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1、10申请公布号CN104138600A43申请公布日20141112CN104138600A21申请号201310164966422申请日20130507A61K47/42200601A61K48/00200601A61K49/00200601A61P25/2820060171申请人上海交通大学医学院地址200025上海市黄浦区重庆南路227号72发明人高小玲陈红专宋清香黄萌姚磊74专利代理机构上海翼胜专利商标事务所普通合伙31218代理人施春花翟羽54发明名称A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体及其制备方法和应用57摘要本发明公开了A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体及其制备方法和应用。A靶向的重组脂蛋。
2、白纳米药物载体由脂质、载脂蛋白和药物组成，所述药物是针对阿尔茨海默病的治疗或诊断药物，包括小分子化学治疗药物，大分子多肽、蛋白、基因治疗药物及诊断药物中的一种或者多种。本发明药物载体的构建解决了天然脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强等缺点，其应用为阿尔茨海默病诊疗药物递送提供新的更为有效和安全的解决方案，具有重要的研究价值和临床应用前景。51INTCL权利要求书1页说明书7页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书7页附图3页10申请公布号CN104138600ACN104138600A1/1页21一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体，其特征在于，所述A。
3、靶向的重组脂蛋白纳米药物载体由脂质、载脂蛋白和药物组成，所述药物是针对阿尔茨海默病的治疗或诊断药物，包括小分子化学治疗药物，大分子多肽、蛋白、基因治疗药物及诊断药物中的一种或者多种。2根据权利要求1所述的一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体，其特征在于，所述载脂蛋白包括APOE及其模拟肽、APOAI及其模拟肽、APOAII及其模拟肽、APOC及其模拟肽中的一种或多种。3根据权利要求2所述的一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体，其特征在于，所述载脂蛋白是APOE及其模拟肽中的一种或多种。4根据权利要求1所述的一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体，其特征在于，所述A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体的粒径范围。
4、为1500NM。5根据权利要求4所述的一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体，其特征在于，所述A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体的粒径范围为5200NM。6根据权利要求1所述的一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体，其特征在于，所述A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体采用注射途径给药或者鼻腔途径给药。7根据权利要求1所述的一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体，其特征在于，所述A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体分散在药剂学上可以接受的缓冲溶液环境中，所述缓冲溶液包括HEPES缓冲液、生理盐水、TRIS缓冲液和磷酸盐缓冲液。8权利要求17任一所述的A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体的制备方法，其特征在于，当药物是疏水性药物和。
5、/或两亲性药物时，脂质和疏水性药物和/或两亲性药物通过常规方法制备脂质体，得到的脂质体与载脂蛋白共同孵育，通过自组装形成重组脂蛋白纳米药物载体；当药物是亲水性药物时，脂质通过常规方法制备脂质体，亲水性药物可以在自组装前、中或后加入。9权利要求8所述的A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体的制备方法，其特征在于，药物质量占处方含量000150，脂质质量占处方含量的2095，载脂蛋白质量占处方含量的580。10权利要求17任一所述的A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体在制备A靶向药物中的应用。权利要求书CN104138600A1/7页3A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体及其制备方法和应用技术领域0001本发明涉及化。
