《核酸试纸条法检测ERCC1第118位密码子位点多态性.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸试纸条法检测ERCC1第118位密码子位点多态性.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 103820526 A (43)申请公布日 2014.05.28 CN 103820526 A (21)申请号 201210460954.1 (22)申请日 2012.11.16 C12Q 1/68(2006.01) G01N 33/558(2006.01) (71)申请人 苏州优贝沃生物技术有限公司 地址 215500 江苏省苏州市常熟市常熟东南 经济开发区金都路号幢 (72)发明人 胡琳 江建辉 侯建华 徐高连 孙悦 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 汪旭东 (54) 发明名称 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子位 点多。
2、态性 (57) 摘要 本发明就是在 PCR 扩增靶模板的基础上， 利 用带标记的引物进行等位基因特异性扩增， 并最 终利用核酸试纸条进行 ERCC1 第 118 位密码子 检测的技术， 其检测的主要原理是根据抗原和 其特异性抗体的免疫学特异性结合， 将核酸片段 固定在核酸检测试纸条上， 然后通过可视的呈 色乳胶颗粒在试纸条上显色而检测出结果， 在 PCR&AS-PCR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位 密码子多态性中主要包括用于 PCR 扩增的特异性 PCR 扩增引物， 一条 5 末端带生物素标记的等位 基因特异性引物， 一条3 末端带FITC标记的特异 性探针， PCR&AS-P。
3、CR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性基因型。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书6页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103820526 A CN 103820526 A 1/2 页 2 1. 一种核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子位点多态性， a,取样， 冻存的被检者外周静脉抗凝血200ul， 用微量DNA快速提取试剂盒进行核酸提 取 ； b ： 先对包含 ERCC1 第 118 位密码子多态性位点的靶模板通过 PCR 进行扩。
4、增， 同时进行 PCR 扩增的引物并不进行任何的标记 ； 其特征在于 ： c ： 在步骤 b 的基础上， 利用 AS-PCR 根据 ERCC1 第 118 位密码子多态性基因型的碱基类 型进行特异性扩增， 在灭菌的0.2ml PCR管中， 在20ul的反应体系中， 针对不同的基因型分加入不同的PCR 扩增引物和探针 ； PCR & AS-PCR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性反应体系 ： 模板 ： 一个被检者基因组 DNA， PCR 引物 ： 181PF 和 181PR 各 0.2-2 微摩， 标记的引物 ： 181D5F-C/181D5G-A 各 0.1-1 微摩，。
5、 特异性探针 ： 181D3B 0.1-1 微摩， dNTP ： 0.2-0.5 毫摩 (NH4)2SO4 10 毫摩 KCl 10 毫摩 Tris-HCl（PH 9.0） 10 毫摩 Triton-100 1.0% MgCl2 1.5-3 毫摩 Taq DNA 聚合酶 ： 1-5 单位 总体积为 20 微升 短暂离心后进行 PCR 循环。PCR 循环参数为 95 5min ； 93-96 1min ； 60-72 1min ； 72 2min ； 30-50 个循环 ； 93-96 30s ； 45 -55 1min ； 2-10 个循环 ； 95 5min ； 在AS-PCR扩增线性扩增过。
