一种同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量的方法技术领域
本发明涉及食品检测与食品质量控制领域，具体涉及一种红葡萄酒中4-乙基苯酚
与4-乙基愈创木酚含量的测定方法，特别是涉及一种通过顶空固相微萃取-气相色谱-质谱
联用技术进行检测的方法。
背景技术
葡萄酒的气味是葡萄酒质量与品质的一项重要指标，良好的气味会增加葡萄酒的
复杂性和协调性，并提高消费者购买率。相反，不良的气味则会造成葡萄酒的缺陷。
葡萄酒的气味是由很多物质构成的。其中，挥发性酚类是很重要的一类，尤其是4-
乙基苯酚(4-ethylphenol,4-EP)、4-乙基愈创木酚(4-ethylguaiacol,4-EG)。
4-EP通常被描述为“草棚味”、“马厩味”，4-EG则被描述为烟熏味、丁香味。低浓度
时，4-EP和4-EG可以增加葡萄酒气味的复杂性；高浓度时，因其嗅觉阈值较低(4-EP:430μg/
L、4-EG:33μg/L)，容易造成红葡萄酒的感观缺陷。通常，它们在酒中的浓度从几十微克每升
到几百微克每升不等。当达到数毫克每升时，4-EP会带来一种强烈的“马厩”味。即使是在较
低的浓度下(600-700μg/L)，4-EP也会改变酒的香气。虽然其气味可能只有轻微地令人不愉
快，但它仍然会掩盖掉果香和酒香，使酒失去它们本身的个性。研究表明，这类挥发性酚类
物质给葡萄酒带来的香气上的缺陷是普遍存在的。因此，建立一种准确、快速检测红葡萄酒
中4-EP、4-EG的方法，了解目前红葡萄酒中4-EP、4-EG的含量情况是十分必要的。这将为进
一步研究其产生机理、控制其对红葡萄酒感官品质的影响提供技术支持。
近年来，随着现代分析技术的发展，一些精密的分析手段被应用于葡萄酒风味物
质的分离和鉴定，如气相色谱、气相色谱/质谱联用系统等。但使用这些分析系统之前，都必
须将香气物质较为完全地从葡萄酒中抽提出来，以获得理想的分析结果。因此选择适当的
萃取方法是十分必要的。目前葡萄酒香气的萃取方法有溶剂萃取法、固相萃取法(SPE)、吹
扫捕集法(P&T)、顶空固相微萃取法(HS-SPME)、固态搅拌棒吸附萃取法(SBSE)等。尤其是
SPE技术，近年来被广泛运用于葡萄酒香气成分的研究。但该方法的难点是众多操作参数的
选择和定量结果的重复性，因而，需要研究建立相应的方法后才可用作日常质量控制分析。
国外的研究中，对于4-EP、4-EG的萃取技术主要有液-液萃取、固相萃取(SPE)、固
相微萃取(SPME)、顶空固相微萃取(HS-SPME)、多重顶空固相微萃取。其中多重顶空固相微
萃取是对顶空固相微萃取技术的改进，可连续分离样品中的挥发性酚类物质，同时能避免
可能出现的基体效应。对于4-EP、4-EG的定量分析检测技术主要有GC-FID或GC-MS。也有文
献报道用HPLC-FID定量分析合适的挥发性酚类样本以及用HPLC-电化学阵列检测器定量分
析。
而在中国，相关报道很少。目前，优质国产葡萄酒已经开始逐渐走出国门，出口到
世界各地，而葡萄酒中4-EP、4-EG的检测手段的不足，使得我国葡萄酒在出口上很容易遭遇
其他国家的贸易壁垒。
总而言之，我国在葡萄酒中4-EP、4-EG的检测与其他国家相比有较大的差距。这对
于我国葡萄酒产业的进一步发展，是一个很大的隐患。因此建立一种快速、准确、方便、实用
的检测方法，有利于监控葡萄酒生产过程中4-EP、4-EG的含量控制，进而保障葡萄酒的质
量，以及消费者食品安全与我国葡萄酒产业的健康发展。目前尚无针对红葡萄酒中4-EP和
4-EG检测的相关专利。
发明内容
本发明的目的是填补红葡萄酒中4-EP和4-EG相关检测方法领域的不足，通过摸索
最佳顶空固相微萃取条件和最佳气相色谱-质谱分离条件而提供一种红葡萄酒中4-EP和4-
EG含量的测定方法，从而克服上述不足。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量的方法，其特征在
于：所述方法包括以下步骤：
a.内标物的制备：精确称取1mg纯度为色谱纯的对-甲酚标准品，用纯度为色谱纯
的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存，作为内标物使用；
b.顶空固相微萃取：在装有磁力搅拌器的15mL顶空瓶中加入待测红葡萄酒样品
10mL，加入步骤a中制备的内标物100μL和NaCl；将顶空瓶置于磁力加热搅拌装置上，在50℃
