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1、(10)申请公布号 CN 103822816 A (43)申请公布日 2014.05.28 CN 103822816 A (21)申请号 201310685086.1 (22)申请日 2013.12.16 G01N 1/30(2006.01) G01N 1/28(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 内蒙古赛科星繁育生物技术股份有 限公司 地址 011517 内蒙古自治区呼和浩特市盛乐 经济园区成长大道蒙牛六期六楼 (72)发明人 苏杰 李喜和 赵高平 胡树香 孙伟 (54) 发明名称 使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定混合精子的 方法 (57) 摘。
2、要 一种使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定混合精 子的方法， 属精子鉴定方法， 将 FITC 粉末中加入 DMSO 配置 FITC 浓储液， 将 MITO 粉末中加入 DMSO 配置 MITO 浓储液， HEPES、 氯化镁、 氯化钠、 氯化 钾、 磷酸氢二钠、 碳酸氢钠、 丙酮酸钠、 葡萄糖、 乳 酸钠、 牛血清白蛋白和超纯水配置 stainingtalp 精子染色缓冲液， 精子FITC染色、 MITO染色， 将用 FITC 染色后的精子与用 MITO 染色后的精子等量 混合， FITC、 MITO 染色后和 FITC 染色与 MITO 染色 后的精子等量混合后3h荧光检测。 本发明。
3、的有益 效果是 ： 在不影响精子活力的条件下， 只通过两 种荧光染光可将形态相近的精子在一定时间内区 分出来。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 7 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书7页 附图2页 (10)申请公布号 CN 103822816 A CN 103822816 A 1/2 页 2 1. 一种使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定混合精子的方法， 其特征在于 ： 它包括以下步 骤 ： 一、 配制试剂 ： （1） 配置 FITC 浓储液 ： 将 FITC 粉末中加入 DMSO， 使其终浓度为 0.。
4、5M， 分装后避光在 -20保存， 使用期限为 1 年 ； （2） 配置 MITO 浓储液 ： 将 MITO 粉末中加入 DMSO, 使其终浓度为 0.069mM/L， 分装后避光在 -20保存， 使用期 限为 1 年 ； （3） 配置 staining talp 精子染色缓冲液 ： HEPES 40mM/L 氯化镁 0.4mM/L 氯化钠 95mM/L 氯化钾 3mM/L 磷酸氢二钠 0.3mM/L 碳酸氢钠 10mM/L 丙酮酸钠 2mM/L 葡萄糖 5mM/L 乳酸钠 25mM/L 牛血清白蛋白 3g/L 超纯水 其余为超纯水 ； 二、 精子染色 ： （1） 精子 FITC 染色 ： 取。
5、 500 万精子加入 5ml 的 staining talp 精子染色缓冲液， 使精子终浓度为 100 万 /ml ； 在步骤的精子溶液中加入 0.75l 的 FITC 浓储液， 使其终浓度为 0.077mM/L， 轻轻 摇动将染色液摇匀 ； 在 37避光染色 40 分， 将染色的精子轻轻摇晃 ； 染色结束后， 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲 液， 轻轻摇动 ； 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲液， 轻轻摇 动 ； 1500rpm 离心 10 分， 弃上清，。
6、 加入 250l staining talp 精子染色缓冲液 ； （2） 精子 MITO 染色 ： 取 500 万精子加入 5ml 的 staining talp 精子染色缓冲液， 使精子终浓度为 100 万 /ml ； 在步骤的精子溶液中加入 1.81l 的 MITO 浓储液， 使其终浓度为 3.4510-5mM/L， 轻轻摇动将液体摇匀 ； 在 37避光染色 10 分 ； 权 利 要 求 书 CN 103822816 A 2 2/2 页 3 染色结束后， 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲 液， 轻轻摇动 ； 1500rpm。
7、 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲液， 轻轻摇 动 ； 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 加入 250l staining talp 精子染色缓冲液 ； （3） 精子混合 ： 将步骤 （1）用 FITC 染色后的精子与步骤 （2）用 MITO 染色后的精子等量混合， 放在 37， 3h ； （4） 检测 ： 对步骤 （1） 用 FITC 染色后的精子、 步骤 （2） 用 MITO 染色后的精子进行荧光检测 ； 对步骤 （3） FITC 染色后的精子与 MITO 染色后的精子等量混合后 3h 的混合精子进 行荧光检测 。 权 利 要 。
