一种沙格列汀中有关物质的检测方法技术领域
本发明涉及化学领域。具体地，本发明涉及一种沙格列汀中有关物质的检测方法。
背景技术
沙格列汀，化学名称：(1S,3S,5S)-2-[(2S)-2-氨基-2-(3-羟基-1-金刚烷基)乙酰
基]-2-氮杂双环[3.1.0]己烷-3-腈，其结构式为：
沙格列汀是一种二肽基肽酶-4(Dipeptidyl Peptidase 4，DPP-4)抑制剂，通过选
择性抑制DPP-4，可以升高内源性胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like Peptide-1，GLP-1)和
葡萄糖依赖性促胰岛素释放多肽(Glucose-dependent Insulinotropic Peptide，GIP)水
平，从而调节血糖。
有关物质指的是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物，以
及贮藏过程中的降解产物等。就本申请而言，沙格列汀中可能含有的主要有关物质包括IM-
A、IM-B、IM-C、IM-D、IM-E、IM-F及中间体IM-I；其中IM-D和IM-E分别为IM-B和IM-C的烯醇式
结构；IM-A、IM-B和IM-C的结构分别如下所示：
虽然目前已有沙格列汀有关物质的检测方法的进口注册标准，但该方法无法有效
分离杂质IM-A和IM-B，并且沙格列汀峰拖尾严重。
因此，为了有效分离杂质峰，改善沙格列汀峰的峰形，需要开发一种新的沙格列汀
中有关物质的检测方法。
发明内容
本发明的发明人经过研究，发明了一种沙格列汀中有关物质的检测方法。
本发明的检测方法选用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以高氯酸钠溶液-甲醇-乙
腈为流动相进行梯度洗脱。
本发明的检测方法能够更好地将有关物质按极性大到极性小的顺序洗脱出来，且
各目标峰峰形良好，各杂质峰均得到良好的分离。
附图说明
图1示出了实施例1的高效液相色谱图。
图2示出了实施例2的高效液相色谱图。
图3示出了实施例3的高效液相色谱图。
图4示出了对比实施例的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供一种沙格列汀中有关物质的检测方法，其特征在于，选用十八烷基硅
烷键合硅胶色谱柱，以高氯酸钠溶液为A相、甲醇为B相、乙腈为C相进行梯度洗脱，流速为
0.4～1.0mL/min，柱温20～40℃，样品溶液的浓度为0.2-1.0mg/mL，进样量5-30μL，样品的
检测波长为210-220nm。
在本发明的一个优选实施方案中，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱的填料的颗
粒度为3-7μm，优选为3-5μm，色谱柱的规格为4.6×250mm或4.6×150mm。
在本发明的一个优选实施方案中，所述高氯酸钠溶液的浓度为0.05-0.15mol/L，
优选0.07-0.125mol/L，更优选0.08-0.12mol/L，最优选0.09-0.11mol/L。
在本发明的一个优选实施方案中，其中使用三氟乙酸或高氯酸将A相的pH调至
0.5-5，优选调至pH 1-4，最优选调至pH 1.5-3.5。
在本发明的一个优选实施方案中，其中流动相梯度为(以下为体积比)：0-5min时，
A％:B％:C％＝80-90％:0-15％:5-20％；15-25min时，A％:B％:C％＝50-65％:0-15％:35-
45％；25-30min时，A％:B％:C％＝10-25％:0-15％:80-90％。
在本发明的一个优选实施方案中，其中流动相梯度为(以下为体积比)：0min时，
A％:B％:C％＝76.5％:10％:13.5％；18min时，A％:B％:C％＝52.2％:10％:37.8％；25-
30min时，A％:B％:C％＝9％:10％:81％。
在本发明的一个优选实施方案中，所述流动相的流速优选为0.5-0.9mL/min，优选
0.6-0.8mL/min。
在本发明的一个优选实施方案中，其中样品溶液的浓度优选为0.4-0.9mg/mL，最
优选0.5-0.8mg/mL。
在本发明的一个优选实施方案中，用0.01-0.1mol/L盐酸与乙腈的混合液作为稀
释溶液配制样品溶液，其中盐酸与乙腈的体积比为100:0-50:50，优选100:0-60:40，最优选
100:0-70:30。
在本发明的一个优选实施方案中，进样量优选为10-25μL，最优选为15-20μL。
在本发明的一个优选实施方案中，加校正因子的外标法以峰面积计算沙格列汀中
有关物质的含量。具体地，根据以下公式(I)计算沙格列汀中有关物质的含量：
…………公式(I)
其中：wi：组分i在样品中的百分含量；
Ai：供试溶液中杂质的峰面积；
CR：对照溶液中维格列汀的浓度，单位：mg/ml；
