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1、(10)申请公布号 CN 103893215 A (43)申请公布日 2014.07.02 CN 103893215 A (21)申请号 201410156238.3 (22)申请日 2014.04.17 CGMCC No7696 2013.06.09 A61K 35/74(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A23C 9/12(2006.01) A23G 9/40(2006.01) (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路 88 号 (72)发明人 顾瑞霞 刘东 黄玉军 陈霞 陈大卫 郭飞翔 赵堂彦 蒋欣荣 (74)专利代理机构 南京知识律师事务。
2、所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称 干酪乳杆菌 grx12 在制备治疗慢性酒精性肝 损伤产品中的应用 (57) 摘要 本发明涉及一株人源干酪乳杆菌 grx12 在慢 性酒精性肝损伤方面的应用。本发明的干酪乳杆 菌 grx12 菌株是从江苏如皋长寿村人群肠道中 分离获得的具有显著体外抗氧化能力的益生菌 菌株， 该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物菌种保藏中心， 保藏号 ： CGMCC No.7696。 本发明的干酪乳杆菌grx12能显著降低 酒精性肝损伤大鼠血脂、 血清内毒素水平 ； 降低 肝脏炎性因子的表达， 缓解肝脏炎症反应， 对慢性 酒精性肝损伤表现出明显。
3、的保护作用。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103893215 A CN 103893215 A 1/1 页 2 1. 干酪乳杆菌 grx12 在制备治疗慢性酒精性肝损伤药物中的应用。 2. 干酪乳杆菌 grx12 在制备具有缓解酒精性肝损伤功能的发酵乳制品及功能食品中 的应用。 权 利 要 求 书 CN 103893215 A 2 1/7 页 3 干酪乳杆菌 grx12 在制备治疗慢性酒精性肝损伤产品中的。
4、 应用 技术领域 0001 本发明涉及微生物技术领域， 特别涉及一株对慢性酒精性肝损伤有保护作用的人 源干酪乳杆菌 grx12 在发酵乳制品、 功能食品及药品方面的应用。 技术背景 0002 由于长期大量饮酒所致的慢性肝脏疾病是造成人类肝脏损伤的重要原因之一， 而 在我国， 随着人民生活水平的提高， 酗酒者增多， 长期酗酒也成为继病毒性肝炎后导致肝损 伤的第二大病因。 酒精性肝损伤初期通常表现为脂肪肝， 进而可发展成酒精性肝炎、 酒精性 肝纤维化和酒精性肝硬化。 因此探寻酒精性肝病的发病机制和防治干预措施具有十分重要 的意义。 0003 酒精性损伤的发病机制较为复杂， 其主要原因是乙醇在肝细胞。
5、内代谢产生的毒性 代谢产物以及由此引起的代谢紊乱， 也与内毒素、 活性氧自由基、 炎性因子等的损伤作用有 关。具体为 ：（1） 乙醛的毒性作用。乙醇在肝细胞中代谢成乙醛时形成的乙醛蛋白加合物 不但会改变蛋白质的结构， 影响其功能， 也会引起自身免疫反应。 （2） 内毒素。长期大量摄 入酒精会导致肠道菌群失调， 肠道通透性增加， 使内毒素大量进入血液， 并可激活 Kupffer 细胞产生炎性因子， 导致肝脏炎症反应。 （3） 活性氧自由基的损伤。乙醇代谢生成大量活性 氧自由基， 损害细胞 DNA、 蛋白质和磷脂， 加剧肝损伤。 （4） 炎性因子的损伤。炎性因子诱发 的炎症反应在酒精性肝损伤的发展。
6、中发挥了十分重要的作用。 0004 目前， 对酒精性肝损伤的防治措施也多基于其发病机制， 如戒酒、 营养治疗、 抗氧 化剂、 抗内毒素制剂等。 药物治疗也多基于抗氧化作用从而改善酒精所致的氧化应激， 但药 物的摄入可能进一步加重肝脏负担， 并且存在一定的不良反应和毒副作用。寻找更为安全 有效的干预措施就尤为迫切。 0005 益生菌具有广泛的生理活性， 如益生菌可调节肠道菌群， 降低内毒素含量 ； 可有效 清除自由基， 增强机体的抗氧化能力 ； 可增强机体免疫力。 益生菌的这些生理活性提示人们 其对酒精性肝损伤的缓解可能有一定作用。而且， 应用于人类的益生菌一般来自于健康人 体本身， 安全性极高。
