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1、(10)申请公布号 CN 103808818 A (43)申请公布日 2014.05.21 CN 103808818 A (21)申请号 201210460498.0 (22)申请日 2012.11.15 G01N 30/02(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 中国检验检疫科学研究院 地址 100029 北京市朝阳区惠新西街惠新里 241 号 1003 室 (72)发明人 付伟 王玲 贺艳 朱振营 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王朋飞 张庆敏 (54) 发明名称 一种抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检 测方法 。
2、(57) 摘要 本发明提供了一种基于气相色谱 - 质谱联用 技术的抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检 测方法， 通过对抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代 谢物基于气相色谱 - 质谱联用技术 （GC-MS） 检测 方法进行优化， 分别从提取溶液的种类及配比、 提 取时间、 提取液体积、 衍生过程温度和时间进行 优化， 结果表明在提取溶液为水乙腈异丙醇 =2 3 3 的提取条件下， 加入 1mL 提取溶液浸 提 20min 时， 相对峰面积为最佳检测状态， 能检测 到较多的代谢物成分。 在30、 90min的衍生条件 下， 相对峰面积较大， 信号强度明显。本发明建立 的检测方法为抗小麦黄花叶病毒转基因小。
3、麦的代 谢组学研究提供了可靠且有效的数据结果， 并为 转基因作物的安全评价奠定了基础。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图3页 (10)申请公布号 CN 103808818 A CN 103808818 A 1/1 页 2 1. 一种抗小麦黄花叶病毒代谢物检测方法， 包括以下步骤 ： 1） 将抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的种子脱壳， 磨成粉状， 加入提取溶液于 4浸提 ； 2） 离心后干燥， 加入内标物 ； 3） 干燥， 加入衍生试剂 ； 4） 采用气相色谱 - 质。
4、谱联用的方法对衍生后的样品进行分析 ； 其特征在于， 步骤1） 中所述提取溶液为体积比为2 ： 3 ： 3的水、 乙腈和异丙醇的混合液。 2. 根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于， 步骤 4） 中色谱条件为 ： 柱箱程序 ： 60保持 1min， 然后每分钟 10升温至 325， 保持 10min， 1min 后运行 ； 前进样器 ： 10l ； 进样量 ： 1l ； 载气 ： He， 99.999% ； 压力 ： 10.473psi ； 色谱柱 ： DB-5ms:1611.66442 ； DB-5ms325 ： 30m0.25mm0.25m ； 步骤 4） 中质谱条件为 ： EI。
5、 能量 ： 70eV ； 离子源温度 ： 230； 四级杆温度 ： 150； 溶剂延 迟 ： 7min。 3.根据权利要求1所述的检测方法， 其特征在于， 步骤1） 中为向100mg粉末中加入1mL 提取溶液于 4浸提。 4. 根据权利要求 3 所述的检测方法， 其特征在于， 步骤 1） 中浸提时间为 20min。 5. 根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于， 步骤 2）中所述离心是指在 4， 12200g/min， 离心 2min。 6. 根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于， 步骤 2） 中使用的内标物为十四酸。 7. 根据权利要求 1 所述的检测方法， 其特征在于， 。