预先加热平衡10min，调整磁力搅拌转速为850rpm，插入萃取头；
c.标准曲线的测定：分别精确称取纯度为色谱纯的4-EP标准品1mg和纯度为色谱
纯的4-EG标准品1mg，用纯度为色谱纯的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存；用
纯度为色谱纯的乙醇稀释，分别配制50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L和3000
μg/L的4-EP标准品溶液；5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的
4-EG标准品溶液；
在装有磁力搅拌器的15mL顶空瓶中分别加入上述标准品溶液10mL，加入步骤a中
制备的内标物100μL和NaCl；将顶空瓶置于磁力加热搅拌装置上，在50℃预先加热平衡
10min，调整磁力搅拌转速为850rpm，插入萃取头；
d.气相色谱-质谱检测：将上述步骤b、c的萃取手柄分别插入气相色谱仪的进样口
进样，解析5min，得到待测红葡萄酒样品溶液中4-EP、4-EG和内标物的峰面积，以及4-EP标
准品、4-EG标准品和内标物的峰面积；
e.标准曲线的计算：以标准品峰面积与内标物峰面积之比为响应值A，即
响应值A＝标准品峰面积/内标物峰面积；
根据响应值与标准品溶液浓度之间存在的线性关系，制成标准曲线；
f.待测红葡萄酒样品中4-EP、4-EG浓度的计算：以待测红葡萄酒样品中4-EP、4-EG
的峰面积分别与内标物的峰面积之比为响应值B4-EP、B4-EG，即
B4-EP＝待测红葡萄酒样品中4-EP峰面积/内标物峰面积，
B4-EG＝待测红葡萄酒样品中4-EG峰面积/内标物峰面积；
根据步骤e中得到的标准曲线计算待测红葡萄酒样品中4-EP、4-EG浓度；
其中，
所述步骤d中，
1)气相色谱检测条件：
气相色谱进样方式为SPME无分流进样；
气相色谱升温程序为初始温度50℃保持3分钟，之后以10℃/min升至150℃，再以5
℃/min升至180℃，再以10℃/min升至210℃，保持16min；
2)质谱条件：
质谱仪电离源为EI电离源，电子能量为70eV，扫描范围(m/z)：50～500AMU，离子源
温度250℃。
所述的同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量的方法步骤b和步
骤c中，NaCl的添加量为2.5g。
所述的同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量的方法步骤b和步
骤c中，萃取头为美国Supelco公司的50/30μmDVB/CAR/PDMS萃取头。
所述的同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量的方法步骤b和步
骤c中，顶空固相微萃取的温度为55℃，萃取时间为45min。
所述的同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量的方法步骤d中，
检测仪器为美国安捷伦公司GC6890/MS5973型气相色谱/质谱联用仪；
气相色谱检测条件还包括：
1)色谱柱为美国安捷伦公司的HP-INNO-WAX，规格为60.0m×0.25mm×0.25μm；
2)载气为高纯度氮气，流量1mL/min；
3)检测器温度250℃，进样口温度250℃。
所述的同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量的方法步骤d中，
质谱条件还包括：质谱分析结束后，分析结果运用NIST2005标准谱库进行检索。
本发明的有益效果在于：
建立一种快速、准确、方便、实用的检测方法，用于同时检测和监控红葡萄酒生产
过程中4-EP、4-EG的含量，进而保障葡萄酒的质量，以及消费者食品安全与我国葡萄酒产业
的健康发展。
填补我国在红葡萄酒中4-EP、4-EG的含量检测方法领域的不足，为葡萄酒质量检
测提供技术支持。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明的实施例中的4-EP标准曲线图；
图2为本发明的实施例中的4-EG标准曲线图；
图3为本发明的实施例中的4-EP和4-EG标准品气相色谱图；
