饱和共振能量转移超分辨探针及其制备方法和应用技术领域
本领域涉及超分辨成像领域，具体涉及一种饱和共振能量转移超分辨的
探针及其制备方法和应用。
背景技术
光学显微成像技术由于能够对细胞开展无损伤、实时动态的直接观察，
进而揭示纷繁复杂的生命现象的内在机制而备受关注，是广泛应用于生物学
领域的重要技术手段。其发展贯穿着细胞生物学发展的始终，是生命科学领
域的主要推动力之一。可以认为，光学细胞成像显微系统的分辨率在很大程
度上限制和决定了生物学在多小的微观尺度上开展研究。细胞及亚细胞结构
大多处于纳米尺度，如重要的细胞器核糖体直径仅有25纳米，蛋白质分子
及复合物则更是在10纳米以下。近年来系统生物学(Systems Biology)的
发展更是迫切要求细胞成像技术的分辨率从亚微米尺度(>100纳米)进入
纳米尺度(<100纳米)，以从更为深入的角度了解细胞内各功能单元及其网
络的局域和整体组织方式。然而，当我们利用光波来进行显微观测时，量子
力学中的“测不准”原理为光学显微镜的分辨率设置了一道不可逾越的屏障，
即所谓的光学衍射极限。自从1872年德国科学家阿贝提出光学衍射极限(即
分辨率最高只能为光波长的一半左右)的概念以来，光学显微系统的分辨率
一直未能得到显著的提高。目前，传统的光学显微镜的横向空间分辨率最高
仅为200纳米，纵向分辨率约为500纳米，这很明显不能达到对细胞内细微
结构观察的要求，距离理想的纳米分辨率相差甚远。
近年来人们通过对非线性光学的探索取得了突破了光学衍射极限范围
的成像。人们利用那些非微扰的、高度的非线性光学效应来达到超分辨成像，
例如受激发射损耗显微镜(stimulated emission depletion microscopy，STED)
的超分辨能力来自于荧光饱和淬灭过程中的高度非线性；饱和结构光照明显
微镜(Saturated Patterned Excitation Microscopy，SPEM)利用了荧光饱和激
发过程中的高度非线性；而随机光学重建显微术(Stochastic optical
reconstruction microscopy，STORM)利用出射荧光光子数与定位精度的非线
性关系等。这些超分辨荧光显微镜(Super-Resolution Fluorescence
Microscopy)，都可以达到约数十纳米的分辨率，为研究细胞内部的精细结构
提供了前所未有的手段。
饱和共振能量转移超分辨技术(Saturated Fluorescence resonance energy
transfer(FRET)Microscopy,SFM)使用一对高效荧光共振能量转移(FRET)
的分子对作为标记，利用该探针的供体荧光对激发光强产生的高度非线性效
应，可以在普通的激光共聚焦显微镜(confocal)上实现超分辨成像。所使
用的FRET对的能量传递效率越高，供体荧光与激发光强之间的非线性度就
越大，获得的超分辨效果也就越好。而能量传递的效率与供体和受体之间距
离的6次方成倒数，即距离越小能量传递效率越高。因而设计一个高效率、
易标记的FRET对探针是SFM实现的重要内容。
为实现SFM的细胞内成像，需要在目标蛋白上标记上一对超高效FRET
对。由于标记技术的限制，实现这一目的并不容易。因此亟需一种同时满足
在纳米尺度上产生超高的FRET效率，并且能够在细胞内表达的FRET对探
针，用以实现SFM超高分辨率的活细胞多色成像。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，克服现有技术中传统的光学显微镜的
横向空间分辨率达不到对细胞内细微结构观察的要求的困难，提供一种应用
于饱和共振能量转移超分辨(SFM)的探针，产生极高的FRET效率，能被
应用于普通的激光共聚焦显微镜中，突破光学衍射极限，达到SFM纳米尺
度的分辨率，同时所述探针不会产生免疫反应，能够实现SFM超高分辨率
的活细胞多色成像。
高效荧光共振能量转移(FRET)是指当两个荧光团相距在1～10nm之间
时，激发态的供体可以将能量通过偶极-偶极相互作用的形式传递给基态的
受体。荧光供体与荧光受体之间的FRET效率越高，供体荧光与激发光强之
间的非线性度就越大，获得的超分辨效果也就越好。而FRET效率与荧光供
体与荧光受体之间距离的6次方成倒数，所以要尽可能地减少两者之间的举
例以提高FRET效率，获得超过光学衍射极限的分辨率。
本发明提供一种饱和共振能量转移超分辨的探针，其包括以下的组成部
分：荧光蛋白、与所述荧光蛋白连接的抗所述荧光蛋白的重链单域抗体VHH
和与所述重链单域抗体VHH连接的有机荧光分子，所述有机荧光分子与所述
