氨基化石墨烯量子点/BSA复合探针检测胰蛋白酶的方法技术领域
本发明涉及一种氨基化石墨烯量子点/BSA复合探针检测胰蛋白酶的方法，属于荧
光探针材料检测领域。
背景技术
急性胰腺炎(AP)是一种致命的疾病，归为持续性胰腺炎疾病。整体的急性胰腺炎
病人的死亡率在7％左右，记录确诊的病例数目还在急剧增长。然而，AP的诊治仍然是一个
很大的挑战因为缺乏特殊病症和研究成熟的生物标记的临床信号。研发一种在活体检查确
诊之前能够有效、快速、可靠的筛选诊断AP是很有必要的。胰蛋白酶是胰腺中的一种消化
酶，含量主要是由胰腺分泌的胰蛋白酶抑制剂控制的，过表达的胰蛋白酶会引起多种蛋白
酶的过表达最终摧毁细胞。过表达的胰蛋白酶通常从胰腺炎病人的尿液中进行检测，因此
尿液样本中的定量检测被认为是胰腺炎筛选的无创标记。酶联免疫吸附法是胰蛋白酶检测
的一种普遍方法，然而，这种方法昂贵，耗时并且通常要求样本数量较多。样品预分析净化
过程会导致样品的损失，因此会牺牲检测结果的准确性和重现性。基于荧光的检测方法是
另外一种蛋白酶定量检测的方法。在过去的10年中，基于生物分析的荧光检测的方法被广
泛用于检测蛋白水解酶、蛋白质、核酸、小分子等，同时这种方法也提供了一种有效花费快
速检测酶的方法。在所有的荧光纳米材料中，量子点被广泛用于生物传感。
量子点是一种能够在激发光激发下产生荧光的零维纳米材料，其半径小于或接近
波尔半径。由于量子点的粒径很小，存在量子限域效应，连续能级结构变成具有分子特性的
能级结构，从而发射出强烈的荧光。由于量子点的尺寸效应和介电效应，量子点的发光表现
出独一无二的性质。量子点发光的特性主要有：具有较宽的激发光谱、可以通过尺寸控制调
节荧光、具有较高的光稳定性已经具有较长的荧光寿命。量子点具有丰富的标记颜色，较高
的发光强度以及较长的观察时间等优点，已经使其成为可以替代有机荧光染料做为荧光探
针，应用于生物成像、生物检测和环境检测中。但是由于半导体量子点具有一定的生物毒
性，贵金属纳米簇的价格昂贵限制了其生物方面的应用。相比之下，一些低毒性的量子点如
硅量子点、碳量子点和石墨烯量子点在生物检测中具有广阔的应用前景。其中石墨烯量子
点(Wang Y,Zhang L,Liang R P,et al.Using graphene quantum dots as
photoluminescent probes for protein kinase sensing[J].Analytical chemistry,
2013,85(19):9148-9155.)由于其独特物理化学性质在生物检测方面引起的广泛的研究。
Hu等(Hu L,Han S,Parveen S,et al.Highly sensitive fluorescent detection of
trypsin based on BSA-stabilized gold nanoclusters[J].Biosensors and
Bioelectronics,2012,32(1):297-299.)报道了使用BSA稳定的金纳米簇检测胰蛋白酶，加
入胰蛋白酶以后，BSA稳定的金纳米簇的荧光强度明显减弱，同时量子点的生物相容性增
强，根据荧光强度的变化可以检测出胰蛋白酶的浓度。但是这种方法中纳米金属于贵金属，
检测成本高。Poon等(Poon C Y,Li Q,Zhang J,et al.FRET-based modified graphene
quantum dots for direct trypsin quantification in urine[J].Analytica chimica
acta,2016,917:64-70.)报道了一种利用石墨烯量子点的荧光共振能量转移检测胰蛋白酶
的方法，但是荧光共振能量转移对的选择和连接仍然是荧光共振能量转移的一大问题。因
此，研究出简易的、低成本的胰蛋白酶的检测方法对于胰腺炎等相关疾病的检测具有重要
的研究意义。
石墨烯量子点由于其独特的水溶性和荧光稳定性引起了广泛的关注，但是由于其