图4为实际检测中红葡萄酒样品中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚以及内标物的气
相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的描述。
本发明一种同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量的方法，其包
括以下步骤：
a.内标物的制备：精确称取1mg纯度为色谱纯的对-甲酚标准品，用纯度为色谱纯
的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存，作为内标物使用。
b.顶空固相微萃取：在装有磁力搅拌器的15mL顶空瓶中加入待测红葡萄酒样品
10mL，加入步骤a中制备的内标物100μL和2.5g的NaCl。将顶空瓶置于磁力加热搅拌装置上，
在50℃预先加热平衡10min，调整磁力搅拌转速为850rpm，插入萃取头，在55℃下顶空固相
微萃取45min。
其中，萃取头为美国Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头。
c.标准曲线的测定：分别精确称取纯度为色谱纯的4-EP标准品1mg和纯度为色谱
纯的4-EG标准品1mg，用纯度为色谱纯的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存。用
纯度为色谱纯的乙醇稀释，分别配制50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L和3000
μg/L的4-EP标准品溶液；5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的
4-EG标准品溶液。
在装有磁力搅拌器的15mL顶空瓶中分别加入上述标准品溶液10mL，分别加入步骤
a中制备的内标物100μL和2.5g的NaCl。将顶空瓶置于磁力加热搅拌装置上，在50℃预先加
热平衡10min，调整磁力搅拌转速为850rpm，插入萃取头，在55℃下顶空固相微萃取45min。
其中，萃取头为美国Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头。
d.气相色谱-质谱检测：萃取结束后，将上述步骤b、c的萃取手柄分别插入气相色
谱仪的进样口进样，解析5min，得到待测红葡萄酒样品溶液中4-EP、4-EG和内标物的峰面
积，以及4-EP标准品、4-EG标准品和内标物的峰面积。
检测条件：
检测仪器为现有的美国安捷伦公司GC6890/MS5973型气相色谱/质谱联用仪。
1.气相色谱检测条件：
1)气相色谱进样方式为SPME无分流进样；
2)色谱柱为美国安捷伦公司的HP-INNO-WAX，规格为60.0m×0.25mm×0.25μm；
3)气相色谱升温程序：初始温度50℃保持3分钟，之后以10℃/min升至150℃，再以
5℃/min升至180℃，再以10℃/min升至210℃，保持16min。
4)载气为高纯度氮气，流量1mL/min。
5)检测器温度250℃，进样口温度250℃。
2.质谱条件：
1)质谱仪电离源为EI电离源，电子能量为70eV，扫描范围(m/z)：50～500AMU，离子
源温度250℃。
2)质谱分析结束后，分析结果运用NIST2005标准谱库进行检索。
e.标准曲线的计算：以标准品峰面积与内标物峰面积之比为响应值A，即
响应值A＝标准品峰面积/内标物峰面积；
根据响应值与标准品溶液浓度之间存在的线性关系，制成标准曲线。
f.待测红葡萄酒样品中4-EP、4-EG浓度的计算：以待测红葡萄酒样品中4-EP、4-EG
的峰面积分别与内标物的峰面积之比为响应值B4-EP、B4-EG，即
B4-EP＝待测红葡萄酒样品中4-EP峰面积/内标物峰面积，
B4-EG＝待测红葡萄酒样品中4-EG峰面积/内标物峰面积,
通过步骤e中得到的标准曲线计算待测红葡萄酒样品中4-EP、4-EG浓度。
通过下述方法验证上述一种同时检测红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚
含量的方法。
1.红葡萄酒中4-EP和4-EG含量的精密度检测：
精确称取1mg纯度为色谱纯的对-甲酚标准品，用纯度为色谱纯的乙醇定容在1mL
棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存，作内标物使用。
