一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法技术领域
本发明涉及一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法。
背景技术
格雷夫斯病(Graves'disease)是一种常见病，女性发病率为1/1000人/年。除甲状
腺功能亢进以外，25-50％患有格雷夫斯病的个体病情发展到在临床上累及眼睛，即甲状腺
眼病。格雷夫斯眼病(Graves'Ophthalmopathy,GO或TAO)是甲状腺眼病的典型形式。虽然一
些GO患者只患有轻微的眼睛不适，但是3-5％患有剧烈疼痛和炎症伴有复视乃至视力丧失。
目前由于本病原因未明，临床主要以激素、免疫抑制剂、生长激素类似物、抗甲状腺药物、眶
内放射、眼眶减压术等综合治疗为主，但由于种种原因，效果并不尽人意，迄今为止尚无任
何一种药物能有效治疗TAO，并获长期缓解。因此，研究治疗甲状腺相关眼病的药物是亟待
解决的技术问题。而检测所述疾病更是本领域积极研究的方向。
近年来的研究表明，人瘦素蛋白(rh-leptin)对TAO患者眼眶前脂肪成纤维细胞增
殖、移行以及细胞分化过程中细胞内脂质形成具有重要的作用。因此，检测人瘦素蛋白的表
达情况，可以直接用于鉴定甲状腺相关眼病。然而传统的检测人瘦素蛋白的表达情况具有
操作复杂，费时的缺点。
核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生
物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术
(Systemat1c Evolut1on of L1gands by Exponent1al enr1chment,SELEX)从人工合成的
DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体
的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功
能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优
良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透
组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物
检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异结合leptin的核酸适体及其试剂盒。
本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-15所示的单链DNA。
所述核酸适体与leptin蛋白具有较好的亲和能力。
还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。
所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：
a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具
有相同功能的核酸适体的衍生物；
b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同
功能的核酸适体的衍生物；
c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相
同功能的核酸适体的衍生物；
d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的
衍生物；
e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体
具有相同功能的核酸适体的衍生物。
所述核酸适体可用于制备检测leptin的试剂盒。
利用本发明的核酸适体，可以捕获血液中的leptin，从而用于甲状腺相关眼病筛
查。利用本发明的核酸适体，部分代替单克隆抗体捕获leptin进行检测，具有高灵敏、成本
低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验
方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、核酸适体的筛选和制备
设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括39个核苷酸的随机核酸文库如下：
5’-TAGACTATCATGTGACTT(N39)GAGTGCTCGATGCTACTAG-3’；N39代表39个随机核苷
酸。
将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2％琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回
收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μg RNA文库经
硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ug leptin蛋白(利用CN100366738C公
开的方法，表达得到的目的蛋白)，37℃孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；
然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/L EDTA,
0.15％SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以
RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-
PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行12轮。得到
了15个适配子，其序列分别为SEQ ID NO:1-15所示。具体序列如下所示：
leptin-1：
TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:1)
leptin-2：
TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:2)
leptin-3：
TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:3)
leptin-4：
TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:4)
leptin-5：
TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:5)
leptin-6：
TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:6)
leptin-7：
TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:7)
leptin-8：
TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:8)
leptin-9：
TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:9)
leptin-10：
TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:10)
leptin-11：
TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:11)
leptin-12：
TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:12)
leptin-13：
TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:13)
leptin-14：
TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:14)
leptin-15：
TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG
(SEQ ID NO:15)
实施例2蛋白结合适配子的性能测定
将RNA适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37℃消化lh，纯化回收去磷
酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射
性标记的RNA适配子分别与不同浓度(1-200nM)的leptin 37℃孵育30min，各组反应液经硝
酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平
行做两次测定。计算各个适配子与leptin的解离常数。结果如下：
名称
解离常数Kd(单位nM)
leptin-1
10.9
leptin-2
10.8
leptin-3
9.9
leptin-4
10.3
leptin-5
10.5
leptin-6
9.6
leptin-7
9.8
leptin-8
10.0
leptin-9
10.3
leptin-10
9.9
leptin-11
9.8
leptin-12
10.1
leptin-13
10.6
leptin-14
9.7
leptin-15
9.7
PBS空白对照
无结合能力
实施例3所述适配子特异性分析以及稳定性分析
分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白
A，Lp-PLA2蛋白,leptin，与14条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都
不与这些蛋白相结合，而只与leptin结合保持较高的特异性。
将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-
PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。
实施例4所述适配子疾病的诊断
将14个适配子分别与12个格雷夫斯眼病患者以及正常人的血液混合30min，通过
生物素分离，定量分析其中的leptin蛋白的含量，通过分析发现，12个格雷夫斯眼病患者中
leptin蛋白的含量相对于正常人显著增加2倍。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人
员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本
发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉李倩
〈120〉一种用于检测眼科疾病的试剂盒及其检测方法
〈160〉15
〈210〉1
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -1：
TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTACTAG
〈210〉2
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -2：
TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:2）
〈210〉3
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -3：
TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:3）
〈210〉4
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -4：
TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:4）
〈210〉5
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -5：
TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:5）
〈210〉6
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -6：
TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:6）
〈210〉7
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -7：
TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:7）
〈210〉8
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -8：
TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:8）
〈210〉9
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -9：
TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:9）
〈210〉10
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -10：
TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:10）
〈210〉11
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -11：
TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:11）
〈210〉12
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -12：
TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:12）
〈210〉13
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -13：
TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:13）
〈210〉14
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -14：
TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:14）
〈210〉15
〈211〉76
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉leptin -15：
TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTACTAG
（SEQ ID NO:15）