荧光蛋白互为饱和共振能量转移供体和饱和共振能量转移受体。
所述的重链单域抗体VHH(nanobody)是指从骆驼或鲨鱼的重链抗体中
提取出的单链抗体片段，其包含了抗体中的一个可变域(VH)，只有完整抗
体1/10左右的质量。其直径为2nm，体积为2nm*2nm*3nm，能够与所述的
荧光蛋白进行特异性结合。同时，所述的重链单域抗体VHH有良好的热稳定
性和化学稳定性，不会在体内产生免疫反应；所述的重链单域抗体VHH分子
质量低，能更容易渗透到组织中去。较佳地，所述的重链单域抗体VHH为骆
驼重链单域抗体VHH。
所述的荧光蛋白为本领域常规的荧光蛋白，较佳地为ECFP、EBFP、GFP、
EGFP、YFP、mCitrine、RFP、mCherry、mPlum和mKate2中的一种或多种，
更佳地为GFP、CFP、YFP和mKate2中的一种或多种。
所述的有机荧光分子为本领域常规的有机荧光分子，即吸收某一波长的
光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的有机分子，一般含有苯环或杂
环并带有共轭双键。较佳地为FITC、Cy3、Cy5、Atto 425、Atto 465、Atto488、
Atto514、Atto550、Atto594、Atto633、Atto647、Atto740、Alexa405、Alexa488、
Alexa546、Alexa555、Alexa633和Alexa750中的一种或多种，更佳地为
Alexa546、Atto550、Alexa555、Alexa488、Atto425和Alexa633中的一种或
多种。
所述荧光蛋白和抗所述荧光蛋白的重链单域抗体VHH的连接为本领域
常规的连接，较佳地为通过共价键连接。所述重链单域抗体VHH和所述有机
荧光分子的连接为本领域常规的连接，较佳地为通过共价键连接。
所述荧光蛋白和所述有机荧光分子成为一对高效荧光共振能量转移
(FRET)的荧光分子对，分别作为FRET对的供体和受体，或者，受体和
供体。其中，FRET对的供体的发射谱与受体的吸收谱有部分重叠。两者在
很短的距离内产生大于95％以上的FRET效率的能力转移，实现SFM成像。
本发明提供一种多色饱和共振能量转移超分辨的方法，其包括以下的步
骤，同时使用一种以上所述的饱和共振能量转移超分辨的探针，所述的探针
中的重链单域抗体VHH分别抗一种以上的荧光蛋白。
本发明提供一种活细胞饱和共振能量转移超分辨探针，其包括以下的组
成部分：重链单域抗体VHH和与所述重链单域抗体VHH连接的有机荧光分子。
较佳地，所述的重链单域抗体VHH为骆驼重链单域抗体VHH。
由于重链单域抗体VHH可以在活细胞内发挥着作用，所述的活细胞饱和
共振能量转移超分辨探针亦可通过显微注射等手段进入细胞，从而与细胞中
含有的荧光蛋白特异性结合，达到饱和共振能量转移超分辨观察活细胞的目
的。
本发明提供一种所述的探针的制备方法，其包括以下的步骤：
(1)、有机荧光分子与抗荧光蛋白的重链单域抗体VHH连接，得有机荧
光分子和重链单域抗体VHH的连接物；
(2)、步骤(1)所得的有机荧光分子和重链单域抗体VHH的连接物与
荧光蛋白连接，即获得饱和共振能量转移超分辨探针。
较佳地，步骤(1)所述的连接为通过共价键连接。较佳地，步骤(2)
所述的连接为通过抗原-抗体之间的特异性结合相连接。
较佳地，所述的制备方法包括以下的步骤：
(1)、将有机荧光分子溶液和抗荧光蛋白的重链单域抗体VHH溶液混合，
孵育，获得有机荧光分子和重链单域抗体VHH的连接物；
(2)、将步骤(1)所得的有机荧光分子和重链单域抗体VHH的连接物
与荧光蛋白混合，孵育，获得饱和共振能量转移超分辨探针。
步骤(1)所述的孵育的温度为本领域常规的温度，较佳地为20～30℃，
更佳地为25℃。步骤(1)所述的孵育的时间为本领域常规的时间，较佳地
为1～4小时，更佳地为2小时。
步骤(2)所述的孵育的温度为本领域常规的温度，较佳地为35～40℃，
更佳地为37℃。步骤(1)所述的孵育的时间为本领域常规的时间，较佳地
为1～4小时，更佳地为2小时。
本发明提供一种饱和共振能量转移超分辨成像的方法，其包括使观察样
品与探针结合，通过显微镜进行成像的步骤，其使用所述的饱和共振能量转
移超分辨的探针或所述的活细胞饱和共振能量转移超分辨探针进行饱和共
振能量转移超分辨成像。
所述的显微镜为本领域常规的显微镜，较佳地为激光共聚焦扫描显微镜，
更佳地为Zessi LSM700、Zessi LSM780、Leica TCS SP5II、Leica TCS SP8、
Olypums FV500或Nikon C1。