分别精确称取纯度为色谱纯的4-EP标准品1mg和纯度为色谱纯的4-EG标准品1mg，
用纯度为色谱纯的乙醇定容在1mL棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存。用纯度为色谱纯的乙醇
稀释，分别配制50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L、2000μg/L和3000μg/L的4-EP标准品溶
液；5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L和1000μg/L的4-EG标准品溶液。
在装有磁力搅拌器的15mL顶空瓶中分别加入上述标准品溶液10mL，分别加入上述
内标物100μL和2.5g的NaCl。将顶空瓶置于磁力加热搅拌装置上，在50℃预先加热平衡
10min，调整磁力搅拌转速为850rpm，插入萃取头，在55℃下顶空固相微萃取45min。
其中，萃取头为美国Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头。
萃取结束后，将萃取手柄插入气相色谱仪的进样口进样，解析5min。得到4-EP标准
品、4-EG标准品和内标物的峰面积。
以标准品峰面积与内标物峰面积之比为响应值A，即
响应值A＝标准品峰面积/内标物峰面积。
根据响应值与标准品溶液浓度之间存在的线性关系，制成标准曲线。
经过检测，得到的标准曲线方程为：
4-EP标准曲线线性回归方程为Y＝0.0001X+0.0084，线性相关系数R2＝0.9971。
4-EG标准曲线线性回归方程为Y＝0.0006X+0.0217，线性相关系数R2＝0.9946。
4-EP标准曲线图如图1所示，4-EG标准曲线图如图2所示，4-EP与4-EG标准品气相
色谱图如图3所示。使用本发明所提供的4-EP和4-EG含量的测定方法得到的4-EP和4-EG标
准曲线的线性相关系数R2＞0.99，表明本方法精密度高。
2.红葡萄酒中4-EP和4-EG含量的回收率检测：
取待测红葡萄酒样品分别进行两个浓度的加标试验。
精确称取纯度为色谱纯的对-甲酚标准品1mg，用纯度为色谱纯的乙醇定容在1mL
棕色容量瓶中，-20℃冰箱保存，作内标物使用。
(1)4-EP和4-EG标准品的添加量为1.0mg/L和2.0mg/L。
在装有磁力搅拌器的15mL顶空瓶中加入待测红葡萄酒样品10ml，加入上述内标物
100μL和2.5g的NaCl，加入4-EP标准品1.0mg/L、4-EG标准品2.0mg/L。将顶空瓶置于磁力加
热搅拌装置上，在50℃预先加热平衡10min，调整磁力搅拌转速为850rpm，插入萃取头，在55
℃下顶空固相微萃取45分钟。萃取结束后，将萃取手柄插入气相色谱仪的进样口进样，解析
5min，得到4-EP、4-EG和内标物的峰面积。
其中，萃取头为美国Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头。
(2)4-EP和4-EG标准品的添加量为0.2mg/L、0.4mg/L。
在装有磁力搅拌器的15mL顶空瓶中加入待测红葡萄酒样品10ml，加入上述内标物
100μL和2.5g的NaCl，加入4-EP标准品0.2mg/L、4-EG标准品0.4mg/L。将顶空瓶置于磁力加
热搅拌装置上，在50℃预先加热平衡10min，调整磁力搅拌转速为850rpm，插入萃取头，在55
℃下顶空固相微萃取45分钟。萃取结束后，将萃取手柄插入气相色谱仪的进样口进样，解析
5min，得到4-EP、4-EG和内标物的峰面积。
其中，萃取头为美国Supelco公司的50/30μm DVB/CAR/PDMS萃取头。
上述两个加标水平回收率见表1。
表1红葡萄酒中4-EP和4-EG在两个加标水平的回收率(n＝5)
(注：n为平行试验个数)
综上所述，本专利所提供的红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量检测方
法回收率较高，相对标准偏差较低。
3.实际检测：
采用上述经过验证的红葡萄酒中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚含量检测方法，对
红葡萄酒样品进行实际检测。
图4为实际检测中红葡萄酒样品中4-乙基苯酚与4-乙基愈创木酚以及内标物的气
相色谱图。