6、程中， 将反应的退火温度将到适合181D5F-C 和181D5G-A延 伸的温度 ； d ： 在试纸条上， 将特异性抗体即抗 A 抗体吸附于乳胶颗粒， 在乳胶颗粒表面形成抗体 包被 ； 将另一无色特异性抗体即抗 B 抗体， 以线条状固定于膜上， 形成检测线 ； e ： 检测结果 ： 将反应产物全部滴于核酸试纸条的加样处， 加上 100ul 的缓冲液， 带抗原 A 和抗原 B 的杂交产物首先与颗粒表面的抗体 A 结合， 形成抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗 粒抗体 A 的有色颗粒复合物， 有色的复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动， 当 复合物遇到固定于膜上的抗体 B 线条时， 待检的抗。
7、原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 复 合物与线条上的抗体 B 结合， 形成线条抗体 B 抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 的 有色颗粒复合物， 有色的线条抗体 B 抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 的颗粒复合 物滞留在线上， 形成肉眼可见的有色线条 ； 2A ： 核酸试纸条检测的结果 ： 1. TT 纯合子 ； 2. CC 纯合子。 2B ： 对应的测序结果， 划红线的碱基为所要检测的位点 ： 1. TT 纯合子 ； 2. CC 纯合子。 2. 根据权利要求 1 所述的核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子位点多态性， 其特 权 利 要 求 书 C。
8、N 103820526 A 2 2/2 页 3 征在于， 检测 ERCC1 的样本为多个。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子位点多态性， 其特征在于， 在步骤 c 中， PCR & AS-PCR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性 反应体系里， PCR引物 ： 181PF和181PR 各0.2微摩， 标记的引物 ： 181D5F-C/181D5G-A 各 0.1 微摩， 特异性探针 ： 181D3B 0.1 微摩， dNTP 0.2 毫摩 MgCl2 2.5 毫摩， Taq DNA 聚 合酶 2 单位， PCR 反应。
9、程序为 ： 95 , 5 分 ； 94 , 20 秒 ； 60 , 20 秒 ； 72 , 20 秒 ； 40 循 环 ； 94 , 20 秒 ； 45 , 20 秒 ； 5 循环。 权 利 要 求 书 CN 103820526 A 3 1/6 页 4 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子位点多态性 技术领域 0001 本发明涉及利用核酸试纸条法检测切除修复交叉互补基因 1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1) 第 118 位密码子多态性的方法。更具体地说， 是利 用扩增技术(PCR&AS-PCR)和核酸薄膜层析快速检。
10、测方法及其试纸条技术进行ERCC1第118 位密码子位点多态性的快速检测。 背景技术 0002 铂类药物的主要作用机制是与 DNA 上的鸟嘌呤、 腺嘌呤和胞嘧啶结合形成 铂 -DNA 加合物， 导致 DNA 的链间交联或链内交联， 引起 DNA 损伤， 从而导致细胞死亡。DNA 修复能力的差异将直接导致肿瘤细胞对 DNA 相关细胞毒性药物敏感性的个体差异。ERCC1 基因第 118 密码子 Asn-Asn 具有多态性， 核苷酸序列由 AAC 突变为 AAT， 该无义突变能 够影响 ERCC1 蛋白的表达水平， C T 的突变提高了 ERCC1 mRNA 的表达水平， 增强 DNA 修复能力而导。
11、致铂类耐药。有研究显示， 含有野生型ERCC1 序列的人卵巢癌细胞株比变异 型细胞株对铂类药物敏感要高。同时， ERCC1 第 118 位密码子的多态性还可能影响患者的 生存率和疗效。ERCC1 第 118 位密码子上的一碱基由 C 到 T 的变异与化疗效果明显相关 ： 具有 C/C 基因型患者 （54/109, 50.4%） 的中位生存时间为 486 天 （95%CI， 333-x） ， 而变异型 C/T（45/109, 42.1%） 或 T/T（8/109,7.5%） 的中位生存时间为 281 天 （95%CI， 214-376） 。 0003 目前用于 ERCC1 第 118 位密码子位。