6、学制药领域，尤其涉及A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体及其制备方法和应用。背景技术0002阿尔茨海默病ALZHEIMERSDISEASE,AD是最常见神经退行性疾病，其发病率随年龄增高，65岁以上人群发病率为710，85岁以上人群高达47。AD已成为继心脑血管疾病、恶性肿瘤之后威胁老年人健康的第三大疾病。随着人口老龄化进程的加剧，该类疾病的发病率日益上升。据统计，目前全球有AD患者3560万，我国600万，随着人口的老龄化，预计到21世纪中叶全球AD患者将达115亿。AD已成为人类健康和生存质量的严重威胁，是日益严重的公共卫生问题。0003AD的主要病理特征为细胞外淀粉样蛋白（AMYLOIDPEP。
7、TIDE,A）大量沉积形成的老年斑（SENILEPLAQUES,SP）及细胞内神经纤维缠结（NEUROFIBRILLARYTANGLES,NFT）的形成。当前的研究明确A是AD的核心致病物质，其中A寡聚体的神经毒性最强。A在脑内过度产生和沉积，引起其周边神经元突触功能障碍、TAU蛋白过度磷酸化、氧化应激和继发炎性反应，导致神经元变性死亡，最终产生痴呆。这就是目前最受公认的AD病因假说A级联假说（AMYLOIDCASCADEHYPOTHESIS）。因此，A已成为AD药物干预的重要分子靶点。0004目前AD药物干预仍面临重大瓶颈血脑屏障（BLOODBRAINBARRIER,BBB）的存在使得98以。
8、上具有潜在治疗作用的化合物因难以进入中枢而遭到淘汰，因此如何克服BBB的屏障作用，成功将药物递送入脑是实施AD治疗的首要条件；AD作为一种进行性神经退行性疾病，有效干预需长期重复给药，而鉴于脑功能的复杂性和神经元对损伤的敏感性，干预药物及其载体的安全性和靶向性至关重要。由于A聚集体特别是寡聚体介导的级联反应是AD的核心病因，将药物特异地递送到脑内A聚集部位是提高疗效、减少中枢副作用的关键。针对上述难点问题，一些研究者设计了具有A靶向特性的纳米药物载体，代表性载体有A142抗体修饰脂质体【THEBINDINGAFFINITYOFANTIABETA142MABDECORATEDNANOLIPOSO。
9、MESTOABETA142PEPTIDESINVITROANDTOAMYLOIDDEPOSITSINPOSTMORTEMTISSUEJBIOMATERIALS,2011,322354895497】、A142修饰的超顺磁氧化铁颗粒【DETECTIONOFAMYLOIDPLAQUESTARGETEDBYUSPIOABETA142INALZHEIMERSDISEASETRANSGENICMICEUSINGMAGNETICRESONANCEMICROIMAGINGJNEUROIMAGE,2011,55416001609】和姜黄素修饰的脂质体【CURCUMINDECORATEDNANOLIPOSOMES。
10、WITHVERYHIGHAFFINITYFORAMYLOIDBETA142PEPTIDEJBIOMATERIALS,2011,32616351645】等。然而，这些载体都无法通过BBB，须脑室内注射或借助颈动脉灌注甘露醇等侵入性手段入脑；而最具代表性的可跨越BBB的纳米药物载体如转铁蛋白受体单克隆抗体OX26连接的空间稳定脂质体【BRAINDRUGDELIVERYOFSMALLMOLECULESUSINGIMMUNOLIPOSOMESPROCNATL说明书CN104138600A2/7页4ACADSCIUSA1996,93241416414169】、纳米粒、囊泡【PREPARATIONANDB。
11、RAINDELIVERYPROPERTYOFBIODEGRADABLEPOLYMERSOMESCONJUGATEDWITHOX26JCONTROLRELEASE2008,1282120127】等均不具备A靶向特性。因此，发展能够实现脑内A靶向的智能化纳米药物载体对AD的有效药物干预具有至关重要的作用。0005脂蛋白是一种天然纳米载体（粒径从51000NM），其根据密度、结构和功能分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白、中间密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白，在体内起转运脂类物质的作用。基于仿生学原理设计的重组脂蛋白纳米载药系统在克服天然脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强等缺点的同时，较其他纳米。
