恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒技术领域
本发明涉及免疫层析技术领域，具体涉及一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒及其制备
与应用。
背景技术
疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病。寄生
于人体的疟原虫共有四种，即间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫。在我
国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；其他二种少见，近年偶见国外输入的一些病例。不同
的疟原虫分别引起间日疟、三日疟、恶性疟及卵圆疟。
疟疾为世界五大寄生虫病之一，有很高的发病率和死亡率，普遍存在于热带及亚热带
地区，位于赤道周围的宽大带状区域。主要流行地区是非洲中部、南亚、东南亚及南美北
部的热带地区，这其中又以非洲的疫情最甚。就中国而言，疟疾主要的流行地带为华中华
南的丛林多山地区，但疫情远较非洲为轻。疟疾是以周期性冷热发作为最主要特征，脾肿
大、贫血以及脑、肝、肾、心、肠、胃等受损引起的各种综合征。患者每年在3亿～5亿之
间，因患疟疾而死亡的人数在1百万～3百万之间，其中大部分为儿童。
及早、快速有效地检测疟原虫是有效防治疟疾的关键。传统的检测方法是通过血涂片
显微镜检查来判断，这种方法简便、经济、准确率高，缺点是判断结果受检验人员镜检水
平和视力疲劳程度等因素的影响，易导致误诊和漏检且检查效率不高，不适合大规模现场
调查和短时间大批量处理样本。
乳胶层析法是以彩色乳胶为标记物的免疫层析法，其检测原理与胶体金免疫层析法相
类似，它不需要仪器，直接用肉眼判读结果，具有操作简单、快速，试剂稳定性好，易保
存，单人份独立包装，试剂损耗少等优点，适合临床患者、健康体检者等标本的快速筛查。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，从提高检测灵敏度出发，提供一种检测灵敏度高、
特异性强、检测快速的恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒。
本发明的第一方面公开了一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂
条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏
乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，所述致敏乳
胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅰ，免
疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ的检测线和包
被了羊抗兔IgG的质控线。
较优的，所述彩色乳胶颗粒为粒径290～300nm的聚苯乙烯颗粒。
较优的，所述彩色乳胶颗粒的颜色为红色。
本发明致敏乳胶聚酯膜上标记有彩色乳胶颗粒的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克
隆抗体Ⅰ和免疫硝酸纤维素膜检测线(T线)包被的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆
抗体Ⅱ均为单克隆抗体。
本发明的另一方面，提供了一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒的制备方法，包括以下
步骤：
1)致敏乳胶颗粒的制备：用羧基化的聚苯乙烯标记抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白
Ⅱ单克隆抗体Ι，获得致敏乳胶颗粒；
2)致敏乳胶聚酯膜的制备：用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜，获得致
敏乳胶聚酯膜；
3)将抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ和羊抗兔抗体分别喷在硝酸
纤维素膜检测线(T线)和质控线(C线)的位置上，烘干备用，制得免疫硝
酸纤维素膜；
4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片
上，切裁制得试剂条；
5)将试剂条装入塑料盒，获得恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒。
较优的，所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为：
a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍体积20mM pH 6.0的碳酸缓冲溶液多
次冲洗、离心、弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀；
b.用1～1.5倍体积20mM pH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯
颗粒沉淀，并加入1～1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20～30分钟，
最后用2～3倍体积0.01M pH 8.0的硼酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得
待标记物；
c.向步骤b获得的所述待标记物中加入2～3倍体积0.2M pH 7.0的硼酸缓冲液制成乳
胶悬液，并向所述乳胶悬液中加入抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι；
d.充分反应过夜，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。
在致敏乳胶颗粒的制备过程中，加入的水溶性炭化二亚胺、各缓冲溶液的体积均以初
始所取的羧基化的聚苯乙烯的体积为基准，按本发明所述的体积倍数加入：如所取的羧基
化的聚苯乙烯颗粒的体积为1ml，则需要加入的pH 6.0 20mM的磷酸缓冲溶液体积可以为
1～1.5ml，pH 7.0 0.2M的硼酸缓冲液的体积为2～3ml。
更优的，所述步骤a中碳酸缓冲溶液为20mM pH 6.0含0.01％SDS的碳酸缓冲溶液。
添加有SDS的碳酸缓冲溶液可以更好的洗去乳胶的表面活性物，清洗效果更好。
更优的，所述步骤a中羧基化的聚苯乙烯浓度为6～12w/v％。
更优的，所述步骤a中的离心条件为12000～14000rpm，离心10min。
更优的，所述步骤b中水溶性炭化二亚胺的浓度为9～10mg/ml。
更优的，所述步骤b中的离心条件为12000～14000rpm，离心10min。
更优的，所述步骤c乳胶悬液中羧基化的聚苯乙烯颗粒偶联抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋
白Ⅱ单克隆抗体Ι的量为：0.5mg抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι/10mg聚苯
乙烯颗粒。
更优的，所述步骤d中终止剂为50mM pH 8.2的Tris-HCl。
本发明中，v％指体积百分比；w/v％指重量体积百分比，如1w/v％即为100ml溶液
中含1g物质。
较优的，所述步骤2)中致敏乳胶聚酯膜的制备具体步骤为：