较佳地，所述的成像为饱和共振能量转移超分辨成像。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发
明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：所述探针构建了“荧光蛋白—重链单域抗
体VHH—有机染料”的高效荧光共振能量转移效率(FRET)体系，所述的
荧光蛋白和所述的荧光分子之间存在95％的高效荧光共振能量转移效率。同
时，所述的重链单域抗体VHH有良好的热稳定性和化学稳定性，不会在体内
产生免疫反应；所述的重链单域抗体VHH分子质量低，能更容易渗透到组织
中去，因此所述的探针能够进入细胞且不会引起免疫反应。所述的探针可以
方便地对细胞内的荧光蛋白进行超分辨成像，实现SFM突破光学衍射极限
成像，改善显微镜的分辨率2～3倍，而且还可以进行多色、活细胞饱和共振
能量转移超分辨成像，在生命科学、纳米材料科学、基因分子诊断医学等领
域中得到了广泛的应用。相比于现有技术，大大简化了现有SFM的标记步
骤，无需依次标记一抗、二抗和亲和素等步骤，解决了SFM标记方案的多
色成像和活细胞成像的问题。
附图说明
图1为使用荧光分光光度计测试的实施例2的Alexa 546-VHH-GFP探针
发射谱与同浓度的GFP发射谱。
图2为使用荧光分光光度计测试的实施例3的Atto550-VHH-GFP探针发
射谱与同浓度的GFP发射谱。
图3为使用荧光分光光度计测试的实施例1的Alexa 555-VHH-GFP探针
发射谱与同浓度的GFP发射谱。
图4为使用了实施例1的Alexa 555-VHH-GFP探针对融合表达GFP了
Hela细胞微管进行SFM成像的结果对比图。其中A为普通激光共聚焦显微
镜(confocal)成像，B为使用了Alexa 555-VHH探针标记后的SFM成像，C
和D分别为对应的白色直线的荧光强度分布曲线及高斯拟合后得到的半高
全宽(分辨率)。
图5为使用了实施例2的Alexa 546-VHH-GFP探针标记的Hela细胞微管
进行SFM成像的结果对比图。其中A为普通激光共聚焦显微镜(confocal)
成像，B为使用了Alexa 546-VHH探针标记后的SFM成像，C和D分别为对
应的白色直线的荧光强度分布曲线及高斯拟合后得到的半高全宽(分辨率)。
图6为使用了实施例3的Atto 550-VHH-GFP探针对Hela细胞微管进行
SFM成像的结果对比图。其中A为普通激光共聚焦显微镜(confocal)成像，
B为使用了Atto 550-VHH探针标记后的SFM成像，C和D分别为对应的白
色直线的荧光强度分布曲线及高斯拟合后得到的半高全宽(分辨率)。
图7为使用了实施例4的Alexa 633-VHH-mKate2探针标记的Hela细胞
微管进行SFM成像的结果对比图。其中A为普通激光共聚焦显微镜(confocal)
成像，B为使用了Alexa 633-VHH探针标记后的SFM成像，C和D分别为对
应的白色直线的荧光强度分布曲线及高斯拟合后得到的半高全宽(分辨率)。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在
所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常
规方法和条件，或按照商品说明书选择。
所述的室温为本领域常规的室温，一般为15～25℃。
荧光染料Alexa555、Alexa546、Alexa488和Alexa 633购自Invitrogen
公司。荧光染料Atto550、Atto 425购自Sigma公司。
激光共聚焦显微镜Lecia TCS SP5购自德国徕卡公司。
Hela细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，其商品序
列号为Tch20。
荧光蛋白mKate2的质粒购自Evrogen公司；荧光蛋白GFP、CFP、YFP
和的质粒购自Addgene公司。
mKate2蛋白、GFP蛋白、YFP蛋白和CFP蛋白等由上述质粒通过本领
域常规的方法转染枯草芽孢杆菌等细菌后表达获得。
抗GFP、CFP、BFP、RFP及mKate2的重链单域抗体VHH购自Chromotek
公司。其中，抗GFP、CFP和BFP的重链单域抗体VHH产品编号：st-250；
抗mKate2和RFP的重链单域抗体VHH产品编号：rt-250。
实施例1 Alexa 555-VHH-GFP探针制备及应用
一、制备荧光分子标记的重链单域抗体VHH
