一种体外测定ACAT2活性的方法及其检测系统技术领域
本发明涉及体外检测领域，具体地，涉及一种体外测定ACAT2活性的方法
及其检测系统
背景技术
酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)是胆固醇代谢的关键酶，其是细
胞内唯一以含3-β-OH的游离固醇类为底物而催化合成相应固醇酯的酶，在维
持细胞内胆固醇、脂肪酸等脂质代谢平衡中起着极为重要的作用。目前为止
的文献报道，存在两种ACAT家族基因，分别编码ACAT1和ACAT2。ACAT1
存在于体内的所有组织细胞，其催化合成产物如胆固醇酯等进入细胞内脂滴
(Lipid droplet，LD)；而ACAT2在体内表达具有细胞、发育和种属特异性，对
于人则仅在肠与胚胎肝细胞中高表达、巨噬细胞中低表达(Chang CC等，
Immunological quantitation and localization of ACAT-1and ACAT-2in human
liver and small intestine.J Biol Chem，2000，275:28083-92)。肝肠细胞中ACAT2
催化合成产物如胆固醇酯等主要进入脂蛋白(Lipoprotein，LP)，包括乳糜微粒
(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)或类低密度脂蛋白(类LDL)分泌到细胞外
(Buhman KK等，Nat Med，2000，6:1341-1347；Repa et al.，Hepatology，2004，
40:1088-1097；Lee et al.，J Lipid Res，2005，46:1205-1212)。
至今，不管在无细胞体系、还是在完整细胞体系，ACAT1和ACAT2活性
的测定方法均无差别，并且一般使用同位素标记胆固醇或连接荧光基团固醇
作为酶的底物。并且目前，在测定ACAT2的活性时，往往会受到ACAT1的干
扰，因此在大规模应用时会有结果不精确以及检测时间过长的问题。
因此，本领域迫切需要开发一种能够快速、特异性的检测ACAT2活性的
方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够快速、特异性的检测ACAT2活性的方法。
本发明第一方面提供一种非治疗非诊断性的体外测定ACAT2活性的方法，所
述方法包括步骤：
(1)在培养体系中，在带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类的存在下，培
养表达ACAT2的细胞一段时间T1；
(2)检测所述培养体系中位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的
信号值S1；和
(3)基于上一步骤所检测的所述信号值S1，从而定性和/或定量确定ACAT2的
活性。
在另一优选例中，在步骤(3)中，将所检测的所述信号值S1与标准值和/或对照
值进行比较，从而确定ACAT2的活性。
在另一优选例中，所述的标准值包括标准数值或标准曲线。
在另一优选例中，所述的对照值是来自对照组的可检测标记物的信号值S0c。
在另一优选例中，所述的标准值是来自同一培养体系的背景信号值S0b。
在另一优选例中，所述的比较是计算信号值的差值ΔS：
ΔS＝S1-S0c或
ΔS＝S1-S0b
并基于所述差值ΔS定性和/或定量确定ACAT2的活性。
在另一优选例中，所述的比较是计算信号值的比值RS：
RS＝S1/S0c×100％或
RS＝S1/S0b×100％
并基于所述比值RS定性和/或定量确定ACAT2的活性。
在另一优选例中，所述方法中还包括设置对照组，其中：
步骤(1)包括：在测试组中，培养表达ACAT2的细胞，以带有可检测标记物
的含3-β-OH的固醇类处理细胞；在对照组中，以带有可检测标记物的含3-β-OH
的固醇类处理不含有细胞的培养液；
步骤(2)包括：经保温培养后，测定测试组和对照组的可检测标记物的信
号值(如荧光强度)，从而确定ACAT2的活性，若测试组的信号值S1显著高于对
照组的信号值S0c，则表明ACAT2活性显著高于对照组。
在另一优选例中，所述“显著高于”是指测试组的信号值S1与对照组的信号
值S0c的比值Rs≥2，较佳地≥5，更佳地≥10。