尺寸小、荧光量子产率较低，一般在实际应用在生物检测中会将其功能化或者修饰来增强
其荧光量子产率(Liu C,Zhang P,Tian F,et al.One-step synthesis of surface
passivated carbon nanodots by microwave assisted pyrolysis for enhanced
multicolor photoluminescence and bioimaging[J].Journal of Materials
Chemistry,2011,21(35):13163-13167.)，减少因为量子点自身团聚造成的荧光猝灭现象。
同时石墨烯量子点的功能化和修饰对于增强量子点生物相容性具有重要的意义。氨基化量
子点具有一种新型的氨基终止的石墨烯的结构，具有很好的荧光可调节性(Tetsuka H,
Asahi R,Nagoya A,et al.Optically Tunable Amino‐Functionalized Graphene
Quantum Dots[J].Advanced materials,2012,24(39):5333-5338.)。BSA是一种水溶性很
好的蛋白质分子，可以与氨基化石墨烯量子点由于非共价作用力复合，形成的复合探针具
有良好的水溶性和生物相容性，能够很好的用于生物检测。到目前为止，氨基化的石墨烯量
子点用于生物检测的研究还未有报道。
考虑到复合探针的荧光强度的变化对于胰蛋白酶含量的检测具有特定功能，这为
简易检测胰腺炎病人的胰蛋白酶含量提供了一类新方法。
发明内容
本发明提供一种氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针用于胰蛋白酶检测的
方法。
本发明采用的技术方案是：首先通过水热合成的方法制备了氨基化石墨烯量子点
(af-GQDs)，再将af-GQDs与牛血清蛋白(BSA)复合，制备出牛血清蛋白/氨基化石墨烯量子
点复合探针(af-GQDs/BSA)，复合探针的荧光出现增强，荧光量子产率增加。最后以af-
GQDs/BSA复合探针为荧光检测探针，用于胰蛋白酶的检测，考察了其对胰蛋白酶的检测效
果。随着胰蛋白酶含量的增加，复合探针的荧光迅速增强，根据荧光强度的变化可以得出胰
蛋白酶的含量。该复合探针具有良好的荧光稳定性，对于胰蛋白酶的检测具有操作简便及
高灵敏性，在疾病的诊断与治疗方面具有广阔的应用前景。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种氨基化石墨烯量子点/BSA复合探针(氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合
探针)检测胰蛋白酶的方法，包括如下步骤：
步骤1、氨基化石墨烯量子点(af-GQDs)的制备：
首先制备氧化石墨烯(GO)，配制1.0mg/mL的GO溶液，量取5mL配制好的GO溶液、3～
9mL质量分数28％的氨水和5mL二次蒸馏水混合均匀，继续搅拌30min后迅速将其转移至聚
四氟乙烯高压反应釜中进行恒温热反应，冷却至室温，使用0.22um的聚四氟乙烯滤膜抽滤，
得滤液；将滤液在100℃下加热1h除去多余的氨；将所得溶液使用10kDa的渗析袋渗析24h，
真空冷冻干燥后制得氨基化石墨烯量子点；
步骤2、氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针的制备：
配制pH＝8的磷酸缓冲溶液和0.1mg/mL的氨基化石墨烯量子点溶液待用；在剧烈
搅拌的条件下分别量取氨基化石墨烯量子点溶液4mL，磷酸缓冲溶液4mL和BSA溶液2mL，混
合，其中BSA溶液的浓度为1mg/mL，在混合好的溶液置于37℃下恒温孵化，即可得到氨基化
石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针；将复合探针溶液置于4℃下保存待用；
步骤3、荧光测试：