8、求 书 CN 103822816 A 3 1/7 页 4 使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定混合精子的方法 技术领域 0001 本发明属于一种精子鉴定方法， 特别涉及一种使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定混 合精子的方法。 背景技术 0002 不同物种的精子从形态上具有一定差别， 可以通过形态进行辨别， 但有些物种的 精子形态相近、 大小、 精头部轮廓、 尾部的长度仅仅通过显微镜进行辨别具有一定难度， 特 别是将两种精子混合后很难再区分彼此。 目前对于形态相近的精子最好的方法就是通过不 同的颜色进行辨别。将不同精子用不同染料染色后混合， 可以通过各自的颜色来区分不同 的精子， 。
9、但荧光染料品种很多， 由于染料没有特异性， 因此混合后的不同精子染色后极易发 生串色现象， 串色后染成不同颜色的精子就变成同样颜色无法区分 ； 有的对精子活力有影 响 ； 有的荧光持续时间短。为此， 需要寻找出一种即能不影响精子活力， 又可以不串色的将 形态相近、 无法通过显微镜进行区别的精子进行辨别的方法。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定混合精子的方法， 该 技术原理是利用 FITC 可以与精子膜蛋白结合发出黄绿色荧光， MITO 与精子线粒体结合发 出红色荧光， FITC 与 MITO 对精子活力均无影响， 两种不同精子用两种染料各自。
10、染色后混合 在荧光下可区分两种精子。 0004 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ： 一种使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定 混合精子的方法， 其特征在于 ： 它包括以下步骤 ： 0005 一、 配制试剂 ： 0006 （1） 配置 FITC 浓储液 ： 0007 将FITC粉末中加入DMSO， 使其终浓度为0.5M， 分装后避光在-20保存， 使用期限 为 1 年 ； 0008 （2） 配置 MITO 浓储液 ： 0009 将 MITO 粉末中加入 DMSO, 使其终浓度为 0.069mM/L， 分装后避光在 -20保存， 使 用期限为 1 年 ； 0010 （3） 配置 sta。
11、ining talp 精子染色缓冲液 ： 0011 说 明 书 CN 103822816 A 4 2/7 页 5 0012 二、 精子染色 ： 0013 （1） 精子 FITC 染色 ： 0014 取500万精子加入5ml的staining talp精子染色缓冲液， 使精子终浓度为100 万 /ml ； 0015 在步骤的精子溶液中加入0.75l的FITC浓储液， 使其终浓度为0.077mM/L， 轻轻摇动将染色液摇匀 ； 0016 在 37避光染色 40 分， 将染色的精子轻轻摇晃 ； 0017 染色结束后， 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining ta。
12、lp 精子染色 缓冲液， 轻轻摇动 ； 0018 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲液， 轻轻 摇动 ； 0019 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 加入 250l staining talp 精子染色缓冲液 ； 0020 （2） 精子 MITO 染色 ： 0021 取 500 万精子加入 5ml 的 staining talp 精子染色缓冲液， 使精子终浓度 为 100 万 /ml ； 0022 在 步 骤 的 精 子 溶 液 中 加 入 1.81l 的 MITO 浓 储 液， 使 其 终 浓 度 为 3.4510-。
13、5mM/L， 轻轻摇动将液体摇匀 ； 0023 在 37避光染色 10 分 ； 0024 染色结束后， 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色 缓冲液， 轻轻摇动 ； 0025 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲液， 轻轻 摇动 ； 0026 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 加入 250l staining talp 精子染色缓冲液 ； 0027 （3） 精子混合 ： 0028 将步骤 （1） 用 FITC 染色后的精子与步骤 （2） 用 MITO 染色后的精。
14、子等量混合， 放在 说 明 书 CN 103822816 A 5 3/7 页 6 37， 3h ； 0029 （4） 检测 ： 0030 对步骤 （1） 用 FITC 染色后的精子、 步骤 （2） 用 MITO 染色后的精子进行荧光检 测 ； 0031 对步骤 （3） FITC 染色后的精子与 MITO 染色后的精子等量混合后 3h 的混合精子 进行荧光检测。 0032 本发明的有益效果是 ： 在不影响精子活力的条件下， 只通过两种荧光染光就可将 形态相近的精子在一定时间内区分出来。 0033 1、 使用这两个荧光染料都不影响精子的活力 0034 染色前精子活力染色后精子活力 未染色组0.65。
