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1、(10)申请公布号 CN 103913581 A (43)申请公布日 2014.07.09 CN 103913581 A (21)申请号 201310601423.4 (22)申请日 2013.11.20 G01N 33/92(2006.01) G01N 21/31(2006.01) G01N 30/06(2006.01) (71)申请人 天津市宝坻区人民医院 地址 301800 天津市宝坻区广川路 8 号 (72)发明人 李立和 郑宝永 王彦平 李铮 刘果艳 (54) 发明名称 血清中甘油三酯的循环酶测定方法 (57) 摘要 本发明公开了一种血清中甘油三酯的循环酶 测定方法， 属于利用可见光。
2、， 通过测试反应的结果 产生颜色变化来测试材料的方法。技术方案是 ： 试剂 I 中含有甘油激酶、 3- 磷酸甘油脱氢酶、 磷 酸甘油氧化酶、 过氧化物酶、 三磷酸腺苷、 NADH、 4- 氨基安替比林、 2， 4- 二氯酚等有效成分 ； 试剂 II 仅有脂蛋白脂肪酶有效成分。血清游离甘油在 试剂I中甘油激酶， 3-磷酸甘油脱氢酶， 磷酸甘油 氧化酶， 过氧化物酶催化下与三磷酸腺苷、 NADH、 氧气、 4- 氨基安替比林、 2， 4- 二氯酚等循环反应 生成醌亚胺， 加入试剂 II 后， 甘油三酯水解生成 甘油， 再进行循环反应， 仪器以试剂 I 反应产生的 醌亚胺为空白， 由试剂 II 反应。
3、产生的醌亚胺计算 出甘油三酯的含量。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103913581 A CN 103913581 A 1/1 页 2 1. 一种血清中甘油三酯的循环酶测定方法， 其特征在于循环酶及底物同在试剂 I 中， 试剂 II 仅含有脂蛋白脂肪酶有效成分 ； 其测定方法为 ： 血清先与试剂 I 于 37温浴 3 5 分钟， 血清中游离甘油与试剂 I 进行循环反应生成醌亚胺， 加入试剂 II 后于 37温浴 4 7 分钟，。
4、 甘油三酯水解后产生甘油再经循环反应生成醌亚胺 ； 反应达到一定时间后， 仪器在 500520nm波长处检测， 以试剂I反应产生的醌亚胺为空白， 由试剂II反应产生的醌亚胺 计算出甘油三酯的含量， 计算公式为 ： ODTG OD2-OD1(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2) 甘油三酯浓度 FODTG 其中 ODTG是甘油三酯产生的吸光度， OD1是样品加入试剂 I 反应后测得的吸光度， OD2 是样品加入试剂 II 反应后测得的吸光度， SV 是血清的体积， R1V1是试剂 I 的体积， R2V2是 试剂 II 的体积， F 是校正因数。 2. 根据权利要求 1 所述的血清中甘油三。
5、酯的循环酶测定方法， 其特征在于第一步和第 二步反应均采用循环酶法测定甘油， 生成红色醌亚胺进行测定。 3. 根据权利要求 1 所述的血清中甘油三酯的循环酶测定方法， 其特征在于试剂 I 每 升 Tris-HCl 缓 冲 液 内 含 Tris100mmol 300mmol、 2， 4- 二 氯 酚 1.0mmol 3.0mmol、 MgSO49.0mmol 15.0mmol、 胆酸钠 3.0mmol 5.0mmol、 三磷酸腺苷 1.5mmol 2.5mmol、 甘油激酶 100U 160U、 磷酸甘油氧化酶 1200U 2000U、 过氧化物酶 1000U 1400U、 4- 氨 基安替比林。
6、 1.5mmol 2.5mmol、 甘油 -3- 磷酸脱氢酶 1200U 2000U、 NADH0.8mmol 1.2mmol、 Proclin-300 防 腐 剂 100l 300l ； 试 剂 II 每 升 Tris-HCl 缓 冲 液 内 含 Tris100mmol 300mmol、 脂蛋白脂肪酶 1800U 2100U、 Triton X-1000.08g 0.16g、 Proclin-300 防腐剂 100l 300l。 4. 根据权利要求 3 所述的血清中甘油三酯的循环酶测定方法， 其特征在于试剂 I 和试 剂 II 中 Tris-HCl 缓冲液的 pH 值为 7.60.2。 5.。