12、点多态性检测的方法大多以 PCR 技术为基础， 与荧光、 质谱法、 基因芯片或直接测序等方法结合。 但这些方法大多操作复杂、 价格昂贵、 检 测时间长， 而且需要大型的仪器设备为前提， 因此并不适合于基层医院。 发明内容 0004 为了解决 ERCC1 位点多态性检测方法大多操作复杂、 价格昂贵、 检测时间长， 而且 需要大型的仪器设备的问题， 本发明利用扩增技术 (PCR&AS-PCR) 和核酸薄膜层析快速检 测方法及其试纸条技术 （专利号 CN1234567890） 进行 ERCC1 第 118 位密码子位点多态性的 快速检测。 0005 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是 ： 1、 。
13、发明原理 ： 本发明就是在 PCR 扩增靶模板的基础上， 利用带标记的引物进行等位基 因特异性扩增 （Allele specific Polymerase Chain Reaction， AS-PCR） ， 并最终利用核酸 试纸条进行 ERCC1 第 118 位密码子检测的技术。其检测的主要原理是根据抗原和其特异性 抗体的免疫学特异性结合， 将核酸片段固定在核酸检测试纸条上， 然后通过可视的呈色乳 胶颗粒在试纸条上显色而检测出结果。其反应原理和步骤如图 1 ： 在PCR & AS-PCR核酸试纸条法检测ERCC1第118位密码子多态性中主要包括用于PCR 扩增的特异性 PCR 扩增引物， 一条。
14、 5 末端带生物素标记的等位基因特异性引物， 一条 3 末 端带 FITC 标记的特异性探针。PCR & AS-PCR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子多 态性基因型主要包括以下几个步骤 ： 说 明 书 CN 103820526 A 4 2/6 页 5 a: 取样 , 被检者外周静脉抗凝血 （冻存） 200ul， 应用杭州优思达生物技术有限公司所 生产的微量 DNA 快速提取试剂盒进行核酸提取， 用以基因扩增。 0006 b ： 先对包含 ERCC1 第 118 位密码子多态性位点的靶模板通过 PCR 进行扩增， 这一 步骤中的 PCR 扩增并不对 ERCC1 第 118 位。
15、密码子多态性的碱基类型进行区分， 只是为了达 到富集靶序列的目的， 同时进行 PCR 扩增的引物并不进行任何的标记 ； 其特征在于 ： c ： 在步骤 b 的基础上， 利用 AS-PCR 根据 ERCC1 第 118 位密码子多态性基因型的碱基类 型进行特异性扩增， 在适当的 Tm 情况下， 只有当 5 末端标记抗原 A 的等位基因特异性引物 与步骤 2 中扩增产物上要检测的含 ERCC1 第 118 位密码子多态性片段完全互补时， 该引物 才能在 DNA 聚合酶的作用下进行延伸， 其延伸产物能与反应液中 3 末端标记抗原 B 的探针 进行结合。 0007 在灭菌的 0.2ml PCR 管中，。
16、 在 20ul 的反应体系中， 针对不同的基因型分加入不同 的 PCR 扩增引物和探针 （表 1） 。等浓度的 181PF 和 181PR 引物对不同的基因型进行特异性 的扩增， 而 181D5F-C/181D5G-A 由于引物的 Tm 低于 PCR 扩增时反应的温度， 所以无法有效 的参与 181PF/181PR 的指数扩增过程中 ； 引物或探针名称序列信息 181PF（正向扩增引物）5-AAGTGTTCAGGACCACAGG 181PR（反向扩增引物）5-GAGGCTTCTCATAGAACAG 181D5F-C（探针 1）5-FITC-GTGCGCAACG 181D5G-A（探针 2）5-。
17、FITC-GTGCGCAAAG 181D3B（探针 3）5-AATTCCCAGGGC-BIOTIN 表 1 ERCC1 第 118 位密码子多态性检测所涉及的引物和探针 PCR & AS-PCR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性反应体系 ： 模板 ： 一个被检者基因组 DNA PCR 引物 ： 181PF 和 181PR 各 0.2-2 微摩 标记的引物 ： 181D5F-C/181D5G-A 各 0.1-1 微摩 特异性探针 ： 181D3B 0.1-1 微摩 dNTP ： 0.2-0.5 毫摩， (NH4)2SO4 10 毫摩 KCl 10 毫摩 Tris-HCl（。