1.取50μL的重链单域抗体VHH到透析管(购自Pierce，molecular weight
cutoff＝3500Da)中，并将管套入浮标上。将浮标放在20mL含有透析液(0.2M
NaHCO3，PH＝8.2)的塑料烧杯中，低速旋转2h后取出，得VHH溶液。
2.溶解荧光染料。将1mg Alexa 555溶解到100μL的DMSO中，得
Alexa555溶液，于-80℃保存。此时Alexa 555的浓度为8mM(其中，Alexa555
的分子质量为1250)。
3.取5μL步骤2所得的Alexa555溶液，加入50μL步骤1所得的VHH溶
液中(即Alexa 555的摩尔质量相对于VHH10倍过量)，25℃孵育2h，得孵
育液A。
4.使用Zeba脱盐柱(购自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)去
除游离荧光分子：
①移去Zeba脱盐柱的底塞，拧松盖子。
②将Zeba脱盐柱放入1.5mL离心管中，1500g离心1分钟。移去储存
液，得到离心后的Zeba脱盐柱。
③在离心后的Zeba脱盐柱的树脂往上倾斜处标上记号。之后在离心时，
标记处朝外。
④加入300μL磷酸盐缓冲液(1╳，pH 7.4)，在树脂床上1500g离心1
分钟。移去缓冲液。
⑤重复步骤④3次，移除离心管中的液体。
⑥将步骤⑤所得的Zeba脱盐柱放入另一个新的1.5mL离心管中，移除
盖子，加入50μl步骤3获得的孵育液A，在树脂床顶部加入15μL上述的磷
酸盐缓冲液。
⑦1500g离心2分钟。
⑧将离心管中液体取出，即得VHH-Alexa555连接物，于4℃保存。
二、染料蛋白比测定：
使用Cary 100Bio紫外可见分光光度计(购自Varian公司)测量步骤一
所得的VHH-Alexa555连接物在280nm和555nm处的吸收值。
对于Alexa 555，染料/蛋白的计算公式如下所示：
其中，A555为所测在555nm处的吸收值(所用比色皿长度1cm)；A280
为所测在280nm处的吸收值(所用比色皿长度1cm)；ζ蛋白为重链单域抗体
VHH在280nm处的摩尔消光系数(单位：cm-1M-1)；消光系数为染料在555nm
处的摩尔消光系数(cm-1M-1)；校正因子为由荧光基团在280nm处的吸收带
来的校正因子。
ζ蛋白的测定公式为：A＝ζ蛋白cL。其中，A为VHH在280nm处的吸收值，
c为VHH的摩尔浓度，L为比色皿长度(cm)。使用3.845μM的VHH，测得
A＝0.107，L＝1cm。因此ζ蛋白为27828(单位：cm-1M-1)。
所测VHH-Alexa555连接物的A555值为1.279；A280值为0.298；消光系
数＝150,000；校正因子＝0.08。因此计算的染料/蛋白值为
1.279*27828/[150000*(0.298-0.08*1.279)]＝1.2126。
三、Alexa 555-VHH-GFP探针制备及FRET效率测试
1.取2μL步骤一制备好的VHH-Alexa555连接物(抗GFP)与GFP蛋白
按摩尔比1:2混合，37℃孵育2h，即得Alexa 555-VHH-GFP探针。此时GFP
与Alexa 555构成了高FERT效率体系，GFP作为能量供体，Alexa 555作为
能量受体。
2.将步骤1所得的Alexa 555-VHH-GFP探针按照GFP为100nM的浓度稀
释，然后在荧光分光光度计下测试其荧光发射谱。取相同浓度的GFP蛋白
作为对照(如图3所示)。由图3可知，使用488nm的激发光，GFP与Alexa
Fluor 546(AF546)之间发生了高效的能量传递，通过计算得到荧光共振能
量转移(FRET)效率为97％。
四、细胞微管的染色标记及SFM成像
1.在12孔细胞培养板内放入圆盖玻片，在玻片上铺上约10万
个Hela细胞，并转染微管GFP。转染步骤如下：
a)在50μL Opti-MEM(购自Life Technologies)中加入荧光蛋白GFP的
质粒0.8μg，轻轻混匀得混合液A；
b)轻轻混匀LipofectamineTM 2000(购自Life Technologies),取2μL加入
到步骤a)所得的混合液A中。室温下静置5分钟，得混合液B。
c)轻轻混匀步骤b)所得的混合液B，室温静置20分钟，得混合液C。
d)向步骤c)所得的混合液C中加入400μL无血清培养基，轻轻混匀，加
入到细胞中。
e)4小时后更换成新鲜的无血清培养基，即可。
2.使用37℃、1×磷酸盐缓冲液(PBS)1mL快速清洗1次，5min后再清
洗一次。
3.加入1mL 4％多聚甲醛(w/v)+4％蔗糖(w/v)固定15min。