在另一优选例中，所述“显著高于”是指测试组的信号值S1与对照组的信号
值S0c的差值(×105OD)≥2，较佳地≥5，更佳地≥10。
在另一优选例中，所述的背景信号值S0b是在添加了所述带有可检测标记物的
含3-β-OH的固醇类之后的0-30分钟(较佳地1-20分钟，更佳地3-15分钟)内所测
定的位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值。
在另一优选例中，所述的对照组中，所培养的对照细胞是不表达ACAT2的细
胞。
在另一优选例中，所述的对照组中，所培养的对照细胞是表达ACAT2的细胞
(优选地，所述对照细胞是与测试组中相同的细胞)。
在另一优选例中，所述可检测标记物选自下组：发光团、荧光团、生色团、
或其组合。
在另一优选例中，所述的可检测标记物包括荧光标记，更佳地为NBD。
在另一优选例中，在步骤(1)中，所述培养体系中，还存在不带有可检测标
记物的含3-β-OH的固醇类。
在另一优选例中，所述含3-β-OH的固醇类选自下组：胆固醇，氧化胆固醇、
固醇类激素及其前体、胆固醇前体、胆汁酸类、或其组合。
在另一优选例中，步骤(1)中，所述的含3-β-OH的固醇类选自下组：27-
羟基胆固醇、24s-羟基胆固醇和25-羟基胆固醇。
在另一优选例中，所述的可检测标记物的含3-β-OH的固醇类选自下组：NBD
荧光基团标记的含3-β-OH的固醇类(简称为NBD-固醇，其中NBD荧光基团可标
记于固醇的不同位点上)。
在另一优选例中，所述的可检测标记物的含3-β-OH的固醇类带有一种或多
种不同的所述可检测标记物。
在在另一优选例中，在步骤(1)中，将不带有可检测标记物的3-β-OH的固醇类
和带有可检测标记物的3-β-OH的固醇类可按任意次序加入，包括同时或先后加
入所述培养体系。
在另一优选例中，所述的表达ACAT2的细胞选自下组：人和非人哺乳动物细
胞。
在另一优选例中，所述的表达ACAT2的细胞选自下组：肝细胞、肠细胞、肿
瘤细胞、永生化的细胞系、白细胞、基因工程改造的细胞。
在另一优选例中，所述的表达ACAT2细胞选自下组：肝癌细胞、肠癌细胞(如
结肠癌细胞)、血癌细胞。
在另一优选例中，所述的表达ACAT2的细胞是来自血液样本、体液样本、尿
液样本、唾液样本、肿瘤组织样本或癌旁样本的细胞。
在另一优选例中，所述的肿瘤组织为肝癌组织或肠癌组织。
在另一优选例中，所述的表达ACAT2细胞选自下组：分离自循环系统的肿瘤
细胞。
在另一优选例中，所述的含3-β-OH的固醇类是ACAT2特异识别的立体构
型底物，经ACAT2特异识别固醇3-β-OH催化合成固醇酯；或
所述的带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类是ACAT2特异识别的立体
构型底物，经ACAT2特异识别固醇3-β-OH催化合成固醇酯，且其携带荧光标
记。
在另一优选例中，所述表达ACAT2的细胞具有分泌脂蛋白的功能。
在另一优选例中，所述表达ACAT2的细胞表达载脂蛋白B和微粒体甘油三酯
转移蛋白。
在另一优选例中，所述的T1为0.1－24小时，较佳地为0.2-12小时，更佳
地为0.5-6小时，最佳地为1-5小时，极佳地2-3小时。
在另一优选例中，所述的培养体系的体积为1微升－100毫升，较佳地为5
微升－10毫升，更佳地为10微升-1000微升，最佳地为20-500微升，极佳地
50-200微升。
在另一优选例中，所述方法包括：在n个独立的培养体系中进行所述步骤
(1)和步骤(2)，其中n为1-10000的正整数，较佳地2-2000，更佳地5-1000，最佳
地为48、96、192、384。
在另一优选例中，所述的培养体系被置于多孔板(如48、96、192、384孔
板)中各孔中。
在另一优选例中，在步骤(2)中，所述的检测通过肉眼、仪器测定(如拍照、
图像分析)进行。
在另一优选例中，在步骤(1)和(2)之间，包括或不包括将所述细胞与所述
培养体系分离的步骤。
在另一优选例中，在步骤(1)和(2)之间不包括将所述细胞与所述培养体系
分离的步骤。
本发明第二方面提供了一种用于检测ACAT2活性的检测系统，所述系统包括：
(a)表达ACAT2的细胞；