将步骤2制备的0.1mg/mL的氨基化石墨烯量子点溶液进行荧光光谱测试，得到的
最佳激发波长为Ex＝340nm，最佳发射波长为Em＝431nm；在相同的条件下测试步骤2得到的
氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针，当激发波长为Ex＝340nm，复合探针的发射波
长为Em＝445nm；相比较氨基化石墨烯量子点的荧光发射波长，复合探针的荧光发射波长发
生了红移，并且复合探针的荧光强度增强；
步骤4、胰蛋白酶的检测：
量取制备好的氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针2mL，加入2mL的pH＝8的
磷酸缓冲溶液混合均匀，再加入不同浓度的胰蛋白酶溶液1mL，混合均匀，在37℃下孵化，检
测其在激发波长为Ex＝340nm时的发射波长和荧光强度。
其中，步骤1中，所述的恒温热反应温度为70～150℃，反应的时间为4～6h。
其中，步骤2中，所述的37℃下恒温孵化时间为2～12h。
其中，步骤3中，所述的复合探针的荧光发射波长发生了红移，并且复合探针的荧
光强度增强。可能的原因是氨基化石墨烯量子点溶液和BSA溶液的氨基和羧基的相互作用
以及氢键的作用使得量子点表面的缺陷被修复，减少了量子点表面的缺陷，使得量子点的
荧光增强。
其中，步骤4中，所述的检测胰蛋白酶时，由于胰蛋白酶能够分解牛血清蛋白，破坏
了复合探针的结构，同时胰蛋白酶分解产生的赖氨酸和精氨酸能够还原氨基化石墨烯量子
点，导致量子点的荧光迅速增强。
其中，步骤4中，所述的胰蛋白酶的检测范围为0～100μg/mL。
其中，步骤4中，所述的37℃下孵化时间为15min～2h。
本发明的有益效果在于：
本发明制备的氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针具有制备方法简单，荧
光稳定性强的特点。对胰蛋白酶的检测具有操作简便、快速及高灵敏性，在疾病的诊断与治
疗方面具有广阔的应用前景。这为快速高效检测胰腺病人的胰蛋白酶含量提供了一种新方
法。
附图说明
图1中，图a为氨基化石墨烯量子点的透射电镜图，图b为氨基化石墨烯量子点/牛
血清蛋白复合探针的的透射电镜图；
图2中，曲线a为氨基化石墨烯量子点的荧光发射光谱，曲线b为氨基化石墨烯量子
点/牛血清蛋白复合探针的荧光发射光谱，曲线c为氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合
探针在加入胰蛋白酶以后的荧光发射光谱。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。
实施例1：
(1)氨基化石墨烯量子点(af-GQDs)的制备
首先根据Hummers法(Hummers Jr W S,Offeman R E.Preparation of graphitic
oxide[J].Journal of the American Chemical Society,1958,80(6):1339-1339.)制备
出氧化石墨烯(GO)，配制1.0mg/mL的GO溶液，量取配制好的GO溶液5mL，质量分数28％的氨
水3mL，和5mL的二次蒸馏水混合均匀，继续搅拌30min后迅速将其转移至聚四氟乙烯高压反
应釜中，70℃下反应4h，冷却至室温，使用0.22um的聚四氟乙烯滤膜抽滤，得滤液。将滤液在
100℃下加热1h除去多余的氨。将所得溶液使用10kDa的渗析袋渗析24h，真空冷冻干燥后制
得氨基化石墨烯量子点。
(2)氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针的制备
配制pH为8的磷酸缓冲溶液和0.1mg/mL的氨基化石墨烯量子点溶液待用。在剧烈
搅拌的条件下分别量取氨基化石墨烯量子点溶液4mL，磷酸缓冲溶液4mL和BSA溶液2mL，混
合，其中BSA溶液的浓度为1mg/mL，在混合好的溶液置于37℃下恒温孵化2h，即可得到氨基