7、 根据权利要求 3 所述的血清中甘油三酯的循环酶测定方法， 其特征在于测定的体积 比为 ： 样品试剂 I 试剂 II 3 300 500 30 70。 权 利 要 求 书 CN 103913581 A 2 1/6 页 3 血清中甘油三酯的循环酶测定方法 技术领域 0001 本发明属于一种包含酶的测定方法 ； 或是利用可见光， 通过测试反应的结果产生 颜色变化来测试材料的方法， 特别是涉及一种用生化分析仪检测血清中甘油三酯的循环酶 测定方法。 背景技术 0002 血清中甘油三脂 (TG) 的测定方法一般可分为化学法、 酶法和色谱法 3 大类。本发 明介绍一种循环酶法测定血清中的甘油三酯， 甘油三。
8、酯(TG)在脂蛋白脂肪酶(LPL)催化下 生成甘油和脂肪酸， 甘油和 ATP 在甘油激酶 (GK) 催化下生成甘油 -3- 磷酸 (G-3P)， 被带入 循环反应中， 通过磷酸甘油氧化酶 (GPO) 氧化为磷酸二羟丙酮 (DHAP)， DHAP 被甘油 -3 磷酸 脱氢酶(G-3PDH)又还原为G-3P， 同时伴有NADH向NAD+的转化， 在反复循环中G-3P和DHAP 的量不变， 而产物 H2O2累积的量决定于反应时间和每分钟循环次数， 因此， 其灵敏度大大超 过一般的酶法分析， 检测产物H2O2可偶联过氧化物酶(POD)， 可通过Trinder反应比色测定。 0003 其理论推导如下 ：。
9、 0004 测定反应如图 2。 0005 0006 设 SV 1.5l， R1 200l， R2 50l， t1 3min， t2 5min， 甘油三酯线性 范围 11.00mmol/L， 血清中游离甘油病理高值为 0.60mmol/L。 0007 根据公式推导 ： 0008 0009 0010 0011 已知若TG线性范围为11.0mmol/L， SV1.5l， R1200l， R2 50l， t1 3min， t2 5min。 0012 0013 Vmax 381.6U/L 0014 在试剂 I 中的 LPL 的浓度为 ： 643.9U/L251.5/50 1919.45U/L 0015 。
10、说 明 书 CN 103913581 A 3 2/6 页 4 0016 已知 ： 0017 在第一步反应中 ： 0018 FG 11.6mmol/L1.5/1.5+200+50 65.60610-6mol/L 0019 ATP 2200/1.5+200+50 1.5910-3mol/L 0020 约为 122 倍 0021 则公式可变为 ： 0022 0023 0024 根据公式 ： 0025 Vmax 100.4U/L 0026 甘油激酶的用量为 ： 100.4U/L251.5/200 126.29U/L 0027 磷酸甘油氧化酶用量 ： 0028 G-3-P FG 65.60610-6mo。
11、l/L 0029 根据公式 ： 0030 Vmax 1211U/L 0031 磷酸甘油氧化酶在试剂 I 中的浓度应为 ： 1211U/L251.5/200 1523U/L 0032 3- 磷酸甘油脱氢酶的用量 ： 0033 NADH 在试剂 I 中的配置浓度为 1.0mmol/L， 在反应液的浓度为 1.5910-3mol， 远大于公式可按单底物反应进行计算， 根据公式 0034 0035 3- 磷酸甘油脱氢酶的用量为 ： 428U/L 0036 在试剂 I 中浓度为 ： 428U/L251.5/200 538.2U/L， 在循环酶法中为使得 DHAP 迅速转化为甘油 -3 磷酸， 工具酶用量。
12、应为 3538.2U/L 1615U/L 0037 过氧化物酶的用量为 ： 0038 在试剂 I 中 2， 4- 二氯酚的配置浓度为 2.0mmol/L， 4- 氨基安替比林的浓度为 2.0mmol/L， 由于反应体系中远大于米氏常数， 故上式可变为 ： 0039 0040 0041 说 明 书 CN 103913581 A 4 3/6 页 5 0042 已知其中 H2O2 69.1810-6mol/L 0043 大于 H2O2 为终点法测定， 反应时间为 2min 0044 0045 工具酶过氧化物酶的用量为 ： 0046 Vmax 120.56mol/min.L 103.19U/L 004。