15、 FITC 组0.650.62 MITO 组0.650.6 0035 染色组与未染色组的活力差异不显著。 0036 2、 使用这两个荧光染料， 不会短时间内串色 ； 0037 两种颜色精子以 1:1 进行混合， 混合 3h 后统计结果 0038 统计 1 统计 2 统计 3 总计 绿色精子 526047159 红色精子 555243150 0039 0040 混合后 3h 精子的比例也趋近 1:1。 0041 3、 染料短时间内不褪色 0042 3h 精子荧光强度变化 0043 1h2h3h FITC + + + MITO + + + 0044 ( 注 ：“+” 代表荧光强度） 附图说明 00。
16、45 图 1 是实施例 1 的 FITC 染色后牛精子灰度图 ； 0046 图 2 是实施例 1 的 MITO 染色后羊精子灰度图 ； 0047 图 3 是实施例 1 的 FITC 染色后的牛精子与 MITO 染色后的羊精子等量混合后， 放 在 37， 3h， 荧光下观察灰度图 ； 0048 图 4 是实施例 2 的 FITC 染色后牛精子灰度图 ； 0049 图 5 是实施例 2 的 MITO 染色后牛精子灰度图 ； 0050 图 6 是实施例 2 的 FITC 染色后的牛精子与 MITO 染色后的牛精子等量混合后， 放 在 37， 3h， 荧光下观察灰度图。 具体实施方式 说 明 书 CN。
17、 103822816 A 6 4/7 页 7 0051 下面结合实施例说明本发明， 这里所述实施例的方案， 不限制本发明， 本领域的专 业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化， 所述的这些改进和变化都应视为在本 发明的保护范围内， 本发明的范围和实质由权利要求来限定。 0052 实施例中所用药品FITC粉末、 DMSO均购自SIGMA公司， MITO粉末购自INVITROGEN 公司， 没有特别指出的试剂均为市售产品。 0053 本发明中出现的英文缩写字母的解释如下 ： 0054 1、 FITC 粉末的英文名称是 ： Fluorescein isothiocyanate isomer I。
18、， sigma， F7250， 中文名称是 ： 异硫氰酸荧光素异构体 I， 0055 2、 DMSO 的英文名称是 ： DIMETHYL SULPHOXIDE， 中文名称是 ： 二甲基亚砜， 0056 3、 MITO 粉末的英文名称是 ：Red FM-Special Packaging,invitrogen， M22425， 中文名称是 ： 线粒体红色荧光探针， 0057 4、 HEPES 的中文名称是 ： 4- 羟乙基哌嗪乙磺酸 ;N-(2- 羟乙基 ) 哌嗪 -N-2- 乙烷 磺酸。 0058 实施例 1 ： 0059 一种使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定混合精子的方法， 它包括。
19、以下步骤 ： 0060 1、 配制试剂 ： 0061 （1） 配置 FITC 浓储液 ： 0062 将FITC粉末中加入DMSO， 使其终浓度为0.5M， 分装后避光在-20保存， 使用期限 为 1 年 ； 0063 （2） 配置 MITO 浓储液 ： 0064 将 MITO 粉末中加入 DMSO, 使其终浓度为 0.069mM/L， 分装后避光在 -20保存， 使 用期限为 1 年 ； 0065 （3） 配置 staining talp 精子染色缓冲液 ： 0066 0067 2、 精子染色 ： 说 明 书 CN 103822816 A 7 5/7 页 8 0068 （1） 牛精子 FITC。
20、 染色 ： 0069 取 500 万牛精子加入 5ml 的 staining talp 精子染色缓冲液， 使精子终浓度为 100 万 /ml ； 0070 在步骤的精子溶液中加入 0.75l 的 FITC 浓储液， 使其终浓度为 0.077mM/ L， 轻轻摇动将染色液摇匀 ； 0071 在 37避光染色 40 分， 每隔 10 分将染色的精子轻轻摇晃 ； 0072 染色结束后， 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色 缓冲液， 轻轻摇动 ； 0073 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining tal。
21、p 精子染色缓冲液， 轻轻 摇动 ； 0074 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 加入 250l staining talp 精子染色缓冲液 ； 0075 （2） 羊精子 MITO 染色 ： 0076 取 500 万羊精子加入 5ml 的 staining talp 精子染色缓冲液， 使精子终浓度为 100 万 /ml ； 0077 在 步 骤 的 精 子 溶 液 中 加 入 1.81l 的 MITO 浓 储 液， 使 其 终 浓 度 为 3.4510-5mM/L， 轻轻摇动将液体摇匀 ； 0078 在 37避光染色 10 分 ； 0079 染色结束后， 1500rpm 离心 10 。