4.使用1×PBS缓冲液清洗两次，每次间隔5min。
5.透膜：加入500μL 0.25％Triton X-100(w/v)，孵育15min。
6.使用1×PBS缓冲液清洗3次，每次间隔5min。
7.加入1mL 6％牛血清白蛋白(w/v)封闭30min。
8.加入500μL步骤一制备好的VHH-Alexa555连接物(抗GFP)(250ng/ml)，
孵育1h。
9.使用1×PBS缓冲液清洗三次，每次间隔10分钟。
10.贴片。
11.选取合适的激光功率，对样品进行SFM成像，参见图4。
由图4可知，SFM超分辨效果明显，可以将分辨率提高1.5倍。
实施例2 Alexa 546-VHH-GFP探针制备及应用
一、制备荧光分子标记的重链单域抗体VHH
1.取50μL的重链单域抗体VHH到透析管(购自Pierce，molecular weight
cutoff＝3500Da)中，并将管套入浮标上。将浮标放在20mL含有透析液(0.2M
NaHCO3，pH＝8.2)的塑料烧杯中，低速旋转2h后取出，得VHH溶液。
2.溶解荧光染料。将1mg Alexa 546溶解到100μL的DMSO中，得
Alexa546溶液，于-80℃保存。此时Alexa 546的浓度为8.6mM(其中，Alexa546
的分子质量为1159)。
3.取5μL步骤2所得的Alexa546溶液，加入50μL步骤1所得的VHH溶
液中(即Alexa 546的摩尔质量相对于VHH10倍过量)，25℃孵育2h，得孵
育液A。
4.使用Zeba脱盐柱(购自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)通
过溶液交换去除游离荧光分子：
①移去柱的底塞，拧松盖子。
②将柱子放入1.5mL离心管中，1500g离心1分钟。移去储存液。
③在脱盐柱上的树脂往上倾斜处标上记号。之后在离心时，标记处朝外。
④加入300μL磷酸盐缓冲液(1╳，pH 7.4)，在树脂床上1500g离心1
分钟。移去缓冲液。
⑤重复步骤④3次，移除离心管中的液体。
⑥将脱盐柱放入另一个新的离心管中，移除盖子，加入100μl步骤3获
得的孵育液A，在树脂床顶部加入15μL上述的磷酸盐缓冲液。
⑦1500g离心2分钟。
⑧将离心管中液体取出，即得VHH-Alexa546连接物，于4℃保存。
二、染料蛋白比测定：
使用Cary 100Bio紫外可见分光光度计(购自Varian)测量步骤一所得
的VHH-Alexa546连接物在280nm和556nm处的吸收值。
对于Alexa 546，染料/蛋白的计算公式如下所示，其参数意义参照实施
例1：
所测VHH-Alexa546连接物的A556值为0.542；A280值为0.26；消光系数
＝112000；校正因子＝0.117。因此计算的染料/蛋白值为0.5571。
三、Alexa 546-VHH-GFP探针制备及FRET效率测试
1.取2μL步骤一制备好的VHH-Alexa546连接物(抗GFP)与GFP蛋白
按摩尔比1:2混合，37℃孵育2h，即得Alexa 546-VHH-GFP探针。此时GFP
与Alexa 546构成了高FERT效率体系，GFP作为能量供体，Alexa 546作为
能量受体。
2.将步骤1所得的Alexa 546-VHH-GFP探针按照GFP为100nM的浓度稀
释，然后在荧光分光光度计下测试其荧光发射谱。取相同浓度的GFP蛋白
作为对照(如图1所示)。由图1可知，使用488nm的激发光，GFP与Alexa
Fluor 546(AF546)之间发生了高效的能量传递，通过计算得到荧光共振能
量转移(FRET)效率为97％。
四、细胞微管的染色标记及SFM成像
1.在12孔细胞培养板内放入圆盖玻片，在玻片上铺上约10万
个Hela细胞，并转染微管GFP。转染步骤如下：
a)在50μL Opti-MEM(购自Life Technologies)中加入荧光蛋白GFP的
质粒0.8μg，轻轻混匀得混合液A；
b)轻轻混匀LipofectamineTM 2000(购自Life Technologies),取2μL加入
到步骤a)所得的混合液A中。室温下静置5分钟，得混合液B。
c)轻轻混匀步骤b)所得的混合液B，室温静置20分钟，得混合液C。
d)向步骤c)所得的混合液C中加入400μL无血清培养基，轻轻混匀，
加入到细胞中。
e)4小时后更换成新鲜的无血清培养基，即可。
2.使用37℃，1×磷酸盐缓冲液(PBS)1mL快速清洗1次，5min后再清
洗一次。
3.加入1mL 4％多聚甲醛(w/v)+4％蔗糖(w/v)固定15min。
4.使用1×PBS缓冲液清洗两次，每次间隔5min。