18、PH 9.0） 10 毫摩 Triton-100 1.0% MgCl2 1.5-3 毫摩 Taq DNA 聚合酶 ： 1-5 单位 总体积为 20 微升 短暂离心后进行 PCR 循环。PCR 循环参数为 95 5min ； 93-96 1min ； 60-72 1min ； 72 2min ； 30-50 个循环 ； 93-96 30s ； 45 -55 1min ； 2-10 个循环 ； 95 5min ； 在AS-PCR扩增线性扩增过程中， 将反应的退火温度将到适合181D5F-C 和181D5G-A延 伸的温度 ； 只有当181D5F-C/181D5G-A与PCR扩增中的模板序列完全匹配。
19、的时候， 他们才能 进行延伸。而该延伸产物又能与 181D3B 进行杂交结合。 说 明 书 CN 103820526 A 5 3/6 页 6 0008 d ： 在试纸条上， 将特异性抗体即抗 A 抗体吸附于乳胶颗粒， 在乳胶颗粒表面形成 抗体包被 ； 将另一无色特异性抗体即抗 B 抗体， 以线条状固定于膜上， 形成检测线 ； e ： 检测结果 ： 将反应产物全部滴于核酸试纸条的加样处， 加上 100ul 的缓冲液， 带抗原 A 和抗原 B 的杂交产物首先与颗粒表面的抗体 A 结合， 形成抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗 粒抗体 A 的有色颗粒复合物。有色的复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向。
20、上流动。当 复合物遇到固定于膜上的抗体 B 线条时， 待检的抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 复 合物与线条上的抗体 B 结合， 形成线条抗体 B 抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 的 有色颗粒复合物。有色的线条抗体 B 抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 的颗粒复 合物滞留在线上， 形成肉眼可见的有色线条 ； 此为阳性。 0009 在 AS-PCR 反应时， 如果加入等位基因特异性引物末端不能与模板完全匹配， 那么 该引物就无法进行 AS-PCR 扩增， 也就不能形成抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 的 有色颗粒复合物。因此有色颗粒将不能与膜上的。
21、检测线结合而越过此线， 不能形成肉眼可 见的有色线条。此为阴性。 0010 在 AS-PCR 反应时， 根据多态位点的碱基类型分别加入与多态位点相对应的带有 标记的等位基因特异性引物 （或一个反应时加入不同种标记的相应的不同等位基因特异性 引物） ， 然后利用试纸条上包被的多个相应抗体 （或多个核酸条试纸条） 进行检测， 根据其上 有无特异颜色的条带进行分型。 若只有其中出现一个条带时， 表明被检者为纯合子， 若出现 两个条带 （或 2 个试纸条出现条带， 参见附图 1） 时， 则表明其为杂合子。 0011 本发明的优选方案为， 上述发明的检测 ERCC1 的样本为多个。 0012 本发明的优。
22、选方案为， 在上述步骤 c 中， PCR & AS-PCR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性反应体系里， PCR 引物 ： 181PF 和 181PR 各 0.2 微摩， 标记的引物 ： 181D5F-C/181D5G-A 各 0.1 微摩， 特异性探针 ： 181D3B 0.1 微摩， MgCl2 2.5 毫摩， Taq DNA聚合酶2单位， PCR反应程序为 ： 95, 5分 ； 94, 20秒 ； 60, 20秒 ； 72, 20秒 ； 40 循环 ； 94 , 20 秒 ； 45 , 20 秒 ； 5 循环 . 本发明的有益效果 ： 在我们原有的核酸检测试纸条专。
23、利的基础上， 结合聚合酶链式反 应(PCR)和等位基因特异性扩增 （Allele specific Polymerase Chain Reaction， AS-PCR） 而发明的针对 ERCC1 第 118 位密码子位点多态性的快速检测的方法， 本发明采用了 PCR ASPCR技术结合核酸试纸条检测技术检测SNP位点的基因型， 与普通的PCR， ASPCR相 比具有更高的反应特异性和灵敏性， 为人们提供一种操作简单， 价格低廉和检测结果准确 的能对 ERCC1 第 118 位密码子多态性进行检测的方法。 附图说明 0013 图 1 PCR-AS PCR 检测 SNP 反应原理图 图2 ： 核酸。
