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1、(10)申请公布号 CN 103843664 A (43)申请公布日 2014.06.11 CN 103843664 A (21)申请号 201410110179.6 (22)申请日 2014.03.24 A01H 4/00(2006.01) A01G 31/00(2006.01) (71)申请人 甘肃农业大学 地址 730070 甘肃省兰州市安宁区营门村 1 号 (72)发明人 李捷 冯丽丹 王有科 张宝琳 张广忠 蔡国军 (74)专利代理机构 甘肃省知识产权事务中心 62100 代理人 张克勤 (54) 发明名称 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法 (57) 摘要 本发。
2、明公开了一种 Lycium exsertum 组织培 养及快速繁殖方法， 以解决引进枸杞的繁殖问题。 该方法包括如下步骤 ： 外殖体处理、 初代培养、 继 代培养、 生根培养、 炼苗以及移栽， 本发明的优点 如下 ： A. 本发明中对 Lycium exsertum 进行继代 培养时， 仅使用了 6- 苄氨基腺嘌呤与吲哚 -3- 乙 酸配比， 极大地降低了激素积累对多次继代的影 响， 同时也降低了成本。B. 本发明中对 Lycium exsertum 的继代苗木进行生根培养时， 所采用的 培养基配比中没有添加任何激素， 做到了培养基 配制的简化和成本的降低， 并且效果较好。C. 本 发明中泥炭。
3、、 蛭石、 珍珠岩 1 1 1 的移栽基质 混合配比， 能够在栽培过程起到很好的保水和保 温的作用， 能够提高移栽的成活率。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书5页 (10)申请公布号 CN 103843664 A CN 103843664 A 1/2 页 2 1. 一种 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特征在于该方法包括如下步 骤 ： A、 外殖体处理采用茄科枸杞属 （Lycium exsertum） 幼嫩茎段作为外殖体， 剪去叶片， 留 少量叶柄， 每 2。
4、-3 个芽剪成一段， 将茎段洗去污渍， 后用水冲洗干净， 冲洗时间为 5-10min， 然后将其放入超净工作台中 , 进行消毒， 消毒后剪去茎段两端， 放于培养皿中备用 ； B、 初代培养 以 MS 培养基为基础培养基进行初代培养 ； C、 继代培养 培养材料为初代培养获得的单苗或丛芽， 以MS为基本培养基， 添加6-苄氨基腺嘌呤与 吲哚 -3- 乙酸 ； D、 生根培养 ： 以 MS 为基本培养基 ； E、 炼苗移栽 炼苗 ： 将生根培养的苗木在与移栽环境相同的条件下闭瓶炼苗 5-7d ； 移栽 ： 炼苗移栽 基质以泥炭、 蛭石、 珍珠岩 1 ： 1 ： 1 混合配制， 将苗子移栽到装有基质。
5、的花盆中， 浇透水后， 覆 膜。 2. 根据权利要求 1 所述的 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特征在于 ： 所述步骤 A 消毒方案如下 ： 先用 75% 酒精振荡消毒 5s， 再用 0.1 % 升汞溶液消毒 66.5 分 钟， 最后用无菌水清洗 3-4 次。 3.根据权利要求2所述的Lycium exsertum组织培养及快速繁殖方法， 其特征在于 ： 所 述步骤 B 的培养过程为以 MS 培养基为基础培养基， 添加 0.05mg/L 的萘乙酸、 3% 蔗糖和 4g 琼脂， 使用 NaOH 或 HCl 将培养基 pH 值调至 5.8， 培养条件是光强为 3000。
6、lx 全光照 24h， 温 度为 25， 湿度为 70%RH。 4. 根据权利要求 3 所述的 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特征在于 ： 所述步骤 C 继代培养条件如下 ： 以 MS 培养基为基础培养基， 添加 0.1 mg/L 的 6- 苄氨基腺 嘌呤和 0.05 mg/L 的吲哚 -3- 乙酸， 使用 NaOH 或 HCl 将培养基 pH 值调至 5.8 ； 培养条件是 光强为 3000lx 全光照 24h， 温度为 23， 湿度为 70%RH。 5. 根据权利要求 4 所述的 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特征在于 ： 所述 。