化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针。将复合探针溶液置于4℃下保存待用。
(3)荧光测试
将制备的0.1mg/mL的氨基化石墨烯量子点溶液进行荧光光谱测试，得到的最佳激
发波长为Ex＝340nm,最佳发射波长为Em＝431nm。在相同的条件下测试氨基化石墨烯量子
点/牛血清蛋白复合探针，当激发波长为Ex＝340nm，复合探针的发射波长为Em＝445nm。相
比较氨基化石墨烯量子点的荧光发射波长，复合探针的荧光发射波长发生了红移，并且复
合探针的荧光强度增强。
(4)胰蛋白酶的检测
量取制备好的氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针2mL，加入2mL的pH为8的
磷酸缓冲溶液混合均匀，再加入浓度范围为0～100ug/mL的胰蛋白酶溶液1mL，混合均匀，在
37℃下孵化15min，检测其在激发波长为Ex＝340nm时的发射波长和荧光强度，荧光发射波
长位置基本不变，荧光强度增强，胰蛋白酶增强了复合探针的荧光。
实施例2：
(1)氨基化石墨烯量子点(af-GQDs)的制备
首先根据Hummers法制备出氧化石墨烯(GO)，配制1.0mg/mL的GO溶液，量取配制好
的GO溶液5mL，质量分数28％的氨水36mL，和5mL的二次蒸馏水混合均匀，继续搅拌30min后
迅速将其转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，150℃下反应6h，冷却至室温，使用0.22um的聚
四氟乙烯滤膜抽滤，得滤液。将滤液在100℃下加热1h除去多余的氨。将所得溶液使用10kDa
的渗析袋渗析24h，真空冷冻干燥后制得氨基化石墨烯量子点。
(2)氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针的制备
配制pH为8的磷酸缓冲溶液和0.1mg/mL的氨基化石墨烯量子点溶液待用。在剧烈
搅拌的条件下分别量取氨基化石墨烯量子点溶液4mL，磷酸缓冲溶液4mL和BSA溶液2mL，混
合，其中BSA溶液的浓度为5mg/mL，在混合好的溶液置于37℃下恒温孵化12h，即可得到氨基
化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针。将复合探针溶液置于4℃下保存待用。
(3)荧光测试
将制备的0.1mg/mL的氨基化石墨烯量子点溶液进行荧光光谱测试，得到的最佳激
发波长为Ex＝340nm,最佳发射波长为Em＝429nm。在相同的条件下测试氨基化石墨烯量子
点/牛血清蛋白复合探针，当激发波长为Ex＝340nm，复合探针的发射波长为Em＝447nm。相
比较氨基化石墨烯量子点的荧光发射波长，复合探针的荧光发射波长发生了红移，并且复
合探针的荧光强度增强。
(4)胰蛋白酶的检测
量取制备好的氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合探针2mL，加入2mL的pH为8的
磷酸缓冲溶液混合均匀，再加入浓度范围为0～100ug/mL的胰蛋白酶溶液1mL，混合均匀，在
37℃下孵化2h，检测其在激发波长为Ex＝340nm时的发射波长和荧光强度，荧光发射波长位
置基本不变，荧光强度增强，胰蛋白酶增强了复合探针的荧光。
图1中，图a为氨基化石墨烯量子点的透射电镜图，图b为氨基化石墨烯量子点/牛
血清蛋白复合探针的的透射电镜图；由图a和图b可知，氨基化石墨烯量子点尺寸均匀，复合
探针中氨基化石墨烯量子点吸附到牛血清蛋白上且量子点分散程度较好。
图2中，曲线a为氨基化石墨烯量子点的荧光发射光谱，曲线b为氨基化石墨烯量子
点/牛血清蛋白复合探针的荧光发射光谱，曲线c为氨基化石墨烯量子点/牛血清蛋白复合
探针在加入胰蛋白酶以后的荧光发射光谱。由图2可知，与氨基化石墨烯量子点相比，复合
探针的荧光发生红移并且荧光强度增强。加入胰蛋白酶以后，复合探针的荧光强度迅速增
强。