13、7 在试剂 I 中浓度为 ： 103.19U/L251.5/200 389U/L， 在循环酶法中为使得 H2O2 迅速转化为醌类化合物， 应使工具酶用量达到 3 倍， 所以， 工具酶用量应为 3389U/L 1167U/L。 0048 根据反应式及酶动力学方程计算出工具酶及底物用量， 酶类激活剂及防腐剂， 该 试剂盒的配方为 ： 试剂 I 每升 Tris-HCl 缓冲液内含 Tris100mmol 300mmol、 2， 4- 二氯酚 1.0mmol 3.0mmol、 MgSO49.0mmol 15.0mmol、 胆酸钠 3.0mmol 5.0mmol、 三磷酸腺苷 1.5mmol 2.5mm。
14、ol、 甘油激酶 100U 160U、 磷酸甘油氧化酶 1200U 2000U、 过氧化物酶 1000U1400U、 4-氨基安替比林1.5mmol2.5mmol、 甘油-3-磷酸脱氢酶1200U2000U、 NADH0.8mmol 1.2mmol、 Proclin-300 防腐剂 100l 300l ； 试剂 II 每升 Tris-HCl 缓冲液内含 Tris100mmol 300mmol、 脂蛋白脂肪酶 1800U 2100U、 TritonX-1000.08g 0.16g、 Proclin-300 防腐剂 100l 300l。 0049 生化分析仪检测血清中 TG 采用的是酶法， 一般采。
15、用 LPL、 GPO、 POD、 4- 氨基安替比 林和酚等试剂的方法 (GPO-PAP 法 )。本发明采用甘油循环酶法进行测定， 首先血清内游离 甘油进行甘油循环酶法进行测定， 产生红色醌亚胺， 加入第二试剂后， 脂蛋白脂肪酶水解甘 油三酯产生甘油， 甘油与反应体系中循环酶和底物反应， 在适当的时间内测定， 以第一步产 生的醌亚胺为空白， 以第二步反应产生的醌亚胺为测定反应， 计算出甘油三酯的浓度， 本发 明的技术特点是更适合微量检测， 受脂血、 黄疸、 溶血影响小。 发明内容 ： 0050 为了解决现有技术中血清中 TG 的测定方法存在内源性甘油干扰的问题， 本发明 提供一种经济方便易行，。
16、 准确性更高、 能够消除内源性甘油影响的血 清甘油三酯测定方 法。 0051 解决该技术问题采用的技术方案是 ： 双色原物质及循环酶同在试剂 I 中， 试剂 II 仅含有脂蛋白脂肪酶有效成分 ； 其测定方法为 ： 血清先与试剂 I 于 37温浴 3 5 分钟， 血 清中游离甘油与试剂 I 反应生成醌亚胺， 加入试剂 II 于 37温浴 4 7 分钟， 甘油三酯水 解后经一系列反应生成红色的醌亚胺。仪器在 500nm 波长处检测， 以试剂 I 反应的醌亚胺 为空白， 由试剂 II 反应产生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量。 0052 上 述 试 剂 I 每 升 Tris-HCl 缓 冲 液 内 含 。
17、Tris200mmol、 2， 4- 二 氯 酚 2.0mmol、 MgSO412.0mmol、 胆酸钠 4.0mmol、 三磷酸腺苷 2.0mmol、 甘油激酶 130U、 磷酸甘油氧化 酶 1600U、 过氧化物酶 1200U、 4- 氨基安替比林 2.0mmol、 甘油 -3- 磷酸脱氢酶 1600U、 NADH1.0mmol、 Proclin300防腐剂200l ； 试剂II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris200mmol、 脂蛋白脂肪酶 1950U、 Triton X-1000.12g、 Proclin300 防腐剂 200l。 0053 上述试剂 I 和试剂 II 中 Tris。
18、-HCl 缓冲液的 pH 值为 7.60.2。 说 明 书 CN 103913581 A 5 4/6 页 6 0054 上述测定中反应物的体积比为 ： 样品试剂I试剂II330050030 70。 0055 本发明试剂 I 中含有甘油激酶、 3- 磷酸甘油脱氢酶、 磷酸甘油氧化酶、 过氧化物 酶、 三磷酸腺苷、 NADH、 4- 氨基安替比林、 2， 4- 二氯酚等有效成分 ； 试剂 II 仅有脂蛋白脂肪 酶有效成分。血清中游离甘油在试剂 I 中甘油激酶， 3- 磷酸甘油脱氢酶， 磷酸甘油氧化酶， 过氧化物酶催化下与三磷酸腺苷、 NADH、 氧气、 4- 氨基安替比林、 2， 4- 二氯酚等循。