6、步骤 3） 中所述衍生试剂的制备方 法为 ： 将 10l 盐酸甲氧胺溶于 40mg/ml 吡啶中， 30， 1500g， 振荡 90min， 然后加入 N- 甲 基 -N- 三甲基硅烷三氟乙酰胺和 1% 三甲基氯硅烷 90l， 37， 振荡 30min， 即得。 8. 根据权利要求 7 所述的检测方法， 其特征在于， 步骤 3）中衍生时间为 30min 或 90min。 9. 一种用于抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物 GC-MS 检测的提取试剂， 其特征在 于， 所述提取试剂为体积比为 2 ： 3 ： 3 的水、 乙腈和异丙醇的混合液。 权 利 要 求 书 CN 103808818 A 2 1。
7、/5 页 3 一种抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法 技术领域 0001 本发明涉及气相色谱-质谱联用检测技术， 具体地说， 涉及一种基于气相色谱-质 谱联用技术的抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法。 背景技术 0002 随着生物技术的日趋成熟及基因工程的不断深入， 转基因作物品种日益增多。转 基因产品的安全性问题一直是全球关注的焦点， 直接关系到人类的健康和生态环境安全。 目前， 代谢组学方法已经成为转基因产品安全性评价的重要工具之一。其中， 气相色谱 - 质 谱联用 （GC-MS） 技术由于其具有分辨率高、 峰容量大、 灵敏度高及分析时间短等优势而备受 代谢组学研究者的青睐， 。
8、该分析技术被专家称为最宝贵的分析手段， 此外， 这项技术的最大 优势是有大量可检索的谱库。 0003 小麦是世界上最重要的粮食作物之一， 近些年通过遗传修饰手段培育的抗病虫、 抗除草剂和雄性不育小麦方面进行了不少有益的探索。小麦黄花叶病， 亦称 “梭条花叶 病” ， 是我国小麦生产中的一种重要病毒病害， 主要发生在长江中下游及一些分支流域， 在 渭河流域以及东部沿海地区也有发生。该病毒病在稻麦轮作种植区的危害尤其严重， 一般 减产 10%30%, 重者达 70%80%, 并呈逐年加重和蔓延的趋势。小麦黄花叶病是由小麦黄 花叶病毒 （wheat yellow mosaic virus,WYMV）。
9、 引起的， 该病毒由禾谷多黏菌 （Polumyxa graminis） 的游动抱子携带传播， 防治非常困难。 同时因在多发生病害地区的主栽小麦品种 对此病害表现敏感， 而对小麦生产构成严重威胁。 0004 于嘉林等 （2002 年 ) 利用 Act1 启动子和除草剂选择标记 bar 基因， 构建了含有小 麦黄花叶病毒外壳蛋白基因的植物表达载体， 并采用基因枪法导入小麦品系， 获得了抗小 麦黄花叶病毒转基因小麦。且外源基因可以在后代中遗传， 转基因株系的后代对小麦黄花 叶病毒呈现高度抗性。 经Western blot和RT-PCR检测发现， 抗病转基因小麦体内外壳蛋白 基因在病毒感染后的表达水平。
10、出现明显下降。 今后抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的种植会 迅速发展， 具有极高的推广价值和应用前景。同时迫切需要有专门的机构对转基因作物进 行长期、 系统的跟踪检测、 安全评价研究， 因此建立抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的 GC-MS 技术的提取方法具有重要的理论和现实意义。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法， 特别是 一种基于气相色谱 - 质谱联用技术的抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法。 0006 为了实现本发明目的， 本发明的一种基于气相色谱 - 质谱联用技术的抗小麦黄花 叶病毒转基因小麦代谢物检测方法。 0007 本发明的目的是采用以。