(b)带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类；
(c)用于检测位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值的检测
仪器。
在另一优选例中，所述的系统还包括用于对所述信号值进行分析的分析装
置。
在另一优选例中，所述的分析装置存贮有用于对所述信号值进行分析的标准
数值或标准曲线。
本发明第三方面提供了一种确定测试化合物是否是ACAT2抑制剂或促进剂的
方法，包括步骤：
(a)在测试组中，在培养体系中，在带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类
和测试化合物的存在下，培养表达ACAT2的细胞一段时间T1，检测测试组所述培
养体系中位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值S1’；
并且在不存在所述测试化合物且其他条件相同的对照组中，检测对照组所述
培养体系中位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的信号值S1”；
(b)将上一步骤所检测的所述信号值S1’和S1”进行比较，从而确定所述测试化
合物是否是ACAT2抑制剂或ACAT2促进剂，
其中，如果信号值S1’显著高于S1”，则表示所述测试化合物是ACAT2促进剂；
如果信号值S1’显著低于S1”，则表示所述测试化合物是ACAT2抑制剂。
在另一优选例中，所述“显著高于”指S1’/S1”≥2,较佳地，≥3，更佳地≥
4。
在另一优选例中，所述“显著低于”指S1’/S1”≤1/2,较佳地，≤1/3，更佳
地≤1/4。
在另一优选例中，所述的信号值为荧光强度。
在另一优选例中，所述的方法是非诊断和治疗性的。
在另一优选例中，所述的方法包括步骤：将步骤(b)中所确定的ACAT2抑制剂
或ACAT2促进剂，施用于动物，并测定其对ACAT2的影响或对脂类代谢的影响。
本发明第四方面提供了一种分泌性脂蛋白复合物，所述复合物具有式I结构：
LP-(Y)m (I)
式中，
LP表示脂蛋白；
Y为带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇类酯；
m≥2。
在另一优选例中，所述的分泌性脂蛋白复合物是分离的或纯化的。
在另一优选例中，m≥5，较佳地为m≥10，更佳地为m≥50，最佳地为100，
极佳地为200。
在另一优选例中，所述复合物分子量≥2500kDa。
在另一优选例中，所述复合物具有位于外层的脂蛋白LP以及位于内部的Y。
在另一优选例中，所述复合物具有位于外层的载脂蛋白-磷脂-游离胆固醇组成
的LP以及位于内部的Y。
在另一优选例中，所述带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇类酯包被
于脂蛋白中。
在另一优选例中，所述复合物为表达ACAT2的细胞分泌至细胞外的复合物。
在另一优选例中，在所述复合物中，所述Y为聚集型。
在另一优选例中，所述复合物中所述聚集型Y所产生的可检测标记物信号显著
高于分散型Y所产生的可检测标记物信号。
例如，m个Y所构成的聚集型Y所产生的总信号值Stotal强于单个分散型Y所产生
的信号值Ssingle的m倍，即Stotal≥Ssingle×m。
更佳地，R＝Stotal/(Ssingle×m)≥2，较佳地R≥5，更佳地R≥50。
本发明第五方面提供了一种本发明第四方面所述的分泌性脂蛋白复合物的制
备方法，所述方法包括步骤：
(1)在培养体系中，在带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类的存在下，培
养表达ACAT2的细胞一段时间T1，从而形成所述的分泌性脂蛋白复合物；
(2)从所述培养体系中，分离出所述的分泌性脂蛋白复合物。
本发明第六方面提供了一种本发明第四方面所述的分泌性脂蛋白复合物的用
途，所述复合物用于制备(a)用于检测ACAT2活性的试剂或试剂盒；(b)用于检测或
辅助检测癌症或癌症易感性的试剂盒；(c)用于检测或辅助检测癌症转移的试剂
盒；和/或(d)用于制备血清检测或血液检测的试剂盒。
在另一优选例中，在所述试剂盒中，含有所述的分离的分泌性脂蛋白复合物