7、。 但目前有关益生菌缓解酒精性肝损伤的研究报道相对较少， 而市场上 相关的保健食品更是鲜见。因此， 利用益生菌及其产品来缓解酒精性肝损伤具有重要的研 究意义和广阔的市场前景。 0006 本发明从江苏如皋长寿村人群肠道中分离获得具有显著体外抗氧化活性的专利 益生菌干酪乳杆菌 grx12 ； 该菌株在申请号 2013103127847 的中国申请专利中已公开， 但未揭示在慢性酒精性肝损伤方面的保护作用。 发明内容 0007 本发明的目的是提供干酪乳杆菌在 grx12 酒精性肝损伤方面的应用， 特别是在长 期大量摄入酒精所致的慢性酒精性肝损伤治疗与康复中的应用。 说 明 书 CN 103893215。
8、 A 3 2/7 页 4 0008 本发明所述的干酪乳杆菌是， 该菌株已于 2013 年 6 月 9 日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心 （地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物研究所） ， 分类命名为发酵乳杆菌 Lactobacillus casei， 保藏号 ： CGMCC No.7696。 0009 本发明公开了干酪乳杆菌 grx12 在制备治疗慢性酒精性肝损伤药物中的应用。 0010 本发明进一步提供了干酪乳杆菌 grx12 在制备具有缓解酒精性肝损伤功能的发 酵乳制品及功能食品中的应用。 0011 本发明的干酪乳杆菌 grx12。
9、 能显著降低酒精性肝损伤大鼠血脂、 血清内毒素水 平 ； 降低肝脏炎性因子的表达， 缓解肝脏炎症反应， 对慢性酒精性肝损伤表现出明显的保护 作用。 附图说明 0012 图 1 为干酪乳杆菌 grx12 对大鼠血清 ALT、 AST 含量的影响。注 ： a、 b 为同一指标 不同处理组分别为与空白组、 模型组相比， P0.05。 0013 图 2 为干酪乳杆菌 grx12 对大鼠血清 TC、 TG 含量的影响 ； 注 ： a、 b 为同一指标不同 处理组分别为与空白组、 模型组相比， P0.05 0014 图 3 为干酪乳杆菌 grx12 对大鼠血清 SOD 活性的影响 ； 注 ： a、 b 为。
10、同一指标不同处 理组分别为与空白组、 模型组相比， P0.05。 0015 图4为干酪乳杆菌grx12对大鼠血清内毒素含量的影响 ； 注 ： a、 b为同一指标不同 处理组分别为与空白组、 模型组相比， P0.05。 具体实施方式 0016 1. 干酪乳杆菌 grx12 的培养 0017 将干酪乳杆菌 grx12 在 MRS 液体培养基中活化 3 代后的菌液于 6000r/min 离心 10min 收集菌体， 并用灭菌生理盐水清洗菌体 2 次， 在菌体沉淀中加入 10% 的灭菌脱脂乳作 为冻存保护剂， 调整其菌数为 1.0109mL-1， 混匀后用 MRS 固体培养基确认活菌数。按每日 需要量。
11、分装， 于 -80保存。使用前 37水浴 30min。 0018 2. 动物分组与慢性酒精性肝损伤模型的建立 0019 Wistar 大鼠， 40 只， 雄性 140 160g， 由扬州大学比较医学中心提供。许可证 ： SCXK( 苏 )2007-0001。采用标准配方杆状饲料饲养大鼠于扬州大学标准化动物房内， 湿度 40% 50%， 室温 232， 自然光照， 自由采食和饮水。 0020 大鼠适应性饲养一周后， 随机分为 4 组， 每组 10 只， 分别为 ： 空白组， 模型组， 药物 组， 干酪乳杆菌 grx12 组。采取一天两次的灌胃方式 ： 上午灌胃酒精， 下午灌胃益生菌液或 药物， 。
