤其是脂肪和蛋白质的消化吸收， 并且降低饲 料的转化率， 具有很强的抗营养特性， 因而限制了许多饲料的应用。 木聚糖酶可将木聚糖逐 次降解为低聚木糖及木糖， 从而。
8、消除木聚糖的抗营养作用， 提高动物对饲料的利用率， 降低 胃肠道食糜的粘性， 减少畜禽肠道疾病， 增进畜禽健康， 提高畜禽成活率， 减少粘粪， 降低空 气中氨气和硫化物浓度， 减少环境污染， 使畜禽体重均匀。同时， 木聚糖酶的应用也为缓解 能量饲料资源的短缺、 开辟非常规饲料资源提供了新的途径。 因此， 木聚糖酶在饲料资源开 发和提高廉价副产品的利用率方面， 具有广阔的前景。 0003 测定木聚糖酶活力的方法主要有以下 3 种 ： 黏度法、 底物染色法和还原糖法。黏 度法是通过测定木聚糖酶对底物黏度的降解速度来计算酶活力， 这种测定分析方法有较好 的实用价值， 但是测定过程比较繁琐， 而且重复。
9、性较差， 目前很少采用。底物染色法是一种 比较简便快速的测定方法， 其基本原理是以木聚糖为基质， 用胶联方式连接和包裹特定的 染料， 制成染料含量均衡， 质量稳定的片剂。这种片剂容易溶于水溶液中， 与木聚糖酶反应 后， 长链木聚糖被降解， 结合的染料分子被释放到溶液中， 通过测定溶液中染料浓度就可以 就算出酶活。 这种测定方法经常被一些检测分析专业生产生物酶的大型企业采用， 但是， 它 只能测定特定的木聚糖酶活力， 不具有代表性。还原糖法是通过测定还原糖产量来计算酶 活。这种分析方法比较简便， 而且重复性也比较好。国内外关于木聚糖酶的研究报告多数 采用这种方法， 它的不足是测定速度较慢， 分光。
10、光度计每次仅能分析一个样品。 发明内容 0004 现有木聚糖酶测定方法费时费力， 一次仅能检测一个样品， 所以人为误差较大。 本 发明的目的在于克服现有技术的缺点和不足， 优化木聚糖酶检测方法， 建立新的反应体系， 每个反应可同时最大检测 96 个样品， 大大提高了木聚糖酶检测速度， 同时降低人为测定误 差。 0005 为了实现上述目的， 本发明的技术方案如下。 0006 一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法， 具体方法为 ： 将发酵液在 1000g 离心 10min， 取上清液测定木聚糖酶活性， 将适当稀释的上清液、 10g/L 木聚糖溶液和 50mM 磷酸 钠缓冲液 (pH7.0) 置于 3。
11、9预热 15-30min， 然后向 75L 适当稀释的上清液中加入 75L 磷酸钠缓冲液和 50L 木聚糖溶液， 39反应 15-30min 后， 加入 300L 的 DNS 溶液终止反 应。沸水浴 5min 后， 冷却至室温。取 200-300L 于干燥洁净的 96 孔酶标板上， 用全自动 说 明 书 CN 103900981 A 3 2/3 页 4 酶标仪在 530-550nm 下检测吸光值， 根据木糖的标准曲线计算木聚糖酶活性。 0007 进一步地， 所述10g/L木聚糖溶液的配制方法为 ： 准确称取10g木聚糖标准品溶于 800mL 去离子水中， 然后定容至 1L。 0008 进一步地。
12、， 所述 50mM 磷酸钠缓冲溶液为 pH7.0 的磷酸氢二钠 - 磷酸二氢钠缓冲 液， 配制方法为 ： 200mM 磷酸氢二钠溶液， 称取 28.396g 磷酸氢二钠， 用去离子水充分溶解， 并定容至1L ； 200mM磷酸二氢钠溶液， 称取23.996g磷酸二氢钠， 用去离子水充分溶解， 并定 容至 1L ； 将 200mM 磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液分别用去离子水稀释至 50mM， 所述磷酸氢 二钠和磷酸二氢钠溶液的使用比例为 61 39。 0009 进一步地， 所述 DNS 溶液的配制方法为 ： 将 10g 的 3,5- 二硝基水杨酸溶于 800mL 去离子水中， 然后依次加入 10g。
13、 氢氧化钠、 208g 酒石酸钾钠、 2.0g 苯酚和 0.5g 亚硫酸氢钠， 溶解并搅拌均匀后， 定容至 1L。 0010 进一步地， 所述 DNS 溶液需要置于棕色瓶中避光保存。 0011 进一步地， 木聚糖酶的 1 个酶活力单位 (U) 可被定义为在上述酶促反应条件下， 1mL 检测发酵液在 1min 内自标准底物木聚糖中释放 1mol 木糖所需的酶量。 0012 该发明的有益效果在于 ： 本发明技术修订了发酵液中木聚糖酶的测定方法， 可快 速大量且准确的测定木聚糖酶活性， 减少人为误差。同时， 较少的样品量即可检测。 附图说明 0013 图 1 本发明实施例中所测定的木聚糖酶活性标准曲。
14、线。 具体实施方式 0014 下面结合实施例对本发明的具体实施方式进行描述， 以便更好的理解本发明。 0015 实施例 0016 一种发酵液中木聚糖酶的快速测定方法， 配制木糖标准溶液， 制作测定木聚糖酶 活性标准曲线， 结果如图 1 所示。曲线关系为 ： Y 95.281X+3.7833(R2 0.9952)， 其中 Y 为木聚糖含量 (g)， X 为吸光度。 0017 具体选择小麦秸秆、 玉米秸秆、 水稻秸秆和羊草四种粗饲料作为底物。称取 80mg 底物和量取9.0mL培养基入亨盖特培养管中， 121湿热灭菌20min。 厌氧条件下接种真菌， 接种后的培养基在39下连续培养5天， 每种底物。
15、4个重复。 同时， 在培养过程中每种底物 都有底物空白和对照。培养 5 天， 4下 1000g 离心 10min 后， 测定管中发酵液中木聚糖 酶活性。结果如表 1 所示。 0018 表 1 厌氧真菌以不同饲料为底物 5 天培养后对发酵液中木聚糖酶活性的影响 0019 0020 其中， a， b- 同行数据后字母标注不同者差异显著 (P0.05)， S.E.M 平均数标准 差。 0021 以上所述是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人员 说 明 书 CN 103900981 A 4 3/3 页 5 来说， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也视为 本发明的保护范围。 说 明 书 CN 103900981 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103900981 A 6 。