A.用乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.3～0.5w/v％的致敏乳胶溶液；
B.用步骤A制备好的致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。
更优的，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：9～11v％1.0M Tris液，0.25～0.35w/v
％聚乙二醇20000，0.18～0.20w/v％牛血清白蛋白，0.15～0.25w/v％脱脂牛奶，0.28～0.30
w/v％酪蛋白，和0.04～0.06w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。
最优的，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：10v％1.0M Tris液、0.3w/v％聚乙二
醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脱脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％叠
氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。
进一步较优的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和特异性，本发明所述的乳胶缓冲
液还包括下列组分：果糖、氯化钾和甘氨酸，且果糖、氯化钾和甘氨酸的总浓度为
3.25～4.75g/L，缓冲液的pH值为7.3－7.5。
更优选的，各组分在乳胶缓冲液中的浓度为：
果糖1.0-2.0g/L；氯化钾0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。
更优的，步骤B中用致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，每261mm×220mm聚酯膜上喷涂1.28
ml致敏乳胶溶液，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。
较优的，所述步骤3)中，喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗兔IgG的浓度为1.0～
2.0mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体
Ⅱ浓度为1.0～2.0mg/ml。较优的，每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔IgG和
6ml的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ溶液，检测线和质控线的间距为4.0～
6.0mm。
本发明制备的恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒灵敏度高，特异性强；此外本发明的试剂
盒还具有操作简单，价格低，储存和运输方便等优点。
本发明恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒的使用方法：
1.样品的处理：取全血，备用；建议处理好的样品及时检测，如不能立即检测处理好的
样品可在2～8℃下储存48小时。
2.样品的检测：用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中，待检样品在毛细作用下向吸
水纸端层析，依次通过聚酯膜、硝酸纤维素膜。到达聚酯膜后，被乳胶标记的单克隆抗体
充分识别并结合，继续层析到硝酸纤维素膜上，与硝酸纤维素膜上包被的抗恶性疟原虫组
氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体-Ⅱ发生免疫反应，显现出相应的红色线条。
3.结果的判读：在滴加样品后8-15分钟判读结果。
阳性：在检测试剂条的检测线和质控线位置各出现一条红色线条，表示样品中有恶性
疟原虫抗原的存在。
阴性：只在质控线位置出现一条红色线条，表示样品中无恶性疟原虫抗原的存在。
无效：质控线位置无红线出现，表示结果无效，应重试。
本发明的有益效果在于：本发明的恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒灵敏度高，特异性强；
此外本发明的试剂盒还具有操作简单，价格低，储存和运输方便等优点。
附图说明
图1：恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒试剂条示意图(1.滤样纸2.致敏乳胶聚酯膜3.免
疫硝酸纤维素膜4.吸水纸5.检测线6.质控线)
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭
露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方
式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发
明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特
定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施
方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另
外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点
以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科
学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、
材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本
发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来
实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术
及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等
MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor
Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN
MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the
series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN
STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS
IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic
Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin
Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒的制备
一、试剂来源：
羊抗兔IgG多克隆抗体(购自美国美迪生物技术有限公司MAXMED LABORATORIES
INC.)