12、两次灌胃间隔 8h。 0021 慢性酒精性肝损伤模型的建立 ： 酒精灌胃按酒精浓度递增法， 浓度按30%35% 40% 45% 逐渐增加， 在 2 周内增至 40%， 持续灌胃 6 周， 之后增至 45% 直至实验结束。药物 组采用东宝甘泰 （含东宝甘泰 0.06g/mL） 。所有样品均按 0.1mL/10g.d 剂量灌胃， 实验时间 为 10 周。 0022 具体分组及处理见表 1。 说 明 书 CN 103893215 A 4 3/7 页 5 0023 表 1 动物分组及处理 0024 0025 3. 干酪乳杆菌 grx12 对大鼠慢性酒精性肝损伤的保护作用 0026 3.1 干酪乳杆菌 。
13、grx12 对大鼠主要脏器指数的影响 0027 脏器指数为脏器与体重的比值， 可一定程度反映实验动物的营养状态及脏器的健 康状态。 酒精对脏器造成的影响中， 对肝脏的影响尤为明显。 末次灌胃后， 禁食不禁水12h， 取肝脏、 脾脏、 肾脏和心脏， 计算各组大鼠的脏器指数。大鼠主要脏器指数见表 2。 0028 表 2 大鼠主要脏器指数 0029 组别肝指数 (%)心指数 (%)脾指数 (%)肾指数 (%) 空白组2.830.130.350.020.190.040.690.05 模型组3.110.17a0.350.040.180.030.700.03 药物组3.000.15a0.370.040.1。
14、70.020.700.05 grx12 组2.830.08b0.340.020.170.030.690.06 0030 注 ： a、 b 为同一指标不同处理组分别为与空白组、 模型组相比， P0.05 0031 由表 2 可知， 模型组大鼠肝指数较空白组显著增加 （P0.05） ， 说明长期大量的酒 精摄入造成了肝脏肿胀， 变大。而通过益生菌 grx12 干预后， 可改善酒精对肝脏造成的损 伤， 使其恢复至正常水平。 0032 从表 2 也可知， 模型组的心指数、 脾指数和肾指数与空白组均无显著差异 ； grx12 组与空白组、 模型组相比， 也无显著差异。 0033 3.2 干酪乳杆菌 gr。
15、x12 对大鼠血清 ALT 和 AST 水平的影响 0034 AST 和 ALT 主要存在于肝细胞胞浆内， 当肝脏遭受损伤时， 肝细胞内的转氨酶可进 入血液中， 引起血液中 ALT 和 AST 的升高， 因此常用 ALT 和 AST 水平来反映肝细胞损伤以及 判断损伤程度。血清中 ALT 和 AST 的水平是反映乙醇所致肝损伤最敏感的指标。且在酒精 性肝损伤中， AST 较 ALT 敏感， 能反映肝损伤程度。末次灌胃后， 禁食不禁水 12h， 摘眼球取 血， 将所取血液于 4静置 30min 后， 4， 3000r/min 离心 15min， 取上清即为血清。采用日 立 7020 型全自动生化。
16、分析仪测定了大鼠血清中 ALT 和 AST 水平， 结果如图 1 所示。 0035 由图 1 可知， 与空白组相比， 模型组大鼠血清中的 ALT 和 AST 含量明显升高， 与 空白组有显著差异 （P0.05） ， 说明酒精对肝脏损伤较为严重 ； 在灌胃东宝甘泰和益生菌 grx12 后， ALT 和 AST 均有不同程度改善， 尤其是 AST 含量显著降低， 说明益生菌 grx12 和药 物均能有效抑制酒精性肝损伤大鼠血清转氨酶的升高， 从而改善酒精对肝脏的损伤程度。 说 明 书 CN 103893215 A 5 4/7 页 6 0036 3.3 干酪乳杆菌 grx12 对大鼠血清 TC 和 。
17、TG 水平的影响 0037 长期大量摄入酒精后， 影响肝脏对脂类的代谢能力， 脂肪酸的分解受到抑制而合 成增加， 从而导致脂肪在肝细胞内堆积， 形成脂肪肝， 使肝脏产生脂肪泡， 进而引起血脂水 平的升高。酒精诱发的脂肪肝以甘油三酯 （TG） 沉积为主， 此外多数酒精肝患者也存在不同 程度的高胆固醇症状， 因此测定血清中 TG 和 TC 含量也可一定程度反映酒精对肝脏的损伤 程度。采用日立 7020 型全自动生化分析仪测定了大鼠血清中 TC 和 TG 水平， 结果如图 2 所 示。 0038 由图 2 可知， 与空白组相比， 模型组大鼠的血脂水平显著升高 （P0.05） ， 而灌胃 药物、 gr。