12、载体具有明显的优势模拟内源性纳米颗粒，可避免单核巨噬系统的识别和清除，具有较长的体内循环时间；生物相容好，可完全被机体代谢利用且无免疫原性；含疏水内核、亲水外壳，结构可调，可实现亲/疏水性和两亲性药物多模式载带；更为重要的是，通过调整脂质成分、载脂蛋白的种类、比例和载带药物等因素，所构建载体的理化特性如粒径、形状、载药量、释药行为，乃至体内靶向递药特性可根据治疗需要进行主观调控，具有很强的灵活性。以APOAI及其模拟肽为载脂蛋白成分的重组脂蛋白已被用于肝脏【中国发明专利，申请号2012102041666】、肿瘤【中国发明专利，申请号2012101101871】、动脉粥样硬化【中国发明专利，申请。
13、号2011101028778】等部位的靶向药物递送。但尚未见将重组脂蛋白纳米药物传递系统用于靶向脑内A的药物递送研究。发明内容0006本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体。0007本发明所要解决的第二个技术问题时，提供A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体的制备方法。0008本发明所要解决的第三个技术问题时，提供A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体的应用。0009为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体，其特征在于，所述A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体由脂质、载脂蛋白和药物组成，所述药物是针对阿尔茨海默病的治疗或诊断药物，包括小分子化学治疗。
14、药物，大分子多肽、蛋白、基因治疗药物及诊断药物中的一种或者多种。0010作为一个优选方案，所述载脂蛋白包括APOE及其模拟肽、APOAI及其模拟肽、APOAII及其模拟肽、APOC及其模拟肽中的一种或多种。所述载脂蛋白优选APOE及其模拟肽中的一种或多种。0011作为一个优选方案，所述A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体的粒径范围为1500NM，优选为5200NM。0012作为一个优选方案，所述A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体采用注射途径给药或者鼻腔途径给药。0013作为一个优选方案，所述A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体分散在药剂学上可以接受的缓冲溶液环境中，所述缓冲溶液包括HEPES缓冲液、生理盐水、。
15、TRIS缓冲液和磷酸盐缓冲液。说明书CN104138600A3/7页50014为了解决本发明的第二个技术问题，本发明提供A靶向的重组脂蛋白纳米药物载体的制备方法，其特征在于，当药物是疏水性药物和/或两亲性药物时，脂质和疏水性药物和/或两亲性药物通过常规方法制备脂质体，得到的脂质体与载脂蛋白共同孵育，通过自组装形成重组脂蛋白纳米药物载体；当药物是亲水性药物时，脂质通过常规方法制备脂质体，亲水性药物可以在自组装前、中或后加入。0015作为一个优选方案，药物质量占处方含量000150，脂质质量占处方含量的2095，载脂蛋白质量占处方含量的580。0016为了解决本发明的第三个技术问题，本发明提供了A。
16、靶向的重组脂蛋白纳米药物载体在制备A靶向药物中的应用。0017本发明所述的脂质可以是天然磷脂（蛋磷脂、豆磷脂）、合成磷脂（磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、磷脂酸、心磷脂、溶血磷脂）、鞘脂（鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂、神经节苷脂）、胆固醇、胆固醇酯、甘油酯及其衍生物中的一种或多种。0018所述的脂质体的制备方法采用薄膜水化法、注入法、复乳法、熔融法、冷冻干燥法、逆向蒸发法、高压乳匀法或超声法及CA2融合法。0019本发明的特点是模拟天然脂蛋白，构建重组脂蛋白纳米药物传递系统，借助载脂蛋白与脑毛细血管上的清道夫BI受体、低密度脂蛋白受体（LDLR）和低密度脂蛋。
17、白受体相关蛋白1（LRP1）等结合，通过受体介导途径转运入脑，并通过载脂蛋白对A的特异识别和结合，实现脑内A靶向药物递送。0020本发明的优点在于，可通过受体介导的胞吞转运途径入脑；可特异识别和结合A，将药物靶向递送至脑内A聚集部位；结构和粒径的高度可调性，可载带不同药物；高度仿生，安全性好。本发明药物载体的构建解决了天然脂蛋白来源稀缺、制备繁琐、质量可控性不强等缺点，其应用为AD诊疗药物递送提供新的更为有效和安全的解决方案，具有重要的研究价值和临床应用前景。附图说明0021图1为APOE蛋白对脑毛细血管内皮细胞BEND3细胞和前列腺内皮细胞YPEN细胞摄取重组脂蛋白的影响，APOE抑制组先加。