22、分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色 缓冲液， 轻轻摇动 ； 0080 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲液， 轻轻 摇动 ； 0081 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 加入 250l staining talp 精子染色缓冲液 ； 0082 （3） 、 精子混合 ： 0083 将步骤 （1） 用 FITC 染色后的牛精子与步骤 （2） 用 MITO 染色后的羊精子等量混合， 放在 37， 3h ； 0084 （4） 、 检测 ： 0085 对步骤 （1） 用 FITC 和步骤 （2）。
23、 用 MITO 染色后的牛精子和羊精子进行荧光检测 ； 见图 1 为 FITC 染色后牛精子， 见图 2 为 MITO 染色后羊精子 ； 0086 对步骤 （3） FITC 染色后的牛精子与 MITO 染色后的羊精子等量混合后， 放在 37， 3h， 在荧光下进行观察 ； 见图 3， 绿色的为牛精子， 红色的为羊精子。 0087 实施例 2 ： 一种使用荧光染料 FITC 与 MITO 鉴定混合精子的方法， 它包括以 下步 骤 ： 0088 1、 配制试剂 ： 0089 （1） 配置 FITC 浓储液 ： 0090 将FITC粉末中加入DMSO， 使其终浓度为0.5M， 分装后避光在-20保存。
24、， 使用期限 为 1 年 ； 0091 （2） 配置 MITO 浓储液 ： 0092 将 MITO 粉末中加入 DMSO, 使其终浓度为 0.069mM/L， 分装后避光在 -20保存， 使 用期限为 1 年 ； 说 明 书 CN 103822816 A 8 6/7 页 9 0093 （3） 配置 staining talp 精子染色缓冲液 ： 0094 0095 2、 精子染色 ： 0096 （1） 牛精子 FITC 染色 ： 0097 取 500 万牛精子加入 5ml 的 staining talp 精子染色缓冲液， 使精子终浓度为 100 万 /ml ； 0098 在步骤的牛精子溶液中加。
25、入0.75l的FITC浓储液， 使其终浓度为0.077mM， 轻轻摇动将染色液摇匀 ； 0099 在 37避光染色 40 分， 每隔 10 分将染色的牛精子轻轻摇晃 ； 0100 染色结束后， 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色 缓冲液， 轻轻摇动 ； 0101 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲 液， 轻 轻摇动 ； 0102 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 加入 250l staining talp 精子染色缓冲液 ； 0103 （2） 牛精子 MIT。
26、O 染色 0104 取 500 万牛精子加入 5ml 的 staining talp 精子染色缓冲液， 使精子终浓度为 100 万 /ml ； 0105 在步骤的牛精子溶液中加入 1.81l 的 MITO 浓储液， 使其终浓度为 3.4510-5mM， 轻轻摇动将液体摇匀 ； 0106 在 37避光染色 10 分 ； 0107 染色结束后， 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色 缓冲液， 轻轻摇动 ； 0108 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 再加入 5ml staining talp 精子染色缓冲液， 轻轻 摇动 ； 0。
27、109 1500rpm 离心 10 分， 弃上清， 加入 250l staining talp 精子染色缓冲液 ； 说 明 书 CN 103822816 A 9 7/7 页 10 0110 3、 精子混合 0111 将步骤 （1） 用 FITC 染色后的牛精子与步骤 （2） 用 MITO 染色后的牛精子等量混合， 放在 37， 3h ； 0112 4、 检测 0113 FITC、 MITO 染色后荧光检测 ； 图 4 为 FITC 染色后牛精子和图 5 为 MITO 染色后 牛精子 ； 0114 FITC 染色后的牛精子与 MITO 染色后的牛精子等量混合后， 放在 37， 3h， 在荧 光下进行观察 ； 见图 6 ； 0115 结论 ： 两种颜色的精子混合 3h 后仍可以区分， 并没有都串成相同的颜色无法分 辨。因此， 在区分任何相同或不同动物的精子时使用这两种荧光染料， 既对精子无害， 又可 以区分不同和相同精子。 说 明 书 CN 103822816 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103822816 A 11 2/2 页 12 图 4 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103822816 A 12 。