18、x12 则能使其不同程度的降低， 其中益生菌 grx12 效果较好， 与空白组无显著差 异。与 TC 相比， 药物对 TG 的改善效果更为明显， 如与模型组相比， 药物组 TG 含量显著降低 （P0.05） ， 而 TC 含量有所降低， 但差异不大。3.4 干酪乳杆菌 grx12 对大鼠血清 SOD 含量的 影响 0039 SOD 是体内重要的抗氧化酶， 可以有效清除自由基， 保护细胞免受损伤。采用日立 7020 型全自动生化分析仪测定了大鼠血清中 SOD 酶活性， 结果如图 3 所示。 0040 由图 3 可知， 与空白组相比， 模型组 SOD 活性显著降低 （P0.05） ， 说明长期大量。
19、 摄入酒精， 大鼠体内的 SOD 因清除大量自由基和脂质过氧化物而大量消耗。而通过益生菌 grx12 干预后， 大鼠血清 SOD 含量显著高于模型组 （P0.05） ， 甚至超过了空白组水平。药物 干预能一定程度提高慢性酒精性肝损伤大鼠血清 SOD 含量， 但与模型组差异不显著。 0041 3.5 干酪乳杆菌 grx12 对大鼠血清内毒素含量的影响 0042 内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖成分， 会引起严重的炎症级联反 应。按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书， 采用酶联免疫测定法对大鼠血清中内毒 素含量进行了测定， 结果如图 4 所示。 0043 由图 4 可知， 与空白组相比，。
20、 模型组和药物组的内毒素含量显著升高， 差异非常显 著 （P0.05） ， 内毒素含量分别是空白组的2.83倍和2.44倍， 说明长期大量摄入酒精导致了 严重的内毒素血症， 也从另一面反映了内毒素对酒精性肝损伤的作用。 而摄入益生菌grx12 后， 内毒素含量均极大降低 （P0.05） ， grx12 组血清内毒素含量甚至略低于空白组。说明益 生菌的补充和在肠道的定植能有效抑制有害菌群， 使革兰氏阴性菌数量大大减少， 所以内 毒素含量也随之显著降低。 0044 3.6 干酪乳杆菌 grx12 对大鼠肝脏氧化指标的影响 0045 正常状态下， 机体内的 SOD、 GSH 和 GSH-Px 等抗氧。
21、化物共同作用， 能有效清除体内 自由基和抵抗脂质过氧化反应， 使机体维持氧化还原平衡状态。但长期大量摄入酒精促使 机体产生过量的自由基， 使得肝细胞内的GSH含量显著下降甚至耗竭， 也造成SOD和GSH-Px 活性随之降低， 加剧了自由基对肝脏的损害。 0046 制备大鼠肝脏 10% 肝匀浆， 并于 4， 3000r/min 离心 15min， 取上清即为 10% 肝匀 浆上清液。大鼠 10% 肝匀浆上清液中 MDA、 SOD、 GSH 和 GSH-Px 含量的测定均按照南京建成 生物工程研究所试剂盒说明书的具体步骤进行， 结果见表 3。 0047 表 3grx12 对大鼠肝脏氧化指标的影响 。
22、0048 说 明 书 CN 103893215 A 6 5/7 页 7 组别MDA(nmol/mgprot)SOD(U/mgprot)GSH(mg/gprot)GSH-Px 酶活力 空白组9.770.64104.5620.886.570.8170.8212.72 模型组12.241.97a91.276.69a3.240.64a49.4212.30a 药物组9.342.99b93.225.49a5.090.47ab57.407.54ab grx12 组9.851.99b102.8415.99b5.920.15ab63.277.85ab 0049 注 ： a、 b 为同一指标不同处理组分别为与空白。
23、组、 模型组相比， P0.05 0050 由表 3 可知， 长期大量酒精的摄入诱导体内能发挥抗氧化功能的 SOD、 GSH 和 GSH-Px 含量显著降低， 与空白组相比分别降低了 12.71%， 50.68% 和 30.22%。而相应的， 模 型组大鼠肝脏脂质过氧化产物含量则显著升高。药物和益生菌 grx12 的干预则可以显著提 高 SOD、 GSH 和 GSH-Px 含量， 降低 MDA 含量。其中东宝甘泰抗脂质过氧化效果较好， 药物组 MDA 含量甚至低于空白组。grx12 组的 GSH-Px 含量、 SOD 和 GSH 含量则明显超过了药物组。 0051 3.7 干酪乳杆菌 grx12。