18、入APOE抑制1H后，各组均加入等浓度重组脂蛋白孵育3H，P0001表明与未加APOE的BEND3细胞组存在显著性差异。0022图2为A125I重组脂蛋白静脉注射10,30MIN,1,2,4,8,12,24H后不同脑区的放射活性强度；B125I重组脂蛋白静脉注射1,2,4,24H后脑实质、脑血管的放射活性强度百分比。0023图3为透射电镜观察重组脂蛋白与A寡聚体的相互作用，A重组脂蛋白；BA寡聚体；CA寡聚体02M与重组脂蛋白含磷脂酰胆碱DMPC20G/ML室温孵育24H，2（W/V）磷钨酸负染，透射电镜观察。箭头A寡聚体特异结合在重组脂蛋白两侧，标尺20NM0024图4为表面等离子共振（SP。
19、R）检测重组脂蛋白与AA单体、BA寡聚体的相互作用。0025图5为载倒捻子素的重组脂蛋白A促进AD模型动物SAMP8小鼠的脑内A说明书CN104138600A4/7页6清除，B减少小胶质细胞激活（CD45阳性染色）。具体实施方式0026下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如SAMBROOK等人，分子克隆实验室手册（NEWYORKCOLDSPRINGHARB。
20、ORLABORATORYPRESS，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。0027实施例1重组脂蛋白的表征和脑血管内皮细胞摄取00281制备0029脂质（磷脂酰胆碱DMPC/DOPC/DPPC/神经节苷脂GM1/胆固醇/胆固醇油酸酯）（210MG）、药物倒捻子素（012MG）溶于一定比例氯仿甲醇混合溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加1MLTRIS缓冲液（含10MMTRIS，01MKCL，1MMEDTA，PH80脱气）水化，50C水浴超声15H。加不同PH和盐组成的缓冲液稀释至8ML，40C水浴超声。APOE3（055MG）保存于含6M盐酸胍和5L/MG蛋白巯基乙醇的100M。
21、M碳酸氢铵溶液中（PH80）。用前以合适的蛋白组装缓冲液透析。10MIN内加入，继续超声50MIN。产品冷却至室温，4C过夜。022M膜滤过，超滤浓缩（截留分子量10KDA）。SUPERDEX200凝胶柱纯化。4C保存备用。00302表征0031重组脂蛋白磷钨酸负染，透射电镜观察形态。激光粒度仪测定其粒径和表面电位。重组脂蛋白成分分析荧光分光光度计测定包载荧光探针量；HPLC测定包载药量；磷脂试剂盒（PHOSPHOLIPIDSCASSAYKIT）测定磷脂含量；BRADFORD法测定蛋白含量，计算APOE3组装效率。00323脑血管内皮细胞模型BEND3细胞结合和摄取重组脂蛋白情况0033高内涵。
22、分析定量检测重组脂蛋白的细胞结合BEND3细胞密度5000/孔接种于96孔板，培养24H。吸弃原有培液，加入100L载荧光探针的重组脂蛋白溶液，37C孵育。吸弃培液，加100L预热至37C的37甲醛溶液室温固定10MIN。加100LPBS洗3次，50LHOECHEST33432室温避光孵育10MIN染细胞核；200LPBS洗3次。置KINETICSCAN全自动高内涵药物筛选分析系统下检测。蓝色荧光通道检测细胞核，进行细胞计数；绿色或红色荧光通道检测重组脂蛋白。每组3复孔，每孔检测至少1000个细胞。0034结果如图1所示，在低密度脂蛋白受体家族高表达的脑毛细血管内皮细胞系BEND3，重组脂蛋白。
23、的细胞摄取显著高于不加载脂蛋白的对照脂质体LNC。在APOE共同孵育情况下，重组脂蛋白的细胞摄取急剧下降，提示BEND3通过APOE介导的机制摄取重组脂蛋白。而在低密度脂蛋白受体家族低表达的内皮细胞YPEN，重组脂蛋白的细胞摄取明显降低而不受APOE影响，表明低密度脂蛋白受体家族参与介导重组脂蛋白的细胞摄取。0035实施例2重组脂蛋白的脑内递送特性00361制备0037称取豆磷脂、蛋磷脂210MG、神经节苷脂GM1015MG放入500ML圆底烧说明书CN104138600A5/7页7瓶中，加入2ML氯仿溶解，置于旋转蒸发仪20，避光真空1H。在圆底烧瓶中加入2MLPBS溶液，37震摇至瓶内壁脂。
24、质膜全部水化脱落，放入40水浴超声1H，加入APOE或APOAI0110MG，37孵育36H，4保存。00382放射标记定量测定重组脂蛋白静注后在体内各组织和不同脑区的分布情况0039125I标记重组脂蛋白。昆明种小鼠24只，随机分8组，静脉注射给予125I重组脂蛋白，分别于给药后10,30MIN,1,2,4,8,12,24H后处死动物，取全血、脑（左侧半脑，分出皮层、海马、纹状体等不同脑区）、心、肝、脾、肺、肾，组织称重、放射性计数测定；加3倍量水匀浆，加同体积10三氯乙酸沉淀蛋白，取沉淀测定放射性计数，计算125I重组脂蛋白入脑的ID/G。取右侧脑组织，加等渗HEPES缓冲液，置玻璃匀浆器。