11、下的技术方案来实现的。 依据本发明提供的一种抗小麦黄 花叶病毒转基因小麦代谢物检测方法， 包括以下步骤 ： 1） 将抗小麦黄花叶病毒转基因小麦 的种子脱壳， 磨成粉状， 加入提取溶液于 4浸提 ； 2） 离心后干燥， 加入内标物 ； 3） 干燥， 加 说 明 书 CN 103808818 A 3 2/5 页 4 入衍生试剂 ； 4） 采用气相色谱 - 质谱联用的方法对衍生后的样品进行分析 ； 0008 其中， 步骤 1） 中所述提取溶液为体积比为 2 ： 3 ： 3 的水、 乙腈和异丙醇的混合液。 0009 优选地， 步骤4） 中色谱条件为 ： 柱箱程序 ： 60保持1min， 然后每分钟10。
12、升温至 325， 保持10min， 1min后运行 ； 前进样器 ： 10l ； 进样量 ： 1l ； 载气 ： He， 99.999% ； 压力 ： 10.473psi ； 色谱柱 ： DB-5ms:1611.66442 ； DB-5ms325 ： 30m0.25mm0.25m ； 0010 步骤 4） 中质谱条件为 ： EI 能量 ： 70eV ； 离子源温度 ： 230； 四级杆温度 ： 150； 溶 剂延迟 ： 7min。 0011 前述的检测方法， 步骤 1） 中为向 100mg 粉末中加入 1mL 提取溶液于 4浸提。浸 提时间优选为 20min。 0012 前述的检测方法， 步骤。
13、 2） 中所述离心优选在 4， 12200g/min， 离心 2min。 0013 前述的检测方法， 步骤 2） 中使用的内标物优选为十四酸。 0014 前述的检测方法， 步骤 3） 中所述衍生试剂的制备方法为 ： 将 10l 盐酸甲氧胺溶 于 40mg/ml 吡啶中， 30， 1500g， 振荡 90min， 然后加入 N- 甲基 -N- 三甲基硅烷三氟乙酰胺 和 1% 三甲基氯硅烷 （MSTFA+1%TMCS） 90l， 37， 振荡 30min， 即得。衍生时间优选为 30min 或 90min。 0015 本发明还提供一种用于抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物 GC-MS 检测的提取 试。
14、剂， 所述提取试剂为体积比为 2 ： 3 ： 3 的水、 乙腈和异丙醇的混合液。 0016 本发明对抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物基于气相色谱 - 质谱联用技术 （GC-MS） 检测方法进行优化， 分别从提取溶液的种类及配比、 提取时间、 提取液体积、 衍生过 程温度和时间进行优化， 结果表明在提取溶液为水 ： 乙腈 ： 异丙醇 （体积比） =2 ： 3 ： 3 的提取 条件下， 加入 1mL 提取溶液浸提 20min 时， 相对峰面积为最佳检测状态， 能检测到较多的代 谢物成分。在 30、 90min 的衍生条件下， 相对峰面积较大， 信号强度明显。本发明建立的 检测方法为抗小麦黄花叶病毒。
15、转基因小麦的代谢组学研究提供了可靠且有效的数据结果， 并为转基因作物的安全评价奠定了基础。 附图说明 0017 图 1-3 为本发明较佳实施例中分别采用提取溶液 A、 B 和 C 提取后检测到的代谢物 指纹图谱 ； 0018 图 4 为本发明较佳实施例中不同提取液 （水 ： 乙腈 ： 异丙醇） 配比下总相对峰面积 变化。 0019 图 5 为本发明较佳实施例中不同提取时间检测到的峰个数与总相对峰面积。 0020 图 6 为本发明较佳实施例中不同提取液体积下的峰个数变化。 0021 图 7 为本发明较佳实施例中不同衍生温度条件下总相对峰面积变化。 0022 图 8 为本发明较佳实施例中不同衍生时。
16、间条件下总相对峰面积变化。 0023 图 9 为本发明较佳实施例中 GC-MS 检测到的内标物保留时间。 具体实施方式 0024 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 若未特别指明， 实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段， 所用原料均为市售商品。 说 明 书 CN 103808818 A 4 3/5 页 5 0025 实施例 基于气相色谱 - 质谱联用技术的抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物 检测方法 0026 1 实验材料及方法 0027 1.1 实验材料 0028 抗小麦黄花叶病毒转基因小麦 72KD 及其非转基因亲本扬 11， 由中国农业大学提 供。 。