24、 对大鼠肝脏 ADH 和 ATP 酶活性的影响 0052 酒精在体内有三条主要的代谢途径， 其中之一就是肝细胞内的ADH通路。 ADH活性 的降低会影响肝脏对酒精的正常代谢， 导致乙醇及其代谢产物在肝脏大量累积而造成肝脏 损伤。肝脏中的 ATP 酶主要存在于线粒体中， 脂质过氧化反应可激活磷脂酶 C、 磷脂酶 D 分 解线粒体膜磷脂， 改变其流动性和通透性， 使膜Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase等的脂质微 环境失常， 影响其功能， 并导致 ATP 减少， 从而进一步加剧酒精对肝脏的损伤。大鼠 10% 肝 匀浆上清液中ADH和ATP酶含量的测定均按照南京建成生物工程研究所试剂盒。
25、说明书的具 体步骤进行， 结果见表 4。 0053 表 4grx12 对大鼠肝脏 ADH、 ATP 酶的影响 0054 组别ADH(U/mgprot)Na+-K+-ATPase(U/mgprot)Ca2+-ATPase(U/mgprot) 空白组64.4716.765.670.857.000.30 模型组36.1311.14a3.560.59a2.140.04a 药物组62.1615.19b5.021.92b6.020.51ab grx12 组74.6517.63ab6.630.52ab6.900.41b 0055 注 ： a、 b 为同一指标不同处理组分别为与空白组、 模型组相比， P0.0。
26、5 0056 由表 4 可知， 大鼠长期摄入大量酒精后， 肝脏中的 ADH 水平大大降低， 与空白组相 比， 降低了 43.96%。同样的， 肝脏中的 Na+-K+-ATPase 和 Ca2+-ATPase 含量也明显降低， 与空 白组相比， 分别下降了37.21%和69.43%。 而药物和益生菌grx12的干预则显著提高了肝脏 ADH、 Na+-K+-ATPase 和 Ca2+-ATPase 含量。grx12 组作用效果较好， 明显优于药物组。 0057 3.8 干酪乳杆菌 grx12 对大鼠肝脏细胞因子的影响 说 明 书 CN 103893215 A 7 6/7 页 8 0058 细胞因子。
27、是机体防御系统的重要组成部分， 既是免疫反应的产物， 又可以增强免 疫反应， 促进肝细胞损伤。 在酒精性肝病的发病机制中， 酒精可通过多种途径导致机体巨噬 细胞功能异常、 脂肪组织的蓄积、 氧化应激的产生和内毒素的产生， 进而刺激炎性细胞释放 各种细胞因子和炎性介质， 导致肝细胞损伤及肝脏炎性反应。大鼠 10% 肝匀浆上清液中细 胞因子含量的测定均按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书的具体步骤进行， 结果见 表 5。 0059 表 5grx12 对大鼠肝脏细胞因子的影响 0060 注 ： a、 b 为同一指标不同处理组分别为与空白组、 模型组相比， P0.05 0061 由表 5 可知， 模。
28、型组大鼠肝脏 TNF-、 IL-6 和 VEGF 水平较空白组显著升高， 表明 大鼠长期大量摄入酒精后， 肝脏发生了明显的炎症反应， 导致了严重的肝损伤。并且， VEGF 含量的升高促进了 TNF- 和 IL-6 的释放。通过药物和益生菌 grx12 干预后， TNF-、 IL-6 和 VEGF 水平有明显降低， 其中 grx12 组降低 TNF- 和 IL-6 水平效果较好， 显著优于药物 组。 0062 与空白组相比， 模型组大鼠肝脏TGF-1水平显著升高， 益生菌grx12组大鼠肝脏 TGF-1 水平与模型组相比则显著降低， 而药物降低 TGF-1 水平的效果则较弱。 0063 与空白组。
29、相比， 模型组大鼠肝脏 NF-B 水平显著升高， 益生菌 grx12 组大鼠肝脏 NF-B 水平与模型组相比则显著降低， 与空白组无显著差异。药物组效果则较弱， NF-B 水平与模型组相比无显著差异。 0064 3.9 组织切片观察 0065 综上所述， 干酪乳杆菌 grx12 活菌制剂灌胃慢性酒精性肝损伤大鼠后， 能够显著 改善慢性酒精性肝损伤大鼠肝功能， 抗氧化指标 ； 降低血脂， 血清内毒素水平 ； 降低肝脏炎 性因子的表达， 缓解肝脏炎症反应， 从而对慢性酒精性肝损伤有明显保护作用。 并且其对慢 性酒精性肝损伤的缓解作用明显优于药物的作用。实施例 1 ： 干酪乳杆菌 grx12 益生菌。