AR：对照溶液中维格列汀峰的平均峰面积；
CS：供试溶液的浓度，单位：mg/ml；
Fi：相应杂质的校正因子(见表1)，其他单杂的校正因子以1计；
表1：部分杂质的校正因子F
杂质名称
校正因子F
IM-A
0.48
IM-B
1.54
IM-C
0.82
IM-E
0.63
IM-I
0.66
实施例
以下结合实施例对本发明做进一步的详细描述。以下实施例不应被解释为对本发
明的限制。凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
实施例1
采用高相液相色谱法检测沙格列汀中的有关物质。
色谱柱：GLODS-3色谱柱，规格4.6×250mm，填料的颗粒度为3μm。
流动相：以0.1mol/L高氯酸钠溶液为A相，甲醇为B相，乙腈为C相进行梯度洗脱，洗
脱梯度见表1。用三氟乙酸将A相的pH调至1.5。
表2：实施例1的洗脱梯度(体积比)
时间(分钟)
A(％)
B(％)
C(％)
0
76.5
10
13.5
18
52.2
10
37.8
25-30
9
10
81
流速：0.6mL/min。
柱温：30℃。
检测波长：215nm。
样品：将沙格列汀用稀释溶液(0.1mol/L盐酸与乙腈的混合溶液，体积比8:2)配制
成0.5mg/mL的溶液，量取20μL进行分析。
检测结果如图1所示。按以上公式(I)以峰面积计算沙格列汀中有关物质含量。各
目标峰与最近相邻峰的分离度最小为1.95，柱效最高达到36万，沙格列汀峰拖尾因子为
1.09，接近1，峰形对称，无拖尾现象。
实施例2
采用高相液相色谱法检测沙格列汀中的有关物质。
色谱柱：ODS-3色谱柱，规格4.6×250mm，填料的颗粒度为3μm。
流动相：以0.05mol/L高氯酸钠溶液为A相，甲醇为B相，乙腈为C相进行梯度洗脱，
洗脱梯度见表2。用高氯酸将A相的pH调至3.5。
表3：实施例2的洗脱梯度(体积比)
时间(分钟)
A(％)
B(％)
C(％)
0
76
5
19
18
55
5
40
25-30
9.5
5
85.5
流速：0.4mL/min。
柱温：40℃。
检测波长：215nm。
样品：将沙格列汀用稀释溶液(0.1mol/L盐酸与乙腈的混合溶液，体积比8:2)配制
成0.5mg/mL的溶液，量取20μL进行分析。
检测结果如图2所示。按以上公式(I)计算沙格列汀中有关物质含量。各目标峰与
最近相邻峰的分离度最小为1.66，柱效最高达到29万，沙格列汀峰拖尾因子为1.13，接近1，
峰形对称，无拖尾现象。
实施例3
采用高相液相色谱法检测沙格列汀中的有关物质。
色谱柱：Welch Xtimate C18色谱柱，规格为4.6×250mm，填料的颗粒度为5μm。
流动相：以0.12mol/L高氯酸钠溶液为A相，甲醇为B相，乙腈为C相进行梯度洗脱，
洗脱梯度见表3。用三氟乙酸将A相的pH调至2.5。
表4：实施例3的洗脱梯度(体积比)
时间(分钟)
A(％)
B(％)
C(％)
0
76.5
15
8.5
18
46.5
15
38.5
25-30
8.5
15
76.5
流速：1.0mL/min。
柱温：25℃。
检测波长：215nm。
样品：将沙格列汀用稀释溶液(0.1mol/L盐酸与乙腈的混合溶液，体积比8:2)配制
成0.5mg/mL的溶液，量取20μL进行分析。
检测结果如图3所示。按以上公式(I)以峰面积计算沙格列汀中有关物质含量。各
目标峰与最近相邻峰的分离度最小为2.05，柱效最高达到12万，沙格列汀峰拖尾因子为
1.09，接近1，峰形对称，无拖尾现象。
实施例4
采用高相液相色谱法检测沙格列汀中的有关物质。
色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse AAA色谱柱，规格3.0×150mm，填料颗粒度3.5μ
m。
流动相：以0.08％的三氟乙酸溶液-甲醇进行梯度洗脱，洗脱梯度见表4。
表5：对比实施例的洗脱梯度(体积比)
时间(分钟)
0.08％三氟乙酸溶液
甲醇
0
90
10
20
72
28
40-45
10
90
流速：0.6mL/min。
柱温：40℃。
检测波长：215nm。
样品：将沙格列汀用0.1mol/L的盐酸配制成0.5mg/mL的溶液，量取60μl进行分析。
检测结果如图4所示。按以上公式(I)以峰面积计算沙格列汀中有关物质含量。该
方法的检测波长接近三氟乙酸的截止波长(210nm)，导致基线漂移较大，且IM-A、IM-B两杂
质没有被完全分离(分离度无法自动计算)。此外，主峰拖尾因子达到2.7，峰型较差，存在拖
尾现象。
实施例5(系统适用性试验)：
采用高相液相色谱法检测沙格列汀中的有关物质。
色谱柱：ODS-3色谱柱，规格4.6×250mm，填料的颗粒度为3μm。
流动相：以0.1mol/L高氯酸钠溶液为A相，甲醇为B相，乙腈为C相进行梯度洗脱，洗