17、0029 1.2 实验试剂 0030 乙腈 （Acetonitrile） 、 异丙醇 （Ispropyl alcohol） 、 吡啶 （pyridine） 、 盐酸甲氧 胺 （Methoxyamine hydrochloride） 、 N- 甲基 -N- 三甲基硅基三氟乙酰胺 （MSTFA） 、 十四酸 （Myristic acid） 。 0031 1.3 实验仪器 0032 气质联用仪 Agilent7890A-8975C、 热混合仪 MS-100、 混合球磨仪 MM-400、 真空浓 缩仪 RVT4104-203、 离心机 D-37520、 超声波仪 SB-5200， 砻谷机 JLGJ-4。
18、5。 0033 1.4 实验步骤 0034 将种子脱壳 ； 用混合球磨仪将种子磨成细粉 ； 将粉末分装为 100mg 每份， 分别加 入 1mL 提取溶液， 漩涡震荡 10s ； 在热混合仪上 4浸提 20min ； 4离心机上离心 2min， 12200g/min ； 在真空浓缩仪上充分干燥 ； 加入内标物 Myristic acid ； 干燥 ； 加入衍生试剂 充分衍生 ； 在 GC-MS 工作站上编辑方法参数， 进样分析 ； 用 AMDIS 软件处理图谱， 定性化合 物。 0035 1.5 实验条件 0036 1.5.1 色谱条件 0037 柱箱程序 ： 60保持 1min， 然后每分钟。
19、 10升温至 325， 保持 10min， 1min 后 运行。前进样器 ： 10l ； 进样量 ： 1l ； 载气 ： He， 99.999% ； 压力 ： 10.473psi ； 色谱柱 ： DB-5ms:1611.66442 ； DB-5ms325 ： 30m0.25mm0.25m。 0038 1.5.2 质谱条件 0039 EI 能量 ： 70eV ； 离子源温度 ： 230 ； 四级杆温度 ： 150 ； 溶剂延迟 ： 7min。 0040 2 结果与讨论 0041 2.1 代谢物提取溶液种类的选择 0042 对于抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物的提取， 是研究抗小麦黄花叶病毒转基 。
20、因小麦代谢组学的前提基础， 更是关键步骤。本实验配置了三种提取溶液， 分别为 ： A ： 水 ： 乙腈 =1:1 ； B ： 水 ： 异丙醇 =1:1 ； C ： 水 ： 异丙醇 ： 乙腈 =1 ： 1 ： 1。在相同提取时间 20min 条件 下进行试验。经 GC-MS 检测， AMDIS 定性分析。从图 1-3 中可以看出提取溶液 A 检测到 51 个化合物， 提取溶液 B 检测到 56 个化合物， 提取溶液 C 检测到 94 个化合物。两种萃取液混 合后的提取效果远优于单种萃取液。 分析其原因， 认为可能由于其中异丙醇极性较大， 主要 提取油脂类、 氨基酸、 维生素等物质， 乙腈主要提取。
21、的是脂肪酸类。所以两者结合补充了各 自的不足， 浓度也有所增加， 可以达到较好的提取效果。 0043 2.2 代谢物提取溶剂配比的优化 0044 共设置三种配比 （体积比） 的提取溶液， 水 ： 异丙醇 ： 乙腈分别配置 A ： 1:0.5:0.5 ； B ： 1:1:1 ； C ： 2:3:3 ； D ： 1:2:2。在相同时间 20min 条件下提取。经 GC-MS 检测及 AMDIS 软件 说 明 书 CN 103808818 A 5 4/5 页 6 分析， 结果显示可检测到的化合物的数目在溶液配比为 C（2:3:3） 、 D（1:2:2） 时基本保持 不变 （图 4） ， 说明代谢物在。
22、足够的提取液中可以全部提取出来， 不需再增加提取液量。从百 分比报告分析， 总相对峰面积呈递增现象， 到 C 时呈缓慢上升状态， 上升幅度非常小。所以 从数据分析方面考虑选择配比为 C 的信号强度已为较好， 能提取出几乎所有的代谢物。 0045 2.3 提取时间对总相对峰面积、 峰个数的影响 0046 考虑到浸提时间的长短对代谢物的提取会有不同程度影响， 分别设置了 5min、 10min、 15min、 20min、 25min、 30min 的提取时间进行实验。用以上试验中得到的最佳提取溶 液及配比进行提取， 即水 ： 异丙醇 ： 乙腈 =2:3:3。经检测分析， 得到峰个数和总相对峰面积。