19、环反应生 成红色醌亚胺， 加入试剂 II 后， 甘油三酯水解后生成甘油， 再进行循环反应生成红色醌亚 胺， 仪器在 500 520nm 波长处检测， 以试剂 I 反应产生的醌亚胺为空白， 由试剂 II 反应产 生的醌亚胺计算出甘油三酯的含量。本发明检测时不受内源性甘油影响， 其使用方法和范 围与原有酶法相同， 是一种更适宜微量检测的甘油三酯检测方法。 0056 本发明与现有技术相比有如下优点 ： 不受内源性甘油影响， 线性范围可达 11.0mmol/L。 其使用方法和范围与原有酶法相同， 不会增加实验人员的负担， 不增加试剂成 本， 经济方便易行， 受脂血、 黄疸、 溶血等影响小， 是一种准确。
20、性更高的 TG 检测方法。 附图说明 0057 附图是本发明测定健康人体 TG 的反应曲线图。 图 2 是甘油三酯分解及甘油循环反应图。 具体实施方式 ： 0058 下面通过实施例及附图对本发明做进一步详细说明。 0059 实施例 1 0060 试剂的组成 ： 0061 a. 试剂 I ： 0062 试 剂 I 每 升 Tris-HCl 缓 冲 液 内 含 Tris200mmol、 2， 4- 二 氯 酚 2.0mmol、 MgSO412.0mmol、 胆酸钠 4.0mmol、 三磷酸腺苷 2.0mmol、 甘油激酶 130U、 磷酸甘油氧化 酶 1600U、 过氧化物酶 1200U、 4- 。
21、氨基安替比林 2.0mmol、 甘油 -3- 磷酸脱氢酶 1600U、 NADH1.0mmol、 Proclin300 防腐剂 200l。 0063 b. 试剂 II ： 0064 试剂 II 每升 Tris-HCl 缓冲液内含 Tris200mmol、 脂蛋白脂肪酶 1950U、 Triton X-1000.12g、 Proclin300 防腐剂 200l。 0065 上述试剂 I 和试剂 II 中 Tris-HCl 缓冲液的 pH 值为 7.60.2。 0066 c. 标准液 ： 2.0mmol/L 三油酸酯水溶液。 0067 其中， MgSO4为甘油激酶的激活剂， Triton X-10。
22、0 为表面活性剂， Proclin-300 为 液体高效防腐剂， 胆酸钠为抑菌剂。 0068 实施例 2. 0069 测定程序 0070 在日本 OLYMPUS AU2700 全自动化生化分析仪上， 仪器自动将 1.5l 样品加入到 200l 试剂 I 中混匀， 37孵育 3 分钟， 加入 50l 试剂 II 混匀， 37孵育 5 分钟， 全自动 分析仪在 500nm 波长处检测， 仪器自动计算出 TG 结果， 具体见表 1。 说 明 书 CN 103913581 A 6 5/6 页 7 0071 表 1 本发明自动化生化分析仪测试条件 0072 0073 反应 ODTG计算值 OD2-OD1。
23、(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2) 0074 甘油三酯浓度 FODTG 0075 其中 ODTG是甘油三酯产生的吸光度。OD1是样品加入试剂 I 反应后测得的吸光度， OD2是样品加入试剂 II 反应后测得的吸光度， SV 是血清的体积， R1V1是试剂 I 的体积， R2V2 是试剂 II 的体积。F 是校正因数。 0076 加入试剂II后OD1的稀释倍数为(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)， 加入试剂II后的吸 光度即为 OD1(SV+R1V1)/(SV+R1V1+R2V2)。所以， 由甘油三酯产生的醌亚胺的吸光度为 ： ODTGOD2-OD1(SV+R1V1)。
24、/(SV+R1V1+R2V2)， 即ODTGOD2-(1.5+200)/(1.5+200+50)OD1。 只要测出 OD1和 OD2即可计算 出甘油三酯的浓度。 0077 下面通过采用三种不同的方法检测血清中的甘油回收率， 来进一步说明本发明的 积极效果。甘油回收率是反应后测定的甘油数值与加入的甘油数值的比值的百分率， 在本 反应中甘油为甘油三酯的等比产物， 甘油测定回收率以加入的甘油不影响甘油三酯测定为 最好， 即甘油回收率越低， 说明甘油对甘油三酯测定影响越低， 甘油未计入甘油三酯测定值 内。 0078 1. 检测对象 ： 健康体检人员 86 人， 其中男性 52 人， 平均年龄 42.5。
