一种基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法技术领域
本发明涉及一种基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法，
属于食品安全检测领域。
背景技术
食物传播是人类感染鼠伤寒沙门氏菌的主要途经,肉类(尤其是禽肉)、蛋类及蛋
制品、未经巴氏消毒的牛奶及奶制品、海产品等很多食品都与鼠伤寒沙门氏菌病有关。它是
一种人畜共患致病菌，可污染食品并大量繁殖，其致病机制是随食物经口进入人体后会随
淋巴系统进入血液，造成人体感染，不仅如此，鼠伤寒沙门氏菌入侵肠道后菌体裂解后会产
生大量内毒素，内毒素作用于肠粘膜引发宿主全身性炎症，出现中毒症状。由鼠伤寒沙门氏
菌引起的食物中毒具有发病率高，发病时间短等特点。因此建立一种快速、准确、便捷的检
测方法，对于从源头预防副溶血性弧菌的污染，预防中毒事故的发生具有重要意义。
检测沙门氏菌的方法主要包括传统的平板计数法、聚合酶链式反应(PCR)、环介导
等温扩增方法(LAMP)、免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫荧光技术(IFT)、胶体
金免疫层析技术(GICA)、免疫磁珠分离技术(IMB)等。平板计数法检验程序较繁琐，在检测
时间、灵敏度与特异性等方面存在缺陷。新发展起来的实时荧光定量PCR技术，虽然能缩短
检验时间，但前期需要提取细菌总DNA，且灵敏度仍然不高；免疫学方法如酶联免疫吸附分
析法、电化学免疫分析法、酶联荧光分析法等，具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，
但抗体作为识别分子易受外界条件影响，尤其是温度，而且抗体的制备需要经过动物或细
胞实验，繁琐费时，成本较高。近些年来，寡核苷酸适配体(aptamer)因其为体外制备获得，
周期短成本低，且稳定性好，易于修饰，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多
领域的关注，广泛应用于生命科学等各个领域的研究工作中。
ATP合酶(F0F1-ATPase)是一旋转分子马达。它既能利用跨膜H+梯度合成ATP，又能
水解ATP而反向转运H+。在ATP合成过程中，质子能够从载色体膜内泵到膜外侧，导致内膜微
环境溶液H+浓度变化。在分子马达上连接负载会不同程度影响其旋转性能。自上世纪60年
代起，就有许多科学家开始研究这个天然的分子马达，它具有纳米级别的尺寸、精巧的运作
方式，能实现能量之间的转换，可作为生物传感器应用到食品安全、医疗等领域，有广阔的
应用前景。因此本发明利用鼠伤寒沙门氏菌的适配体作为识别分子，将其与分子马达结合
构建适配体分子马达传感系统检测鼠伤寒沙门氏菌。该发明可用于乳制品、肉制品等食品
中鼠伤寒沙门氏菌的检测。
发明内容
一种基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法：首先，从深红
红螺菌中提取载色体，载色体再连上ε亚基抗体-生物素-亲和素-5’端生物素化的鼠伤寒沙
门氏菌适配体，形成分子马达适配体传感器。由于适配体对目标物质的特异性识别，最终形
成载色体-适配体-菌体复合物。在F-7000荧光探测仪的荧光模式下，以496nm进行激发，记
录515nm处荧光信号强度，通过对不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的检测，建立标准曲线，达到
对含鼠伤寒沙门氏菌样品进行定量检测的目的。具体检测原理如图1所示。本方法灵敏度
高、特异性强、操作方便，在食品安全检测领域将具有广阔的应用前景。
实现本发明的具体方法：
1)载色体的制备：将深红红螺菌Rhodospirillum rubrum菌种按比例1:100接种到液体
培养基，26℃、150r/min，培养72h。然后5000r/min离心30min，4℃离心收集菌体。用提取
Buffer(20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100mmol/L NaCl溶液，2mmol/L MgCl2溶液，1mmol/L
DTT溶液)重悬菌体，离心去上清液(8000r/min、4℃离心10min)。加入提取Buffer重悬菌体
(约1g加入10mL Buffer)，再加入终浓度1mmol/L PMSF，冰上超声破碎30min(超声5s，停
8s)。将破碎菌体离心(25000r/min、4℃离心90min)，去沉淀取上清液。将上清液超速离心
(50000r/min、4℃离心1.5h)，取沉淀即为载色体。最后用提取Buffer重悬沉淀并加入30％
的甘油，置于-80℃保存。
2)荧光探针F-DHPE标记载色体以及生物素标记ε亚基抗体：先将F-DHPE用氯仿配成
1mg/mL，分装成200μL/管后用氮气吹干，置于-80℃保存。从冰箱中取出1管已吹干的F-
DHPE，加入200μL无水乙醇将其充分溶解。取200μL载色体原液放入1.5mL离心管中，加入30μ
L F-DHPE，上下颠倒混匀5次，用铝泊纸包起后避光放在室温摇床上孵育15min。15000r/
min、4℃离心30min，收集沉淀。重复用PBS洗3次以去除多余的荧光探针，将沉淀用300μL
PBS重悬备用，最终获得荧光探针F-DHPE标记的载色体。将2μL生物素(2μmol/L)加入到20μL