23、 情况 （图 5） 。从柱形图上可以看出峰面积随时间的增加呈缓慢上升趋势， 说明开始时代谢 物的析出与时间成正比例关系。在 20min 以后上升极其缓慢。折线图显示在提取时间为 15min 后峰个数上下浮动不大， 基本处于稳定。综合考虑后选择 20min 作为提取最佳时间。 0047 2.4 代谢物提取溶剂体积的确定 0048 提取溶剂体积的不同可能会影响提取到的代谢物数目， 分别设置了 0.5mL、 1mL、 1.5mL、 2mL 的提取溶剂体积梯度。从图 6 中可以看出， 0.5mL 的提取液提取到 84 个代谢物， 可能由于萃取剂的量不够。而加入 1mL、 1.5mL、 2mL 提取液提。
24、取的结果都在 92 个左右。当 提取溶剂的体积达到一定程度时， 增加提取溶剂体积后， 总相对峰面积就不再大幅度变化。 所以加入 1mL 提取液进行代谢物的提取比较合适。 0049 2.5 代谢物衍生化处理温度和时间的优化 0050 为了增加样品的稳定性与挥发性， 进样前需进行衍生化处理， 使用的衍生试剂其 制备方法为 ： 将 10l 盐酸甲氧胺溶于 40mg/ml 吡啶中， 30， 1500g， 振荡 90min， 然后加入 N- 甲基 -N- 三甲基硅烷三氟乙酰胺和 1% 三甲基氯硅烷 （MSTFA+1%TMCS） 90l， 37， 振荡 30min， 即得。 。本发明设计了 5 个时间段，。
25、 分别为 30min、 50min、 70min、 90min、 110min， 及 5 个温度 10、 20、 30、 40、 50的单因素试验。经 GC-MS 检测分析百分比报告。相对峰 面积情况 （图 7） 在温度为 30时峰的相对面积比较大， 代谢物易受环境因素影响而发生变 化， 温度过高可能会破坏代谢物所以温度在 30时相对合理。从图 8 中可以看出总相对峰 面积随着衍生时间的延长而递增， 在衍生化处理过程时间为 90min 时， 递增速度减慢， 基本 处于平衡状态。因而衍生时间为 90min 时衍生较充分， 相对峰面积比较大， 有利于后期的数 据分析。 0051 2.6 保留时间稳。
26、定性的保证 0052 气相色谱 - 质谱联用仪 （GC-MS） 是非常灵敏的检测仪器， 周围环境的各种因素都 可能影响到其检测结果， 为了保证重复过程中相对应的代谢物的出峰时间相同， 本发明采 用保留时间锁定的方法进行检测。用十四酸做为保留时间锁定的化合物， 其出峰时间为 16.727min （图 9） 。在气相色谱 - 质谱联用仪的工作站上编辑好各个检测参数后， 在此方法 的基础上采集锁定化合物的出峰压力并将此压力设为恒压。 锁定好方法后即可进行代谢物 检测， 每次检测得到的图谱中内标物十四酸的出峰时间相差小于 0.2min 视为有效图谱， 可 以用来进行下一步数据分析。 0053 代谢物的。
27、提取及衍生条件是否合理将直接影响代谢组学水平的研究。 代谢组学提 取方法多种多样， 针对所研究的样本特征选择合适的提取方法至关重要。 本发明中采用水 ： 乙腈 ： 异丙醇 =2:3:3 的体积比作为抗小麦黄花叶病毒转基因小麦种子代谢物的萃取剂， 在 说 明 书 CN 103808818 A 6 5/5 页 7 提取溶剂体积为 1mL 且提取时间为 20min 的条件下， 及在盐酸甲氧胺衍生 30、 90min 的条 件下成功的提取出抗小麦黄花叶病毒转基因小麦代谢物 90 多种， 经进一步分析得到如乳 酸、 乙醇酸、 缬氨酸、 丙氨酸、 草酸， 尿素等多种代谢物， 证实此方法可十分有效地用来检测。
28、 抗小麦黄花叶病毒转基因小麦的代谢物。 0054 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说 明 书 CN 103808818 A 7 1/3 页 8 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103808818 A 8 2/3 页 9 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103808818 A 9 3/3 页 10 图 7 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 103808818 A 10 。