5.透膜：加入500μL 0.25％Triton X-100(w/v)，孵育15min。
6.使用1×PBS缓冲液清洗3次，每次间隔5min。
7.加入1mL 6％牛血清白蛋白(w/v)封闭30min。
8.加入500μL步骤一制备好的VHH-Alexa546连接物(抗GFP)(250ng/ml)，
孵育1h。
9.使用1×PBS缓冲液清洗三次，每次间隔10分钟。
10.贴片。
11.选取合适的激光功率，对样品进行SFM成像，参见图5。
由图5可知，SFM超分辨效果明显，获得了突破衍射极限的分辨率。
实施例3 Atto550-VHH-GFP探针制备及应用
一、制备荧光分子标记的重链单域抗体VHH
1.取50μL的重链单域抗体VHH到透析管(购自Pierce，molecular weight
cutoff＝3500Da)中，并将管套入浮标上。将浮标放在20mL含有透析液(0.2M
NaHCO3，PH＝8.2)的塑料烧杯中，低速旋转2h后取出，得VHH溶液。
2.溶解荧光染料。将1mg Atto550溶解到100μL的DMSO中，得Atto550
溶液，于-80℃保存。此时Atto550的浓度为12.6mM(其中，Atto550的分
子质量为791)。
3.取5μL步骤2所得的Atto550溶液，加入50μL步骤1所得的VHH溶
液中(即Atto550的摩尔质量相对于VHH10倍过量)，25℃孵育2h得孵育
液A。
4.使用Zeba脱盐柱(购自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)通
过溶液交换去除游离荧光分子：
①移去柱的底塞，拧松盖子。
②将柱子放入1.5mL离心管中，1500g离心1分钟。移去储存液。
③在脱盐柱上的树脂往上倾斜处标上记号。之后在离心时，标记处朝外。
④加入300μL磷酸盐缓冲液(1╳，pH 7.4)，在树脂床上1500g离心1
分钟。移去缓冲液。
⑤重复步骤④3次，移除离心管中的液体。
⑥将脱盐柱放入另一个新的离心管中，移除盖子，加入100μl步骤3获
得的孵育液A，在树脂床顶部加入15μL上述的磷酸盐缓冲液。
⑦1500g离心2分钟。
⑧将离心管中液体取出，即得VHH-Atto550连接物，于4℃保存。
二、染料蛋白比测定：
使用Cary 100Bio紫外可见分光光度计(购自Varian)测量步骤一所得
的VHH-Alexa546连接物在280nm和554nm处的吸收值。
对于Atto550，染料/蛋白的计算公式如下所示，其参数意义参照实施例
1：
所测VHH-Atto550连接物的A554值为0.632；A280值为0.26；消光系数
＝120000；校正因子＝0.12。因此计算的染料/蛋白值为0.796。
三、Atto550-VHH-GFP探针制备及FRET效率测试
1.取2μL步骤一制备好的VHH-Atto550连接物(抗GFP)与GFP蛋白按
摩尔比1:2混合，37℃孵育2h，即得Atto550-VHH-GFP探针。此时GFP与
Atto550构成了高FERT效率体系，GFP作为能量供体，Alexa 546作为能量
受体。
2.将步骤1所得的Atto550-VHH-GFP探针按照GFP为100nM的浓度稀
释，然后在荧光分光光度计下测试其荧光发射谱。取相同浓度的GFP蛋白
作为对照(如图2所示)。由图2可知，使用488nm的激发光，GFP与Atto550
之间发生了高效的能量传递，通过计算得到荧光共振能量转移(FRET)效
率为95％。
四、细胞微管的染色标记及SFM成像
1.在12孔细胞培养板内放入圆盖玻片，在玻片上铺上约10万
个Hela细胞，并转染微管GFP。转染步骤如下：
a)在50μL Opti-MEM(购自Life Technologies)中加入荧光蛋白GFP的
质粒0.8μg，轻轻混匀得混合液A；
b)轻轻混匀LipofectamineTM 2000(购自Life Technologies),取2μL加入
到步骤a)所得的混合液A中。室温下静置5分钟，得混合液B。
c)轻轻混匀步骤b)所得的混合液B，室温静置20分钟，得混合液C。
d)向步骤c)所得的混合液C中加入400μL无血清培养基，轻轻混匀，
加入到细胞中。
e)4小时后更换成新鲜的无血清培养基，即可。
2.使用37℃1×磷酸盐缓冲液(PBS)1mL快速清洗1次，5min后再清洗
一次。
3.加入1mL 4％多聚甲醛(w/v)+4％蔗糖(w/v)固定15min。
4.使用1×PBS缓冲液清洗两次，每次间隔5min。
5.透膜：加入500μL 0.25％Triton X-100(w/v)，孵育15min。