30、发 酵剂的制备 0066 将干酪乳杆菌 grx12 原始菌种接种于 12% 的脱脂乳 （115灭菌 20min） 中， 37培 养 18 24h 至凝乳， 连续活化两代， 作为母发酵剂。将母发酵剂按 3% 5% 接种量接种于 12% 的脱脂乳 （115灭菌 20min） 中， 37培养 18 24h 至凝乳， 此时活菌数可达到 109 1010cfu/mL， 即得到干酪乳杆菌 grx12 发酵剂。 0067 实施例 2 ： 利用干酪乳杆菌 grx12 和嗜热链球菌 grx02 混合发酵制备对酒精性肝 损伤具保护作用的功能性发酵乳 0068 嗜热链球菌 grx02 为本发明人获得的具有较高的抗氧。
31、化活性且具有酒精性肝损 伤保护功能的专利菌株， 专利公开号为 CN101328469A， 菌株保藏号为 CGMCC No ： 2525。 0069 首先， 分别制备干酪乳杆菌 grx12 和嗜热链球菌 grx02 发酵剂 0070 其次， 将预处理后的牛乳加热到 60左右， 加入 6% 蔗糖， 经充分溶解后， 在 20MPa 说 明 书 CN 103893215 A 8 7/7 页 9 压力下进行均质。然后经 95 /5min 条件下热处理后， 冷却至 42左右。按 2.5% 接种量 接入按实施例 1 制备的干酪乳杆菌 grx12 发酵剂， 以及加入 2.5% 嗜热链球菌 grx02 发酵 剂。
32、， 在 42下发酵至凝乳， 冷却后于 4冷藏， 即得到对酒精性肝损伤具保护作用的干酪乳 杆菌 grx12 和嗜热链球菌 grx02 混合功能发酵乳。 0071 实施例 3 ： 利用干酪乳杆菌 grx12 制备益生菌乳饮料 0072 将脱脂乳粉制成 12% 的复原脱脂乳 350kg， 采用 95 /8 10min 热处理后， 冷却 至 37 40。按 3% 5% 接种量接种按实施例 1 制备的干酪乳杆菌 grx12 发酵剂， 在 37 培养 20 24h， 终点酸度控制在 155 170 T ； 加入 650kg 经 90 110 /5 10s 杀菌 的糖、 稳定剂的混合物 （该混合物的组成为 。
33、0.9% 1.4% 的果胶和 13.8% 15.4% 的蔗糖） ， 混合均匀后 20 25MPa 均质， 然后在 72 /15s 条件下热处理， 冷却至 15 20， 采用无 菌或卫生灌装， 即得到 1000kg 干酪乳杆菌 grx12 乳饮料。 0073 实施例 4 ： 利用干酪乳杆菌 grx12 制备益生菌冰淇淋 0074 首先， 按实施例 1 制备干酪乳杆菌 grx12 发酵剂。 0075 其次， 制备 400kg 干酪乳杆菌 grx12 发酵乳， 即 ： 将复原全脂乳 （11.5%）加热到 60左右， 加入 6% 蔗糖， 经充分溶解后， 在 20MPa 压力下进行均质。然后将复原全脂乳。
34、在 95 /5min 条件下热处理， 冷却至 42左右。按 3% 5% 接种量接入按实施例 1 制备的干 酪乳杆菌 grx12 发酵剂在 37下发酵至凝乳， 冷却后于 4冷藏， 即得到干酪乳杆菌 grx12 发酵乳。 0076 再次制备 1 吨冰淇淋。将 600kg 冰淇淋其他物料， 包括白砂糖 75kg、 全脂奶粉 62.5kg、 黄奶油 31.25kg、 椰子油 23kg、 糖浆 26.25kg、 乳化稳定剂 6kg、 水 276kg 混合， 预热 到 60 65， 采用 20MPa 30MPa 进行均质， 然后再 80 /20s 杀菌， 冷却到 40 50， 与 400kg 干酪乳杆菌 grx12 发酵乳混合， 采用 20MPa 30MPa 进行均质， 2 4老化 6h， 经凝 冻后经过硬化的为硬质冰淇淋， 不经硬化的为软质冰淇淋。 说 明 书 CN 103893215 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103893215 A 10 2/2 页 11 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103893215 A 11 。