作为阳性对照。
在另一优选例中，所述试剂盒包括：
第一容器，所述容器含有所述分泌性脂蛋白复合物；
标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于体外检测ACAT2活
性。
本发明第七方面提供了一种非治疗非诊断性的体外测定ACAT2活性的方法，
所述方法包括步骤：
(1)提供一待检测样本；
(2)对所述样本进行处理，获得经处理的混合物，并检测所述混合物中本发明
第四方面所述的分泌性脂蛋白复合物所产生的自所述可检测标记物的信号值S1；
和
(3)基于上一步骤所检测的所述信号值S1，从而定性和/或定量确定所述样本
中的ACAT2的活性。
在另一优选例中，所述的样本包括细胞样本、血液样本、体液样本。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施
例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技
术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了细胞培养后的荧光强度测定结果
其中，图1A显示了L02、Huh7细胞和无细胞培养液(No cell)在同样保温培
养后的荧光强度测定结果，以无细胞培养液测定结果作为对照；**P<0.01。
图1B显示了Huh7细胞培养液经超滤处理后超滤膜之上(top)及超滤膜之下
(bottom)的培养液中的相对荧光强度(％)测定结果。
图2显示了ACAT2抑制剂对细胞培养后的荧光强度影响结果
其中，PPPA为ACAT2的选择性特异抑制剂，5μM处理细胞能够完全抑
制高表达的ACAT2的活性。
图3显示了ACAT2抑制剂的IC50测定结果
其中图3A利用Huh7、HepG2和Caco-2三株细胞，测定不同浓度的PPPA
对细胞ACAT2活性的抑制作用。
图3B对上述测定数据，使用GraphPad Prism软件作图，获得相应细胞
ACAT2相对活性(％)对PPPA浓度对数[Log(PPPAμM)]的抑制曲线。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外的开发了一种检测ACAT2活性
的方法，该方法能够特异性的定性和/或定量检测细胞中ACAT2的活性，并且
具有很高的灵敏度。
具体地，在表达ACAT2细胞中加入带有可检测标记物的固醇类(如NBD
－固醇)，并检测进入分泌脂蛋白的带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇
类酯的信号值(如荧光强度)，通过对信号值(如荧光强度)进行分析，从而
能够很精确的确定ACAT2的活性。
体外测定ACAT2活性的方法
本发明提供了一种体外测定ACAT2活性的方法，包括步骤：
(1)在培养体系中，在带有可检测标记物的含3-β-OH的固醇类的存在下，培
养表达ACAT2的细胞一段时间T1；
(2)检测所述培养体系中位于所述细胞外部的且产生自所述可检测标记物的
信号值S1；和
(3)基于上一步骤所检测的所述信号值S1，从而定性和/或定量确定ACAT2的
活性。
其中，在步骤(3)中，通过将所检测的所述信号值S1与标准值(S0b)和/或对照
值(S0c)进行比较，从而确定ACAT2的活性。
所述的比较是计算信号值的差值ΔS：
ΔS＝S1-S0c或
ΔS＝S1-S0b
并基于所述差值ΔS定性和/或定量确定ACAT2的活性。
或者，所述的比较是计算信号值的比值RS：
RS＝S1/S0c×100％或
RS＝S1/S0b×100％
并基于所述比值RS定性和/或定量确定ACAT2的活性。
利用本发明所述的方法检测细胞中ACAT2的活性，能够排除ACAT1对ACAT2
活性测定的干扰，可以直接用于对内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝
肠细胞)进行生理和病理功能效应及其相关抑制作用等研究。
分泌性脂蛋白复合物
本发明首次发现了一种分离的分泌性脂蛋白复合物，所述复合物具有式I结构：
LP-(Y)m (I)
式中，
LP表示脂蛋白；
Y为带有可检测标记物的3-β-OH被酯化的固醇类酯；
m≥2，较佳地m≥5，更佳地为m≥50，最佳地为100，极佳地200。