6.使用1×PBS缓冲液清洗3次，每次间隔5min。
7.加入1mL 6％牛血清白蛋白(w/v)封闭30min。
8.加入500μL步骤一制备好的VHH-Atto550连接物(抗GFP)(250ng/ml)，
孵育1h。
9.使用1×PBS缓冲液清洗三次，每次间隔10分钟。
10.贴片。
11.选取合适的激光功率，对样品进行SFM成像，参见图5。
由图6可知，SFM超分辨效果明显，获得了突破衍射极限的分辨率。
实施例4 Alexa 633-VHH-mKate2探针制备及应用
一、制备荧光分子标记的重链单域抗体VHH
1.取50μL的重链单域抗体VHH到透析管(购自Pierce，molecular weight
cutoff＝3500Da)中，并将管套入浮标上。将浮标放在20mL含有透析液(0.2M
NaHCO3，PH＝8.2)的塑料烧杯中，低速旋转2h后取出，得VHH溶液。
2.溶解荧光染料。将1mg Alexa 633溶解到100μL的DMSO中，得Alexa
633溶液，于-80℃保存。此时Alexa 633的浓度为8.3mM(其中，Alexa 633
的分子质量为1200)。
3.取5μL步骤2所得的Alexa 633溶液，加入50μL步骤1所得的VHH
溶液中(即Alexa 633的摩尔质量相对于VHH10倍过量)，25℃孵育2h，得
孵育液A。
4.使用Zeba脱盐柱(购自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)通
过溶液交换去除游离荧光分子：
①移去柱的底塞，拧松盖子。
②将柱子放入1.5mL离心管中，1500g离心1分钟。移去储存液。
③在脱盐柱上的树脂往上倾斜处标上记号。之后在离心时，标记处朝外。
④加入300μL磷酸盐缓冲液(1╳，pH 7.4)，在树脂床上1500g离心1
分钟。移去缓冲液。
⑤重复步骤④3次，移除离心管中的液体。
⑥将脱盐柱放入另一个新的离心管中，移除盖子，加入100μl步骤3获
得的孵育液A，在树脂床顶部加入15μL上述的磷酸盐缓冲液。
⑦1500g离心2分钟。
⑧将离心管中液体取出，即得VHH-Alexa 633连接物，于4℃保存。
二、染料蛋白比测定：
使用Cary 100Bio紫外可见分光光度计(购自)测量步骤一所得的VHH-
Alexa 633连接物在280nm和632nm处的吸收值。
对于Alexa 633，染料/蛋白的计算公式如下所示，其参数意义参照实施
例1：
所测VHH-Alexa 633连接物的A632值为0.394；A280值为0.421；消光系
数＝159000；校正因子＝0.55。因此计算的染料/蛋白值为0.707。
三、Alexa 633-VHH-mKate2探针制备及FRET效率测试
1.取2μL步骤一制备好的VHH-Alexa 633连接物(抗RFP)与mKate2
蛋白按摩尔比1:2混合，37℃孵育2h，即得Alexa 633-VHH-mKate2探针。此
时mKate2与Alexa 633构成了高FERT效率体系，mKate2作为能量供体，
Alexa 633作为能量受体。
2.将步骤1所得的Alexa 633-VHH-mKate2探针按照mKate2为100nM的
浓度稀释，然后在荧光分光光度计下测试其荧光发射谱。取相同浓度的
mKate2蛋白作为对照。
四、细胞微管的染色标记及SFM成像
1.在12孔细胞培养板内放入圆盖玻片，在玻片上铺上约10万
个Hela细胞，并转染微管mKate2。转染步骤如下：
a)在50μL Opti-MEM(购自Life Technologies)中加入荧光蛋白mKate2
的质粒0.8μg，轻轻混匀得混合液A；
b)轻轻混匀LipofectamineTM 2000(购自Life Technologies),取2μL加入
到步骤a)所得的混合液A中。室温下静置5分钟，得混合液B。
c)轻轻混匀步骤b)所得的混合液B，室温静置20分钟，得混合液C。
d)向步骤c)所得的混合液C中加入400μL无血清培养基，轻轻混匀，
加入到细胞中。
e)4小时后更换成新鲜的无血清培养基，即可。
2.使用37℃1×磷酸盐缓冲液(PBS)1mL快速清洗1次，5min后再清洗
一次。
3.加入1mL 4％多聚甲醛(w/v)+4％蔗糖(w/v)固定15min。
4.使用1×PBS缓冲液清洗两次，每次间隔5min。
5.透膜：加入500μL 0.25％Triton X-100(w/v)，孵育15min。
6.使用1×PBS缓冲液清洗3次，每次间隔5min。
7.加入1mL 6％牛血清白蛋白(w/v)封闭30min。