硝酸纤维素薄膜、聚酯膜、聚苯乙烯颗粒(购自德国赛多利斯公司SARTORIUS)
聚苯乙烯颗粒(购自WHATMAN公司)
二、制备步骤：
方法1：
1.致敏乳胶颗粒的制备：
a.取0.4ml 10％羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中，加入1ml pH 6.0含0.01％SDS 20mM
的碳酸缓冲液冲洗两次，14000g/min离心10min，弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒
沉淀。
b.用0.5ml pH 6.020mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，
并加入0.5ml 10％水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌30分钟，最后用0.8ml 0.01M pH 8.0
的硼酸缓冲溶液冲洗三次、离心、弃上清，获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入1ml 0.2M pH 7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向该乳
胶悬液中加入2mg抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι。
d.充分反应12小时后，加入50mM pH8.2的Tris-HCl作为终止剂终止反应，获得致敏乳
胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备：
(1)乳胶缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入100ml 1.0M Tris液，准确称取3.0g
聚乙二醇20000、2.0g牛血清白蛋白，2.0g脱脂牛奶，3.0g酪蛋白溶液，0.5g叠氮化钠，
1.5g果糖，0.4g氯化钾，2.20g甘氨酸，加入溶液中，充分溶解，混合均匀，用盐酸调节
pH至8.0，加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.4w/v％的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上，置于37℃的温度下
烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备：
将2.0mg/ml羊抗兔抗体和1.5mg/ml抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ分别
喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上，37℃下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，
制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔IgG和抗恶性疟原
虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ溶液，检测线和质控线的间距为5mm。
4.将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上，切裁制
得试剂条；将试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒，获得恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒。
(如图1所示)。
方法2：
1.致敏乳胶颗粒的制备：
a.取1ml 6％羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中，加入2ml pH 6.0含0.01％SDS
20mM的碳酸缓冲液冲洗三次，12000g/min离心10min，弃上清，获得羧基化的聚苯乙
烯颗粒沉淀。
b.用1.5ml pH 6.020mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉
淀，并加入1.5ml 9％水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20分钟，最后用3ml 0.01M pH 8.0
的硼酸缓冲溶液冲洗三次、离心、弃上清，获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入2ml pH 7.00.2M的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向
该乳胶悬液中加入2.5mg抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι。
d.充分反应过夜后，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备：
(1)乳胶缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入90ml 1.0M Tris液，准确称取3.5g
聚乙二醇20000、1.8g牛血清白蛋白，1.5g脱脂牛奶，3.0g酪蛋白溶液，0.6g叠氮化钠
1.0g果糖，0.25g氯化钾，2.00g甘氨酸，加入溶液中，充分溶解，混合均匀，用盐酸调
节pH至8.0，加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.2w/v％的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上，置于37℃的温度
下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备：
将1.5mg/ml羊抗兔抗体和2.0mg/ml抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体抗体Ⅱ
分别喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上，37℃下烘干2小时，密封4-30℃下避光保
存，制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔IgG和抗恶性
疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体抗体Ⅱ溶液，检测线和质控线的间距为5mm。
4.同方法1。
方法3：
1.致敏乳胶颗粒的制备：
a.取0.5ml 12％羧基化的聚苯乙烯乳胶放入离心管中，加入1.5ml pH 6.0含0.01％SDS
20mM的碳酸缓冲液冲洗两次，13000g/min离心10min，弃上清，获得羧基化的聚苯乙
烯颗粒沉淀。
b.用0.5ml pH 6.020mM的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉
淀，并加入0.5ml 10％水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌25分钟，最后用1.5ml 0.01M pH8.0
的硼酸缓冲溶液冲洗两次、离心、弃上清，获得待标记物。
c.向步骤b获得的待标记物中加入1.5ml pH 7.00.2M的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并
向该乳胶悬液中加入3.75mg抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι。
d.充分反应过夜后，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。
2.致敏乳胶聚酯膜的制备：
(1)乳胶缓冲液的制备：取800ml纯化水，往里加入110ml 1.0M Tris液，准确称取2.5g
聚乙二醇20000、1.9g牛血清白蛋白，2.5g脱脂牛奶，2.8g酪蛋白溶液和0.4g叠氮化钠
2.0g果糖，0.5g氯化钾，2.25g甘氨酸加入溶液中，充分溶解，混合均匀，用盐酸调节
pH至8.0，加纯化水至总体积1000ml。
(2)用上一步的乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.6w/v％的致敏乳胶溶液。
(3)取1.28ml致敏乳胶溶液用点乳胶机喷点在预处理后的聚酯膜上，置于37℃的温度
下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，制得致敏乳胶聚酯膜。
3.免疫硝酸纤维素膜的制备：
将1.0mg/ml羊抗兔抗体和1.0mg/ml抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ分别
喷在硝酸纤维素膜质控线和检测线的位置上，37℃下烘干2小时，密封4-30℃下避光保存，
制得免疫硝酸纤维素膜。每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔IgG和抗恶性疟原
虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ溶液，检测线和质控线的间距为4mm。
4.同方法1。
实施例2对比试剂盒的制备
对比试剂盒的制备方法：乳胶缓冲液中不含果糖、氯化钾和甘氨酸，其他试剂及实验
方法均同实施例1中方法1～3。
实施例3恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒的特异性实验
检测方法：
1.取实施例1制备的恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒和实施例2的对比试剂盒，将试剂盒放置
在水平台面上。
2.待测样品的制备：按表1的四类实验对象，取全血作为待测样品。
3.每类实验对象为100人，检测结果如表1：
表1恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒特异性试验结果
由上表可知，本发明的恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒对乙型肝炎及梅毒均无交叉反应，
特异性良好。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此
外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精
神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选
实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事
实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在
本发明的范围内。