其中，所述复合物分子量≥2500kDa，且所述带有可检测标记物的3-β-OH被
酯化的固醇类酯以聚集体的形式包被于脂蛋白中。
在本发明中，复合物中聚集型Y所产生的可检测标记物信号显著高于分散型Y
所产生的可检测标记物信号。
例如，m个Y所构成的聚集型Y所产生的总信号值Stotal强于单个分散型Y所产生
的信号值Ssingle的m倍，即Stotal≥Ssingle×m。更佳地，R＝Stotal/(Ssingle×m)≥2，较佳
地R≥5，更佳地R≥50。
本发明通过检测分泌性脂蛋白复合物的信号值(如荧光强度)，从而能够快
速、精确的确定细胞中ACAT2的活性。
试剂盒
本发明提供了一种检测ACAT2活性的试剂盒，该试剂盒包括：
第一容器，所述容器含有分泌性脂蛋白复合物，其中分泌性脂蛋白复合物作
为阳性对照。
标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于体外检测ACAT2
活性。
在本发明中，通过检测试剂盒中分泌性脂蛋白复合物的信号值(如荧光
强度)，从而能够快速、精确的确定细胞中ACAT2的活性，能够用于大规模
高效的筛选ACAT2选择性特异抑制剂，加速肝癌等疾病的临床诊治与药物研
发。
本发明的优点包括：
(1)在分泌脂蛋白且内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝细胞、
肠细胞、白细胞)中进行ACAT2活性测定，ACAT1对ACAT2活性测定无干扰
作用；
(2)本发明的测定ACAT2活性的方法可以直接用于对内源性ACAT2、
ACAT1均表达的细胞(如肝细胞、肠细胞、白细胞)进行生理和病理功能效应
及其相关抑制作用等研究；
(3)本发明测定ACAT2活性的方法适宜于利用小体积、多孔板进行规模
性高效筛选ACAT2选择性特异抑制剂及检测细胞对ACAT2抑制的毒性作用；
(4)可成为规模性筛选ACAT2特异性抑制剂的关键性技术方法，不但促
进高效筛选ACAT2选择性特异抑制剂，而且加速肝癌等疾病的临床诊治与药物
研发；
(5)首次公开了一种分泌性脂蛋白复合物，通过检测该复合物的信号值
(如荧光强度)，能够快速、精确的确定细胞中ACAT2的活性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明
本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方
法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则
百分比和份数按重量计算。
材料和方法
1.材料和试剂
细胞培养基Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)和胎牛血清购自
Life Technologies公司(Rockville，USA)。
3-β-OH的荧光标记固醇是由荧光基团NBD取代胆固醇的22位异丙基而合
成的含3-β-OH的NBD-固醇(NBD-sterol)，结构式如下：
含3-β-OH的固醇类包括胆固醇、27-hydroxycholesterol(27OH)、
24s-hydroxycholesterol(24sOH)、25-hydroxycholesterol(25OH)分别购自Sigma、
Medical Isotope和Enzo Life Science公司。ACAT2选择性特异抑制剂PPPA购
自Enzo life science公司。
超滤柱Amicon Ultra-15Centrifugal Filters(滤膜孔径10kDa)购自Millipore
公司(Ireland)。荧光分析仪EnVision Multilabel Reader(PerkinElmer，USA)。
2.细胞及培养条件
人正常肝细胞株L02、人肝癌细胞株Huh7由中国科学院细胞库提供。人肝
母细胞瘤细胞株HepG2、人结肠癌细胞株Caco-2，购自ATCC(American Type
Culture Collection)。
Caco-2细胞用20％胎牛血清的DMEM培养基培养；其余细胞都用含10％胎
牛血清的DMEM培养基培养。细胞均在95％湿度、37℃、5％CO2条件下培养。
所有培养基都加入100U/ml的氨苄青霉素和100μg/ml链霉素。