7、6- 苄氨基腺嘌呤和 0.05 mg/L 的吲哚 -3- 乙酸的浓度比为 2:1。 6. 根据权利要求 5 所述的 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特征在于 ： 所述步骤 D 生根培养条件 ： 使用步骤 C 继代培养植株叶片为材料， 以 1/4 的 MS 培养基为基 础培养基， 添加 1.5% 蔗糖和 4g 琼脂， 使用 NaOH 或 HCl 将培养基 pH 值调至 5.8 ； 培养条件 是光强为 3000lx 下 12h 光暗交替， 温度为 23， 湿度为 70%RH。 7. 根据权利要求 5 所述的 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特。
8、征在于 ： 所述步骤D生根培养条件 ： 使用步骤B或步骤C的培养植株叶片为材料进行丛芽增殖培养， 以 1/2MS 培养基为基础培养基， 添加 1.0 mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤、 0.5 mg/L 的吲哚丁酸 ； 培养条件是先在 25下暗培养 7d， 然后在 25、 光强为 3000lx 全光照， 湿度为 70%RH 下培 养至丛芽长出。 8. 根据权利要求 6 或 7 所述的 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特征在 于 ： 所述步骤 E 中炼苗移栽对基质用 0.1% 多菌灵浇透， 移栽时将炼好苗的植株的根部浸入 权 利 要 求 书 CN 103843664 。
9、A 2 2/2 页 3 0.1% 多菌灵和 0.1 g/Ld 的 NAA 混合溶液中浸泡 10min。 9. 根据权利要求 8 所述的 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特征在于 ： 所述步骤 E 中组培苗移栽初期， 设置遮阳网， 光强度为全光照时的 30%。 10. 根据权利要求 9 所述的 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 其特征在于 ： 所述步骤 E 移栽前两日遮光密封保湿培养， 第三日开始每日通风， 通风时间逐日加长， 同时 逐渐增加光强， 直到全天开放 ； 适时浇水， 隔日喷少量 0.1% 多菌灵溶液， 7 天后喷 1/4 的 MS 。
10、营养液， 待幼苗成活后逐渐全光照。 权 利 要 求 书 CN 103843664 A 3 1/5 页 4 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养领域， 具体涉及 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖 方法。 背景技术 0002 茄科枸杞属Lyciumexsertum是从美国引进的茄科枸杞属植物， 主要分布在亚利 桑那沙漠地区， 其进化程度高于我国的枸杞。 在生殖进化上， 已经由雌雄同体和自交不亲和 的二倍体进化到自交亲和的多倍体阶段， 而我国仍处在自交不亲和的二倍体进化阶段。该 种枸杞的引进对于我国枸杞的种质资源的改良有。
11、很大的意义。 该种枸杞引进后面临的首要 问题是进行扩大繁殖。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种 Lycium exsertum 组织培养及快速繁殖方法， 以解决引 进枸杞的繁殖问题。 0004 本发明技术方案如下 ： 本发明种子为茄科枸杞属 （Lycium exsertum）购于美 国的 S&S SEEDS,INC. 联系方式为 P.O. BOX 1275 CARPINTERIA AVE CARPINTERIA,CA 93013,USA。 0005 一种 Lycium exsertum 组织培养方法， 具体步骤如下 ： A、 外殖体处理采用 Lycium exsertum 幼嫩茎段作。