24、试纸条法和测序法检测ERCC1第118位密码子多态性结果， 2A ： 核酸试纸条 检测的结果 ： 1. TT 纯合子 ； 2. CC 纯合子。2B ： 对应的测序结果， 划红线的碱基为所要检测 的位点 ： 1. TT 纯合子 ； 2. CC 纯合子。 0014 图 3 ： 核酸试纸条法多人检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性的结果 ： 1. C/T 杂合 子 ； 2. CC 纯合子。 说 明 书 CN 103820526 A 6 4/6 页 7 具体实施方式 0015 实施例 1 单人 ERCC1 第 118 位密码子多态性的检测 a 取样 被检者外周静脉抗凝血 （冻存） 200ul，。
25、 应用杭州优思达生物技术有限公司所生产的微 量 DNA 快速提取试剂盒进行核酸提取， 用以基因扩增。 0016 b ： 先对包含 ERCC1 第 118 位密码子多态性位点的靶模板通过 PCR 进行扩增， 同时 进行 PCR 扩增的引物并不进行任何的标记 ； 其特征在于 ： c ： 在步骤 b 的基础上， 利用 AS-PCR 根据 ERCC1 第 118 位密码子多态性基因型的碱基类 型进行特异性扩增， 在灭菌的0.2ml PCR管中， 在20ul的反应体系中， 针对不同的基因型分加入不同的PCR 扩增引物和探针 ； PCR & AS-PCR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子。
26、多态性反应体系 ： 模板 ： 一个被检者基因组 DNA， PCR 引物 ： 181PF 和 181PR 各 0.2-2 微摩， 标记的引物 ： 181D5F-C/181D5G-A 各 0.1-1 微摩， 特异性探针 ： 181D3B 0.1-1 微摩， dNTP ： 0.2-0.5 毫摩 (NH4)2SO4 10 毫摩 KCl 10 毫摩 Tris-HCl（PH 9.0） 10 毫摩 Triton-100 1.0% MgCl2 1.5-3 毫摩 Taq DNA 聚合酶 ： 1-5 单位 总体积为 20 微升 短暂离心后进行 PCR 循环。PCR 循环参数为 95 5min ； 93-96 1m。
27、in ； 60-72 1min ； 72 2min ； 30-50 个循环 ； 93-96 30s ； 45 -55 1min ； 2-10 个循环 ； 95 5min ； 在AS-PCR扩增线性扩增过程中， 将反应的退火温度将到适合181D5F-C 和181D5G-A延 伸的温度 ； d ： 在试纸条上， 将特异性抗体即抗 A 抗体吸附于乳胶颗粒， 在乳胶颗粒表面形成抗体 包被 ； 将另一无色特异性抗体即抗 B 抗体， 以线条状固定于膜上， 形成检测线 ； e ： 检测结果 ： 将反应产物全部滴于核酸试纸条的加样处， 加上 100ul 的缓冲液， 带抗原 A 和抗原 B 的杂交产物首先与颗粒。
28、表面的抗体 A 结合， 形成抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗 粒抗体 A 的有色颗粒复合物。有色的复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动。当 复合物遇到固定于膜上的抗体 B 线条时， 待检的抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 复 合物与线条上的抗体 B 结合， 形成线条抗体 B 抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 的 有色颗粒复合物。有色的线条抗体 B 抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 的颗粒复 合物滞留在线上， 形成肉眼可见的有色线条 （图 2） 说 明 书 CN 103820526 A 7 5/6 页 8 2A ： 核酸试纸条检测的结果 ： 1. TT。
29、 纯合子 ； 2. CC 纯合子。 0017 2B ： 对应的测序结果， 划红线的碱基为所要检测的位点 ： 1. TT纯合子 ； 2. CC纯合 子。实施例二， 多人 ERCC1 第 118 位密码子多态性的检测 a 取样 被检者外周静脉抗凝血 （冻存） 200ul， 应用杭州优思达生物技术有限公司所生产的微 量 DNA 快速提取试剂盒进行核酸提取， 用以基因扩增。 0018 b ： 先对包含 ERCC1 第 118 位密码子多态性位点的靶模板通过 PCR 进行扩增， 同时 进行 PCR 扩增的引物并不进行任何的标记 ； 其特征在于 ： c ： 在步骤 b 的基础上， 利用 AS-PCR 根据。