8.加入500μL步骤一制备好的VHH-Alexa 633连接物(抗RFP)
(250ng/ml)，孵育1h。
9.使用1×PBS缓冲液清洗三次，每次间隔10分钟。
10.贴片。
11.选取合适的激光功率，对样品进行SFM成像，参见图7。
由图7可知，SFM超分辨效果明显，改善SFM分辨率为普通共聚焦显
微镜分辨率的2倍以上。
实施例5 Atto 425-VHH-CFP探针制备
一、制备荧光分子标记的重链单域抗体VHH
1.取50μL的重链单域抗体VHH到透析管(购自Pierce，molecular weight
cutoff＝3500Da)中，并将管套入浮标上。将浮标放在20mL含有透析液(0.2M
NaHCO3，PH＝8.2)的塑料烧杯中，低速旋转2h后取出，得VHH溶液。
2.溶解荧光染料。将1mg Atto 425溶解到100μL的DMSO中，得Atto 425
溶液，于-80℃保存。此时Atto 425的浓度为20mM(其中，Atto 425的分子
质量为498)。
3.取5μL步骤2所得的Atto 425溶液，加入50μL步骤1所得的VHH溶
液中(即Atto 425的摩尔质量相对于VHH10倍过量)，20℃孵育4h，得孵
育液A。
4.使用Zeba脱盐柱(购自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)去
除游离荧光分子：
①移去Zeba脱盐柱的底塞，拧松盖子。
②将Zeba脱盐柱放入1.5mL离心管中，1500g离心1分钟。移去储存
液，得到离心后的Zeba脱盐柱。
③在离心后的Zeba脱盐柱的树脂往上倾斜处标上记号。之后在离心时，
标记处朝外。
④加入300μL磷酸盐缓冲液(1╳，pH 7.4)，在树脂床上1500g离心1
分钟。移去缓冲液。
⑤重复步骤④3次，移除离心管中的液体。
⑥将步骤⑤所得的Zeba脱盐柱放入另一个新的1.5mL离心管中，移除
盖子，加入50μl步骤3获得的孵育液A，在树脂床顶部加入15μL上述的磷
酸盐缓冲液。
⑦1500g离心2分钟。
⑧将离心管中液体取出，即得VHH-Atto 425连接物，于4℃保存。
二、Atto 425-VHH-CFP探针制备
1.取2μL步骤一制备好的VHH-Atto 425连接物(抗CFP)与CFP蛋白
按摩尔比1:2混合，35℃孵育4h，即得Atto 425-VHH-CFP探针。
实施例6 Alexa488-VHH-YFP探针制备
一、制备荧光分子标记的重链单域抗体VHH
1.取50μL的重链单域抗体VHH到透析管(购自Pierce，molecular weight
cutoff＝3500Da)中，并将管套入浮标上。将浮标放在20mL含有透析液(0.2M
NaHCO3，PH＝8.2)的塑料烧杯中，低速旋转2h后取出，得VHH溶液。
2.溶解荧光染料。将1mg Alexa488溶解到100μL的DMSO中，得
Alexa488溶液，于-80℃保存。此时Alexa488的浓度为15.5mM(其中，
Alexa488的分子质量为643)。
3.取5μL步骤2所得的Alexa488溶液，加入50μL步骤1所得的VHH溶
液中(即Alexa488的摩尔质量相对于VHH10倍过量)，30℃孵育1h，得孵
育液A。
4.使用Zeba脱盐柱(购自Pierce,molecular weight cutoff＝7,000Da)去
除游离荧光分子：
①移去Zeba脱盐柱的底塞，拧松盖子。
②将Zeba脱盐柱放入1.5mL离心管中，1500g离心1分钟。移去储存
液，得到离心后的Zeba脱盐柱。
③在离心后的Zeba脱盐柱的树脂往上倾斜处标上记号。之后在离心时，
标记处朝外。
④加入300μL磷酸盐缓冲液(1╳，pH 7.4)，在树脂床上1500g离心1
分钟。移去缓冲液。
⑤重复步骤④3次，移除离心管中的液体。
⑥将步骤⑤所得的Zeba脱盐柱放入另一个新的1.5mL离心管中，移除
盖子，加入50μl步骤3获得的孵育液A，在树脂床顶部加入15μL上述的磷
酸盐缓冲液。
⑦1500g离心2分钟。
⑧将离心管中液体取出，即得VHH-Alexa488连接物，于4℃保存。
二、Alexa488-VHH-YFP探针制备
1.取2μL步骤一制备好的VHH-Alexa488连接物(抗YFP)与YFP蛋白
按摩尔比1:2混合，40℃孵育1h，即得Alexa488-VHH-YFP探针。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限
制，本领域技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范
围内。