12、为外殖体， 剪去叶片， 留少量叶柄， 每 2-3 个芽剪成一段， 将茎段洗去污渍， 后用水冲洗干净， 冲洗时间为 5-10min， 然后将其放入 超净工作台中 , 进行消毒， 消毒后剪去茎段两端， 放于培养皿中备用 ； 优选的， 消毒的最佳方案如下 ： 先用 75% 酒精振荡消毒 5s， 再用 0.1 % 升汞溶液消毒 66.5 分钟， 最后用无菌水清洗 3-4 次 ； B、 初代培养 以 MS 培养基为基础培养基， 添加不同类型的激素及数量进行初代培养。通过初代培养 可以获得所繁育物种的无菌材料。这一阶段的培养效果依植物种类及培养基成分而异， 可 能形成一个芽或多个芽。 0006 优选的， 。
13、添加 0.05mg/L 的萘乙酸 （NAA） 、 3% 蔗糖和 4g 琼脂， 使用 NaOH 或 HCl 将培 养基 pH 值调至 5.8。培养条件是光强为 3000lx 全光照 24h， 温度为 ： 25， 湿度为 70%RH。 0007 C、 继代培养 在初代培养的基础上获得的芽苗数量不多， 还需进一步扩大繁殖， 才能发挥组织培养 快速繁殖的优势。 0008 通过对 L.exsertum 的最佳培养基的筛选， 培养材料为初代培养获得的单苗或丛 芽， 以 MS 为基本培养基， 添加 6- 苄氨基腺嘌呤与吲哚 -3- 乙酸。 0009 优选的， 继代培养基主要成分以及培养条件如下 ： 以 MS。
14、 培养基为基础培养基， 添 加 0.1 mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤和 0.05 mg/L 的吲哚 -3- 乙酸， 使用 NaOH 或 HCl 将培养基 说 明 书 CN 103843664 A 4 2/5 页 5 pH 值调至 5.8 ； 培养条件是光强为 3000lx 全光照 24h， 温度为 23， 湿度为 70%RH。 0010 优选的， 所述 6- 苄氨基腺嘌呤和 0.05 mg/L 的吲哚 -3- 乙酸的浓度比为 2:1 时， 芽分化系数最高， 生长最旺盛。 0011 D、 生根培养 继代培养扩大繁殖后进行生根诱导获得完整再生的植株。 0012 生根培养有三种优选方案 ： 方案。
15、一、 所述步骤 D 生根培养条件 ： 使用步骤 C 继代培 养植株叶片为材料， 以1/4的MS培养基为基础培养基， 添加1.5%蔗糖和4g琼脂， 使用NaOH 或 HCl 将培养基 pH 值调至 5.8 ； 培养条件是光强为 3000lx 下 12h 光暗交替， 温度为 23， 湿度为 70%RH。 0013 方案二、 使用步骤 B 的培养植株叶片为材料进行丛芽增殖培养， 方案三、 使用步骤 C 的培养植株叶片为材料进行丛芽增殖培养， 方案二和三的培养条 件 ： 以 1/2MS 培养基为基础培养基， 添加 1.0 mg/L 的 6-苄氨基腺嘌呤 （6-BA） 、 0.5 mg/L 的 吲哚丁酸。
16、 （IBA） ； 培养条件是先在 25下暗培养 7d， 然后在 25、 光强为 3000lx 全光照， 湿 度为 70%RH 下培养至丛芽长出。此条件下丛芽增殖系数最高， 生长最旺盛， 增殖系数能达到 5.0 以上。 0014 E、 炼苗移栽 炼苗 ： 将生根培养的苗木在与移栽环境相同的条件下闭瓶炼苗 5-7d， 让组培苗逐渐适 应外界条件。 0015 移栽 ： 炼苗移栽基质以泥炭、 蛭石、 珍珠岩 1 ： 1 ： 1 混合配制， 将苗子移栽到装有基 质的花盆中， 浇透水后， 覆膜。 0016 优选的， 炼苗移栽对基质用 0.1% 多菌灵浇透， 移栽时将炼好苗的植株的根部浸入 0.1% 多菌灵。
17、和 0.1 g/Ld 的 NAA 混合溶液中浸泡 10min。 0017 优选的， 枸杞组培苗移栽初期， 由于苗木幼嫩， 必须设置遮阳网， 光强度为全光照 时的 30%。每日通风， 通风时间逐日加长， 同时逐渐增加光强， 直到全天开放。适时浇水， 隔 日喷少量 0.1% 多菌灵溶液， 7 天后喷 1/4MS 营养液。待幼苗成活后逐渐全光照。 0018 发明的优点 ： 1） 本发明中对Lyciumexsertum进行继代培养时， 仅使用了 6- 苄氨基腺嘌呤 （6-BA） 与 吲哚 -3- 乙酸 （IAA） 配比， 极大地降低了激素积累对多次继代的影响， 同时也降低了成本。 0019 2） 本发。