脱梯度见表5。用三氟乙酸将A相的pH调至2.5。
表6：实施例5的洗脱梯度(体积比)
时间(分钟)
A(％)
B(％)
C(％)
0
76.5
10
13.5
18
52.2
10
37.8
25-30
9
10
81
流速：0.6mL/min。
柱温：30℃。
检测波长：215nm。
样品：取沙格列汀及IM-E适量，用0.1mol/L盐酸与乙腈的混合溶液(体积比8:2)溶
解，配制成含沙格列汀0.5mg/ml、含IM-E约0.75μg/ml的系统适用性溶液。将所述系统适用
性溶液稀释至约含沙格列汀0.75μg/ml的对照品溶液，分别量取20μL进行分析。
通过计算可以知道，沙格列汀峰与IM-E峰之间分离度为3.56，大于1.5，因此沙格
列汀与IM-E被完全分离。沙格列汀峰的理论塔板数为63923，大于5000，拖尾因子为1.26。将
对照溶液重复进样5次，沙格列汀峰面积的RSD％为0.48％，小于2.0％；沙格列汀保留时间
的RSD％为0.01％，小于2.0％。
实施例6(线性试验)：
采用高相液相色谱法检测沙格列汀中的有关物质。
色谱柱：GLODS-3色谱柱，规格4.6×250mm，填料的颗粒度为3μm。
流动相：以0.1mol/L高氯酸钠溶液为A相，甲醇为B相，乙腈为C相进行梯度洗脱，洗
脱梯度见表5。用三氟乙酸将A相的pH调至2.5。
表7：实施例6的洗脱梯度(体积比)
时间(分钟)
A(％)
B(％)
C(％)
0
76.5
10
13.5
18
52.2
10
37.8
25-30
9
10
81
流速：0.6mL/min。
柱温：30℃。
检测波长：215nm。
线性溶液：取沙格列汀及IM-A、IM-B、IM-C、IM-E、IM-I适量，用0.1mol/L盐酸与乙
腈的混合溶液(体积比8:2)溶解，配制6组混合溶液，所述各混合溶液中沙格列汀、IMA、IMB、
IMC、IME、IMI的浓度如下：第一组均为0.2μg/mL、第二组均为0.375μg/mL、第三组均为0.56μ
g/mL、第四组均为0.75μg/mL、第五组均为0.94μg/mL、第六组均为1.125μg/mL。分别量取上
述6组混合溶液各20μL进行分析。
记录各目标峰的峰面积，计算其在各溶液中的浓度。用最小二乘法进行线性拟合，
线性回归系数分别为0.9998、0.9999、0.9997、0.9997、0.9999、0.9999。
实施例7(准确度试验)：
采用高相液相色谱法检测沙格列汀中的有关物质。
色谱柱：GLODS-3色谱柱，规格4.6×250mm，填料的颗粒度为3μm。
流动相：以0.1mol/L高氯酸钠溶液为A相，甲醇为B相，乙腈为C相进行梯度洗脱，洗
脱梯度见表5。用三氟乙酸将A相的pH调至2.5。
表8：实施例7的洗脱梯度(体积比)
时间(分钟)
A(％)
B(％)
C(％)
0
76.5
10
13.5
18
52.2
10
37.8
25-30
9
10
81
流速：0.6mL/min。
柱温：30℃。
检测波长：215nm。
供试溶液：取沙格列汀及IM-A、IM-B、IM-C、IM-E、IM-I适量，用0.1mol/L盐酸与乙
腈的混合溶液(体积比8:2)溶解，配制成三组供试溶液，其中第一组含沙格列汀0.5mg/mL、
含IM-A、IM-B、IM-C、IM-E、IM-I各0.375μg/mL，第二组含沙格列汀0.5mg/mL、含IM-A、IM-B、
IM-C、IM-E、IM-I各0.75μg/mL，第三组含沙格列汀0.5mg/mL、含IM-A、IM-B、IM-C、IM-E、IM-I
各1.125μg/mL。分别量取所述三种混合溶液各20μL进行分析，重复进样3次。按下式计算回
收率：
…………公式(II)
其中：
Ai：测得准确度溶液中杂质的峰面积；
CR：对照溶液中沙格列汀的浓度，单位：mg/ml；
DSPS：准确度溶液中供试品的稀释体积，单位：ml；
AR：对照溶液中沙格列汀峰的平均峰面积；
F：相应杂质的校正因子；
wi％：供试品中该杂质的原有百分含量；
wSPS：准确度溶液中沙格列汀称样量，单位：mg；
Cir：准确度母液中该杂质的浓度，单位：mg/ml；
V：加入准确度溶液母液的体积，单位：ml。
IM-A的回收率为98.73％～107.88％，9个样品的平均回收率为101.82％，RSD％为
3.12％，小于10.0％；IM-B的回收率为102.22％～105.93％，9个样品的平均回收率为
103.65％，RSD％为1.03％，小于10.0％；IM-C的回收率为97.01％～99.22％，9个样品的平
均回收率为98.28％，RSD％为0.86％，小于10.0％；IM-E的回收率为100.75％～106.09％，9
个样品的平均回收率为101.83％，RSD％为1.62％，小于10.0％；IM-I的回收率为98.32％～
105.29％，9个样品的平均回收率为101.95％，RSD％为2.75％，小于10.0％。