3.细胞培养后的荧光测定分析
L02和Huh7细胞在过夜培养后，加入含3-β-OH的固醇类和荧光标记固醇，
同时以含3-β-OH的固醇类和荧光标记固醇处理不含有细胞的培养液作为对
照，同样保温培养后再使用荧光分析仪(E488，A535)进行荧光强度测定。
4.细胞培养液经超滤后的荧光测定分析
将上述条件下的Huh7细胞培养液进行超滤处理，再使用荧光分析仪
(E488，A535)分别测定滤膜上和滤膜下的液体的荧光强度，以未经超滤处理
的Huh7细胞培养液的荧光强度为100％，计算相对荧光强度(％)。
5.测定PPPA对ACAT2活性的抑制作用
利用文献报道的可完全抑制高表达ACAT2活性的选择性特异抑制剂
PPPA浓度(5μM)，同时处理上述条件下的L02、Huh7、HepG2和Caco-2细
胞后，比较加与不加抑制剂之间荧光强度的差异。
对PPPA抑制ACAT2活性的IC50测定，是利用PPPA梯度浓度处理上述条件
下的Huh7、HepG2和Caco-2细胞后，将无PPPA处理细胞的ACAT2活性设定为
100％，分别计算相应PPPA浓度处理的相对ACAT2活性(％)，使用GraphPad
Prism软件作图，获得相应细胞ACAT2相对活性对PPPA浓度对数[Log(PPPA
μM)]的抑制曲线和IC50。
6.统计分析
利用unpaired Student’s t test进行实验差异的统计分析。
实施例1细胞培养液的NBD-固醇酯主要分布在分泌脂蛋白中
本发明人利用不具有分泌脂蛋白功能且ACAT2不表达的L02(正常肝细
胞)和具有分泌脂蛋白功能且ACAT2高表达的Huh7细胞(肝癌细胞)，通过
加入含3-β-OH的固醇类和荧光标记固醇，同时以含3-β-OH的固醇类和荧光标
记固醇处理不含有细胞的培养液作为对照，同样保温培养后进行荧光强度测
定。
结果表明，如图1A所示，与不具有分泌脂蛋白功能的L02细胞相比，具有
分泌脂蛋白功能的Huh7细胞培养后的荧光强度非常显著地提高。进一步，将
以上Huh7细胞培养液经部分超滤处理后的结果(图1B)显示，荧光主要分布于
超滤膜(Ultra-10)之上(top)的培养液，而超滤膜之下(bottom)的培养液荧光非常
弱，表明存在于细胞培养液的荧光主要源自进入分泌脂蛋白(分子量＞10kDa)
的聚集型NBD-固醇酯，而不是游离型NBD-固醇(约0.5kDa)。
发明人将含聚集型NBD-固醇酯的分泌脂蛋白复合物(分子量＞10kDa)进
行分离纯化，发现荧光信号来源于进入分泌脂蛋白的聚集型NBD-固醇酯。在
分泌性脂蛋白复合物中，NBD－固醇酯以聚集体的形式包被于脂蛋白中。
分析后的结果表明，分泌性脂蛋白复合物的荧光强度比游离的NBD－固醇要
高很多，至少高1倍，其由外层载脂蛋白-磷脂-游离胆固醇的脂蛋白和位于内部的
NBD－固醇酯两部分组成，并且分泌性脂蛋白复合物的直径为15-22nm，形成脂蛋
白复合物之前的脂蛋白的直径为22-80nm。
实施例2分泌脂蛋白中的NBD-固醇酯由ACAT2催化合成
本发明人在上述同样实验中，同时加入文献报道的可完全抑制高表达
ACAT2活性的选择性特异抑制剂PPPA(5μM)处理。
如图2结果显示，ACAT2高表达的Huh7细胞培养后的荧光强度有非常显著
的降低，且与不具有分泌脂蛋白功能且ACAT2不表达的L02无显著差异，进而
表明Huh7细胞培养后在分泌脂蛋白中聚集的NBD-固醇酯量依赖于ACAT2活
性。
实施例3选择性特异抑制剂PPPA对ACAT2活性的抑制作用
本发明人深入的实验研究，在具有分泌脂蛋白功能且内源性ACAT2均高
表达的另二株天然型细胞HepG2和Caco-2进行同样的5μM PPPA处理，图3A显
示，HepG2和Caco-2的结果与Huh7的完全一致。
进一步地，测定ACAT2选择性特异抑制剂PPPA的IC50，结果见图3B和表1。
Huh7、HepG2和Caco-2三株细胞均是内源性ACAT2高表达，在0.008-5μM浓度
范围，PPPA的抑制曲线无明显差异(图3B)；且特异抑制ACAT2活性的IC50
也相近(表1)。
表1 PPPA特异抑制ACAT2活性的IC50
细胞株
IC50(μM)
Huh7
0.167
HepG2
0.177
Caco-2
0.141