18、明中对Lyciumexsertum的继代苗木进行生根培养时， 所采用的培养基配 比中没有添加任何激素， 做到了培养基配制的简化和成本的降低， 并且效果较好。 0020 3） 本发明中泥炭、 蛭石、 珍珠岩 1:1:1 的移栽基质混合配比， 能够在栽培过程起到 很好的保水和保温的作用， 能够提高移栽的成活率。 具体实施方式 0021 以下实施例进一步说明本发明的具体实施过程， 但不以任何方式限制本发明。 0022 实施例 1 A、 外殖体处理 采集 Lycium exsertum 幼嫩茎段作为外殖体， 剪去叶片， 留少量叶柄， 每 2-3 个芽剪成 一段， 将茎段用洗衣粉水洗去污渍， 后用自来水。
19、冲洗干净， 冲洗时间为5-10min。 然后将其放 说 明 书 CN 103843664 A 5 3/5 页 6 入超净工作台中 , 进行消毒， 消毒后剪去茎段两端， 放于培养皿中备用。 0023 B、 初代培养 每次处理接种 30 瓶， 外殖体接种后每隔 7 天记录一次生长状况。 0024 以 MS 培养基为基础培养基， 添加 0.05mg/L 的 NAA、 3% 蔗糖和 4g 琼脂， 使用 NaOH 或 HCl 将培养基 pH 值调至 5.8。培养条件是光强为 3000lx 全光照 24h， 温度为 25， 湿 度为 70%RH。不定芽生长的比例达到 93.3%。 0025 C、 继代培养。
20、 培养材料为初代培养获得的单苗或丛芽， 以MS培养基为基础培养基， 添加0.1 mg/L的 6- 苄氨基腺嘌呤 （6-BA） 和 0.05 mg/L 的吲哚 -3- 乙酸 （IAA） ， 使用 NaOH 或 HCl 将培养基 pH 值调至 5.8 ； 培养条件是光照 ： 24h/d， 光强为 3000lx， 温度为 23， 湿度为 70%RH。此条 件增殖系数最高， 生长最旺盛。每次处理接种 30 瓶， 每 7 天观察并记录幼苗的增殖效果。 0026 D、 生根培养 生根培养基主要成分以及培养条件 ： 以1/4的MS培养基为基础培养基， 添加1.5%蔗糖 和 4g 琼脂， 使用 NaOH 或 。
21、HCl 将培养基 pH 值调至 5.8 ； 培养条件是光强为 3000lx 下 12h 光 暗交替， 温度为 23， 湿度为 70%RH。从第 7d 开始生根， 15d 后可移栽， 生根率在 80% 以上， 生根条数平均在 4.3 条。 0027 E、 炼苗移栽 炼苗 ： 将生根培养的苗木在与移栽环境相同的条件下闭瓶炼苗 5-7d， 让组培苗逐渐适 应外界条件。 0028 实施例 2 与实施例 1 区别在于生根培养步骤不同 ： 使用步骤 B 的培养植株叶片为材料进行丛芽 增殖培养， 以 1/2MS 培养基为基础培养基， 添加 1.0 mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤、 0.5 mg/L 的 吲。
22、哚丁酸 （IBA） ； 培养条件是先在 25下暗培养 7d， 然后在 25、 光强为 3000lx 全光照， 湿 度为 70%RH 下培养至丛芽长出。 0029 实施例 3 与实施例 1 区别在于生根培养步骤不同 ： 使用步骤 C 的培养植株叶片为材料进行丛芽 增殖培养， 以 1/2MS 培养基为基础培养基， 添加 1.0 mg/L 的 6- 苄氨基腺嘌呤、 0.5 mg/L 的 吲哚丁酸 （IBA） ； 培养条件是先在 25下暗培养 7d， 然后在 25、 光强为 3000lx 全光照， 湿 度为 70%RH 下培养至丛芽长出。此条件下丛芽增殖系数最高， 生长最旺盛， 增殖系数能达到 5.0。
23、 以上。 0030 实施例 4 对实施例 1 炼苗后的产品进行移栽 ： 炼苗移栽基质以泥炭、 蛭石、 珍珠岩 1 ： 1 ： 1 混合配 制， 在移栽前对基质进行高温灭菌。冷却后装盆， 准备移栽， 移栽前对基质用 0.1% 多菌灵浇 透 ； 移栽时将炼好苗的植株完整的从锥形瓶中取出， 放入水中洗净根上的培养基， 将根部浸 入 0.1% 多菌灵和 0.1 g/L 的 NAA 的混合溶液中浸泡 10min。将苗子移栽到装有基质的花盆 中， 浇透水后， 覆膜。 0031 枸杞组培苗移栽初期， 由于苗木幼嫩， 必须设置遮阳网， 光强度为全光照时的 30% 左右。每日通风， 通风时间逐日加长， 同时逐渐。