25、 岁 ； 女性 34 人， 平均年龄 39.5 岁， 空腹采血。 0079 2. 采用方法及试剂 0080 2.1 试剂 ： 0081 (1) 方 法 A ： 试 剂 I 每 升 Tris-HCl 缓 冲 液 内 含 Tris200mmol、 2， 4- 二 氯 酚 2.0mmol、 MgSO412.0mmol、 胆酸钠 4.0mmol、 三磷酸腺苷 2.0mmol、 甘油激酶 130U、 磷酸甘油 氧化酶 1600U、 过氧化物酶 1200U、 4- 氨基安替比林 2.0mmol、 甘油 -3- 磷酸脱氢酶 1600U、 NADH1.0mmol、 Proclin300防腐剂200l ； 试剂。
26、II每升Tris-HCl缓冲液内含Tris200mmol、 脂蛋白脂肪酶 1950U、 Triton X-1000.12g、 Proclin300 防腐剂 200l。 0082 (2)方法B ： 试剂I与试剂II按41配置成单一试剂进行测定， 测定波长500nm， 反应时间 8.1min。 0083 (3) 方法 C ： 高效液相色谱法采用岛津 LC-10A 高效液相色谱仪， 流动相为含 1异 丙醇和 0.5乙腈的正己烷， 流速 1.2mL/min， 检测波长 230nm。 0084 (4) 甘油 ( 分析纯， sigma 公司， 分子量 92.09， 密度为 1.2613mg/dl， 25 。
27、)。 0085 2.2. 仪器 ： 日本 Olympus AU2700 型全自动生化分析仪 ； 岛津 LC-10A 高 0086 效液相色谱仪。 说 明 书 CN 103913581 A 7 6/6 页 8 0087 2.3. 方法 0088 2.3.1 分别用试剂 A、 B、 C 三种方法测定 86 份健康人群甘油三脂水平， 0089 并进行结果比较。 0090 2.3.2 将上述血清混合配制成混合血清， 分别加入 0、 0.85、 1.70、 3.40mmol/L 甘 油， 分别用试剂 A、 B 两种方法测定， 比较两种方法的回收试验。 0091 2.3.3 测定方法 0092 方法 A 。
28、： 样品试剂 I 试剂 II 1.5 200 50， 37， 样品与试剂 I 温浴 3 分 钟， 加入试剂 II， 反应 5 分钟， 500nm 波长处终点法测定。 0093 试剂 B ： 样品试剂 1 100， 37， 反应时间 8.1 分钟， 500nm 波长处终点法测 定。 0094 方法C 流动相为含1异丙醇和0.5乙腈的正己烷， 流速1.2ml/min， 检测波长 230nm。取样品制备中的正己烷层直接进样， 测定总甘油 (TTG) 时进样体积 5l， 测定游离 甘油时 10l。将标准溶液的浓度对甘油 / 内标峰面积比进行线性回归， 得回归方程， 用于 样品甘油浓度计算， 总甘油与游。
29、离甘油之差即为真正甘油三酯的值。 0095 3. 三种方法测定 TG 比较 ： 0096 通过统计学分析 ： 采用方法 A 与 C 测定结果无显著性差异， t 0.97， P 0.4215， 相关性良好， r 0.9701， Y方法 A 1.2031+0.9620X方法 C； 方法 A 可以消除游离甘油干扰， 而 方法 B 不能消除游离甘油影响， 见表 2 ； 采用方法 A 与 B 测定结果有显著性差异， t 9.65， P 0.0031。 0097 表 2. 回收实验数据表 0098 0099 本发明方法中， 在第一步预孵育期， 游离甘油转化为醌亚胺， 在加入试剂 II 后， 启 动TG水解。
30、反应， TG转化为醌亚胺， 反应曲线见图1， 仪器将第一步反应产生的红色醌亚胺为 空白， 以第二步反应产生的醌亚胺计算出 TG 的含量， 为真正 TG 含量。 0100 方法 B 单一试剂中， 游离甘油和 TG 同时反应生成醌亚胺， 计算结果为游离甘油和 TG 之和。高效液相色谱法可分别测定出总甘油和游离甘油的值， 不受游离甘油影响。 0101 经过以上比较可看出， 本发明试剂 II 仅有脂蛋白脂肪酶， 其它为试剂 I， 通过改变 试剂 I、 II 的组分能够保证血清中甘油三酯检测的准确性。 说 明 书 CN 103913581 A 8 1/1 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103913581 A 9 。