结果表明，已成功构建了可用于ACAT2活性测定的新技术方法体系，可
应用于规模性筛选调节ACAT2的活性或表达的待测定物质，还可应用于通过
测定血液来源细胞的ACAT2活性进行免疫功能异常或炎症发生、肝癌或肠癌
转移的分析。
实施例4筛选促进或抑制ACAT2活性的测试化合物的方案
利用前面所述所构建的新技术方法体系，进行规模性筛选促进或抑制
ACAT2活性的测试化合物，通过将测试化合物测试组的荧光强度(S1’)和不
存在测试化合物且其他条件相同的对照组的荧光强度(S1”)进行比较，从而
确定测试化合物是否是ACAT2抑制剂或ACAT2促进剂。
如果信号值S1’显著高于S1”，如高于2倍以上，则表示测试化合物是ACAT2
促进剂；如果信号值S1’显著低于S1”，如低于50％以上，则表示测试化合物是
ACAT2抑制剂，其潜在地可研发成为一种抑制肿瘤或抗动脉粥样硬化病变的药
物。
实施例5测定血液来源细胞的ACAT2活性进行免疫功能异常或炎症发
生、肝癌或肠癌转移分析的方案
利用前面所述所构建的新技术方法体系，通过测定健康者血液分离细胞
培养后的荧光强度，获得具有统计学意义的测试标准；通过测定受试者血液
分离细胞培养后的荧光强度，比较受试者和测试标准的荧光强度，用来分析
受试体检者的健康水平和受试患者相关疾病的辅助诊断；若是受试者的荧光
强度显著低于测试标准，则表明该受试者血液分离细胞的ACAT2活性偏低而
免疫功能异常抑制，如感染性炎症；若是受试者的荧光强度显著高于测试标
准，则表明该受试者血液分离细胞的ACAT2活性偏高而免疫功能异常激活，
如过敏性炎症或非可控性炎症(nonresolving inflammation)；若是受试者的荧
光强度非常显著高于测试标准，则表明该受试者血液含有高表达ACAT2的转
移癌细胞，如肝癌或肠癌细胞的转移。
实施例6试剂盒制备
本实施例提供了一种检测ACAT2活性的试剂盒及其制备，该试剂盒包括：
第一容器，所述容器含有分泌性脂蛋白复合物，其中分泌性脂蛋白复合物作
为阳性对照。
标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于体外检测ACAT2活
性。
对比例1
采用本发明相同的方法，对人神经瘤细胞(如SK-N-SH)进行ACAT2活
性的测定。结果表明，人神经瘤细胞(如SK-N-SH)不表达ACAT2，也不分
泌脂蛋白，荧光强度不增加，检测不到ACAT2的活性。
对比例2
采用本发明相同的方法，对人肝癌细胞(如Hep3B)进行ACAT2活性的测定，
结果表明，人肝癌细胞(如Hep3B)不表达ACAT2，虽然能够分泌脂蛋白，但是
荧光强度不增加，因此检测不到ACAT2的活性。
讨论
如表2所示，发明人对大量的细胞株进行研究后发现，不是所有能够分泌
脂蛋白的细胞株均能够用本发明所述的方法检测ACAT2的活性，并且不分泌
脂蛋白的细胞株也检测不到ACAT2的活性。
因此，在分泌脂蛋白且内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝细胞、
肠细胞、白细胞)中测定ACAT2的活性。结果发现，ACAT1对ACAT2活性的
测定无明显干扰作用，而且该方法测定的是内源性ACAT2的活性，因此该方
法可直接用于对内源性ACAT2、ACAT1均表达的细胞(如肝细胞、肠细胞、
白细胞)进行生理和病理功能效应及其相关抑制作用等方面的研究。
表2 用本发明所述方法测定不同细胞株的ACAT2活性
细胞株
细胞类型
脂蛋白分泌
荧光强度增加
ACAT2活性
Huh7
人肝癌细胞
能
非常显著
高
HepG2
人肝癌细胞
能
非常显著
高
Caco-2
人肠癌细胞
能
非常显著
高
THP-1
人单核白细胞
能
显著
低
Hep3B
人肝癌细胞
能
无
无
L02
人正常肝细胞
能
无
无
SK-N-SH
人神经瘤细胞
否
无
无
AC29
仓鼠卵母细胞
否
无
无
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献
被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，
本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申
请所附权利要求书所限定的范围。