24、增加光强， 直到全天开放。适时浇水， 隔日喷 少量 0.1% 多菌灵溶液， 7 天后喷 1/4MS 营养液。15d 后统计成活率， 移栽成活率在 90% 以 说 明 书 CN 103843664 A 6 4/5 页 7 上， 而在沙和田园土基质中移栽的效果较差。 0032 实施例 5 与实施例 1 不同之处在于， 步骤 A 消毒的具体方案如下 ： 先用 75% 酒精 振荡消毒 5s， 再用 0.1 % 升汞溶液消毒 6min， 最后用无菌水清洗 3-4 次。 0033 实施例 6 与实施例 1 不同之处在于， 步骤 A 消毒的具体方案如下 ： 先用 75% 酒精 振荡消毒 5s， 再用 0.1。
25、 % 升汞溶液消毒 6.5min， 最后用无菌水清洗 3-4 次。该方案效果最 佳， 正常生长的比例可达 85%。 0034 试验 试验一、 考察用0.1%升汞消毒为6min， 并且用75%酒精消毒， 看消毒时间对初代培养生 长的影响 ： 将准备好的材料先用 75% 酒精分别消毒 4s、 5s、 6s、 7s、 8s ； 再用 0.1% 升汞溶液消毒 6min， 后用无菌水冲洗 3-4 遍。再剪去嫩茎两端接种， 每瓶接种 1 个， 每处理接种 30 瓶。接 入培养基中， 统计污染、 干枯和正常生长的个数， 结果见表 1。 0035 由表 1 可以得出， 当 0.1% 升汞溶液消毒 6min 并。
26、且用 75% 的酒精消毒 5s 较好， 萌 发率达 50%。 0036 试验二、 考察用0.1%升汞消毒为6.5min， 并且用75%酒精消毒， 看消毒时间对初代 培养生长的影响 ： 将准备好的材料， 先用 75% 酒精分别消毒 4s、 5s、 6s、 7s、 8s ； 再用 0.1% 升汞溶液消毒 6.5min， 后用无菌水冲洗 3-4 遍。再剪去嫩茎两端接种， 每瓶接种 1 个， 每处理接种 30 瓶。 接入培养基中， 统计污染、 干枯和正常生长的个数， 结果见表 2。 0037 由表 2 可以得出， 当 0.1% 升汞溶液消毒时间为 6.5min 时， 75% 的酒精消毒 5s 最 好，。
27、 萌发率达 96.7%。 0038 试验三、 考察培养基激素及配比对 L.exsertum 不定芽增殖情况的影响 （见表 3） 以 MS 培养基为基础， 添加不同类型的激素及数量进行初代培养。通过初代培养可以获 得所繁育物种的无菌材料。这一阶段的培养效果依植物种类及培养基成分而异， 可能形成 一个芽或多个芽。每处理接种 30 瓶， 外殖体接种后每隔 7 天记录一次生长状况。 0039 通过不同配比初代培养基的比较， 在 0.05mg/L 的 NAA、 0.1mg/L 的 NAA 和 0.05mg/ L 的 IAA 培养基中容易形成愈伤组织 , 但是也能诱导产生一定数量的不定芽， 产生的数量 较。
28、无激素与 0.1mg/L 的 IAA 多， 且差异显著 ； 在 0.05mg/L 的 NAA+0.05mg/L 的 6-BA 培养基 说 明 书 CN 103843664 A 7 5/5 页 8 中发生分化率较高 , 不定芽的发生数量最多 , 与无激素和 0.1 mg/L 的 IAA 相比达到极显 著水平 ； 与 0.05 mg/L 的 NAA、 0.1mg/L 的 NAA 和 0.05 mg/L 的 IAA 相比达到显著水平。本 实验表明初代培养不定芽增殖最佳培养基为 MS+0.05mg/L 的 NAA+0.05mg/L 的 6-BA。 0040 试验四、 考察以 1/4 的 MS 为基本培养基， 添加不同种类及浓度生根激素对生根率 的影响 以继代培养后的无菌茎段为材料， 添加不同种类及浓度生根激素进行生根培养。由表 4（Lyciumexsertum生根培养统计表） 可以得出， 在不添加任何激素的情况下， 生根率最高， 须根数量最多， 根系状态最适宜移栽。 0041 试验五、 考察在无激素添加的培养基中生根速度 表 5（Lyciumexsertum生根天数统计表） 统计了在无激素添加的培养基中生根速度， 7d 后开始生根， 开始每天统计生根率， 15d 后达到最大生根数量， 生根率达到 80%。 0042 说 明 书 CN 103843664 A 8 。