30、 ERCC1 第 118 位密码子多态性基因型的碱基类 型进行特异性扩增， 在灭菌的0.2ml PCR管中， 在20ul的反应体系中， 针对不同的基因型分加入不同的PCR 扩增引物和探针 ； PCR & AS-PCR 核酸试纸条法检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性反应体系 ： 模板 ： 一个被检者基因组 DNA， PCR 引物 ： 181PF 和 181PR 各 0.2-2 微摩， 标记的引物 ： 181D5F-C/181D5G-A 各 0.1-1 微摩， 特异性探针 ： 181D3B 0.1-1 微摩， dNTP ： 0.2 -0.5 毫摩 (NH4)2SO4 10 毫摩 KCl 。
31、10 毫摩 Tris-HCl（PH 9.0） 10 毫摩 Triton-100 1.0% MgCl2 1.5-3 毫摩 Taq DNA 聚合酶 ： 1-5 单位 总体积为 20 微升 短暂离心后进行 PCR 循环。PCR 循环参数为 95 5min ； 93-96 1min ； 60-72 1min ； 72 2min ； 30-50 个循环 ； 93-96 30s ； 45 -55 1min ； 2-10 个循环 ； 95 5min ； 在AS-PCR扩增线性扩增过程中， 将反应的退火温度将到适合181D5F-C 和181D5G-A延 伸的温度 ； d ： 在试纸条上， 将特异性抗体即抗 A。
32、 抗体吸附于乳胶颗粒， 在乳胶颗粒表面形成抗体 包被 ； 将另一无色特异性抗体即抗 B 抗体， 以线条状固定于膜上， 形成检测线 ； e ： 检测结果 ： 将反应产物全部滴于核酸试纸条的加样处， 加上 100ul 的缓冲液， 带抗原 A 和抗原 B 的杂交产物首先与颗粒表面的抗体 A 结合， 形成抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗 粒抗体 A 的有色颗粒复合物。有色的复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动。当 复合物遇到固定于膜上的抗体 B 线条时， 待检的抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 复 合物与线条上的抗体 B 结合， 形成线条抗体 B 抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗。
33、粒抗体 A 的 有色颗粒复合物。有色的线条抗体 B 抗原 B 寡核苷酸链抗原 A- 颗粒抗体 A 的颗粒复 说 明 书 CN 103820526 A 8 6/6 页 9 合物滞留在线上， 形成肉眼可见的有色线条检 测结果 ： 将反应产物全部滴于核酸试纸条上， 在 10 分钟判读结果。核酸试纸条检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性的结果见图 3。 0019 实施例三， 对实施例一或二进一步限定， 在步骤 c 中， PCR & AS-PCR 核酸试纸条法 检测 ERCC1 第 118 位密码子多态性反应体系里， PCR 引物 ： 181PF 和 181PR 各 0.2 微摩， 标 记的引物。
34、 ： 181D5F-C/181D5G-A 各 0.1 微摩， 特异性探针 ： 181D3B 0.1 微摩， MgCl2 2.5 毫摩， Taq DNA 聚合酶 2 单位， PCR 反应程序为 ： 95 , 5 分 ； 94 , 20 秒 ； 60 , 20 秒 ； 72 , 20 秒 ； 40 循环 ； 94 , 20 秒 ； 45 , 20 秒 ； 5 循环 . 以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。 本行业的技术人员 应了解， 本发明不受上述实施例的限制， 上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的 原理， 在不脱离本发明精神和范围的前提下， 本发明还会有各种变化和改进， 这些变化和改 进都落入要求保护的本发明范围内， 本发明要求保护范。 说 明 书 CN 103820526 A 9 1/2 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103820526 A 10 2/2 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 103820526 A 11 。