亚基抗体中，室温孵育30min，抗体N端即被标记。
3)分子马达适配体传感器的构建：取300μL已标好F-DHPE的载色体于离心管中，加入40
μg N-biotin标记ε亚基抗体，用PBS补加至1m L，37℃反应1h；4℃、15000r/min离心30min；
弃上清液，将沉淀用500μL PBS重悬；加入2μL亲和素(1mg/mL)，用PBS补加至1mL，室温摇床
上(转速50～100r/min)反应3h；4℃、15000r/min离心30min，弃上清液，将沉淀用500μL PBS
重悬；加入生物素标记的鼠伤寒沙门氏菌适配体(10μM)50μL，用PBS补加至1mL，室温摇床上
(转速50～100r/min)反应30min)，弃上清液，用300μL含30％甘油的PBS重悬载色体，放入-
20℃冰箱备用。最终获得适配体-分子马达复合物。
4)鼠伤寒沙门氏菌的检测：取不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌菌液，与载色体-适配体复合
物进行孵育，然后加入ATP合成缓冲液启动反应。在F-7000的荧光模式下，以496nm进行激
发，记录515nm处的荧光强度。当体系中不存在目标菌种时，捕获探针和荧光探针的适配体
没有与目标物质结合，因此此时荧光强度最小(F0)，随着鼠伤寒沙门氏菌浓度的增加，荧光
信号强度逐渐增加。根据荧光强度的增加值(ΔF)与对应的细菌的浓度的对数值建立标准
曲线。
本发明的优点在于：
1.本发明方法以适配体作为识别元件，相比于免疫分析法中使用抗体作为识别元件，
适配体稳定性好，制备成本低，易于标记且标记后不影响其活性，同时对目标菌体具有高度
亲和力和高度选择性，在很大程度上提高了检测的准确性。
2.本发明将适配体与分子马达联用，构建适配体-F0F1-ATPase分子马达生物传感器，
用于鼠伤寒沙门氏菌的检测，可大大缩短检出时间，具有快速、经济等优点，具有广阔的应
用前景。
3.本发明中提供的检测方法与现有鼠伤寒沙门氏菌的检测方法相比，具有灵敏度高的
特点，其检测限可达到10cfu/mL。
附图说明
图1基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法的示意图
图2载色体的紫外吸收光谱图
图3不同浓度鼠伤寒沙门氏菌引起的荧光强度变化光谱图
图4相对荧光强度与鼠伤寒沙门氏菌浓度的线性关系图
具体实施方式
下面实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实施例1：鼠伤寒沙门氏菌标准检测曲线的建立
取300μL载色体-适配体复合物，随后加入100μL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌菌液，37℃
条件下孵育1h，然后4℃、15000r/min离心30min，弃上清液；然后加入30μL ATP合成缓冲液
(0.1mM Tricine,10％glycerol,5mM NaH2PO4,5mM MgCl2,ADP 0.35mM,NADH 2mM,pH 9.0)
37℃孵育30min，接着加入450μL PBS，混合均匀。最后取300μL样品，在F-7000的荧光模式
下，以496nm进行激发，记录515nm处的荧光强度。如图3所示，当体系中不存在目标菌种时，
捕获探针和荧光探针的适配体没有与目标物质结合，因此此时荧光强度最小，随着鼠伤寒
沙门氏菌浓度的增加，荧光信号强度逐渐增加。如图4所示，鼠伤寒沙门氏菌在1×101～1×
104cfu/mL浓度范围内，与515nm处相对荧光强度呈良好的线性关系，线性方程为y＝
1085.13x+363.98(R2＝0.9944)，最低检出限为10cfu/mL。
实施例2：牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测
取从本地超市购买牛奶10mL，12000r/min离心15min，然后用0.22μm滤膜以除去牛奶中
的蛋白质和脂肪，然后用Tris-HCl溶液将牛奶样品的pH值调为7.7，将处理过的牛奶样品分
成9份，每份样品的体积为900μL，再将100μL不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的培养物加到上述
牛奶样品中，使样品的总体积达到1mL。分别取100μL含有不同浓度的鼠伤寒沙门氏菌的样
品进行平板计数，另取100μL含有不同浓度的菌液的样品，采用本实验的方法进行检测，将
得到的检测结果与平板计数法所得到的结果进行比较。结果见表一。两种方法检测结果一
致，无明显差异。
表1牛奶样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测结果
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与
修饰，皆应属于本发明的涵盖范围。
序列表
〈110〉 江南大学
〈120〉 一种基于适配体-分子马达生物传感器检测鼠伤寒沙门氏菌的方法
〈130〉
〈160〉 1
〈170〉 PatentIn version 3.5
〈210〉 1
〈211〉 40
〈212〉 DNA
〈213〉 人工序列
〈400〉 1
agtaatgcccggtagttattcaaagatgagtaggaaaaga 40