25、匀浆10次，加右旋糖酐溶液（26,70KD）调节比重，匀浆3次，5400G，4离心15MIN，分离脑血管和脑实质，分别测定放射性计数，计算125I重组脂蛋白进入脑实质的百分比。结果显示，给药1H后，各脑区均有约021DOSE/G的APOE重组脂蛋白入脑（图2），该入脑量优于公认具有良好脑部递药特性的转铁蛋白受体单克隆抗体OX26修饰的免疫脂质体003DOSE/G和乳铁蛋白0016DOSE/G；另一侧脑组织用于脑毛细血管扣除实验，结果显示80以上125I重组脂蛋白放射性强度进入脑实质，而且随着给药时间延长，测得脑实质中125I重组脂蛋白放射性强度百分比升高（图2），提示125I重组脂蛋白被有效递。
26、送入脑。0040实施例3重组脂蛋白与A140寡聚体的结合位点00411制备0042称取磷脂酰胆碱、磷脂酸210MG放入500ML圆底烧瓶中，加入2ML氯仿溶解，置于旋转蒸发仪20，避光真空1H。在圆底烧瓶中加入2MLPBS溶液，37震摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，放入40水浴超声1H，加入APOE或APOAI0110MG，37孵育36H，4保存。00432透射电镜观察重组脂蛋白与A140寡聚体的结合位点004420G/ML重组脂蛋白与200NMA140寡聚体在37恒温箱孵育24H，离心浓缩至800G/ML重组脂蛋白，同时分别以等浓度重组脂蛋白、A140寡聚体为对照，2磷钨酸染色，透射电镜观察。。
27、如图3结果所示，A140寡聚体与碟形重组脂蛋白共同孵育24H后，A140寡聚体结合于重组脂蛋白侧边的载脂蛋白区域，表明重组脂蛋白上的载脂蛋白是A140寡聚体特异结合的部位。0045实施例4重组脂蛋白的A靶向结合亲和力00461制备0047称取2MGDMPC放入500ML圆底烧瓶中，加2ML乙醚挥干，再加入2ML乙醚挥干，以除去磷脂中的水分，加入2ML氯仿，加入20L1MG/MLDII氯仿溶液，混匀，置于旋转蒸发仪20，避光真空1H。在圆底烧瓶中加入2MLPBS溶液，37震摇至瓶内壁脂质膜全部水化脱落，放入40水浴超声1H，探头超声减小粒径。加入适量02MG/MLAPOE/APOAI蛋白PBS溶。
28、液，3750RPM孵育36H，4保存。00482表面等离子共振SURFACEPLASMONRESONANCE,SPR实验验证重组脂蛋白的A靶向结合特性0049CM5芯片采用氨基偶联的方式将A单体或者寡聚体固定在用02MEDC和005MNHS对芯片表面进行活化后，将A单体或者寡聚体稀释于PH40醋酸钠缓冲溶液中，使说明书CN104138600A6/7页8A浓度为23M，以30L/MIN的速度注入420S，再用PH85的乙醇胺进行封闭。参比通道活化后直接用乙醇胺封闭。亲和力测试采用双通道模式检测重组脂蛋白稀释于PH7410MMPBS中，以30L/MIN的速度注入到参比通道以及固定了A的通道。接触时。
29、间为100S或300S，解离时间为400S。结果用BIACORET200EVALUATIONSOFTEWARE程序进行分析，运用11结合模型计算亲和力值。结果显示，重组脂蛋白与A单体（MONOMER）、寡聚体（OLIGOMER）均呈高亲和力结合（图4），动态法计算其与A单体、寡聚体的亲和力常数KD值，分别为365NM和265NM（与抗原、抗体亲和力同一数量级），与天然HDL与A的亲和力（57NM）相似，表明重组脂蛋白可望具有良好的A靶向特性。0050实施例5载小分子药物重组脂蛋白对AD模型动物的疾病修饰作用00511制备0052脂质（DMPC/DMPE/GM1/胆固醇/胆固醇油酸酯）（210M。
30、G）、药物倒捻子素（M）（012MG）/姜黄素（012MG）溶于一定比例氯仿甲醇混合溶剂中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加1MLTRIS缓冲液（含10MMTRIS，01MKCL，1MMEDTA，PH80脱气）水化，50C水浴超声15H。取1MLAPOE3（055MG/ML）10MIN内加入，继续超声50MIN。产品冷却至室温，4C过夜。00532载药重组脂蛋白对AD模型动物的疾病修饰作用0054将10月龄AD模型小鼠SAMP8小鼠分为生理盐水组，空白重组脂蛋白组，载M重组脂蛋白制剂组（05MG/KG；2MG/KG），M溶液组（05MG/KG；2MG/KG），共六组。SAMR小鼠作为正常对照，。
31、给予生理盐水。尾静脉注射给药，连续给药2周。给药结束后，小鼠水合氯醛麻醉，生理盐水、4多聚甲醛依次心脏灌流。断头，取出完整大脑，4多聚甲醛溶液继续固定，浸蜡，包埋，切片，厚度4M，避光保存。石蜡切片免疫组化染色，脑内A聚集体免疫组化（一抗6E10），小胶质细胞激活（一抗ANTICD45）。DAB染色，苏木素复染，中性树胶封片观察并计数不同处理组动物大脑皮层、海马的A沉积和小胶质细胞激活情况。0055结果如图5所示，10月龄SAMP8小鼠连续15天尾静脉给予M重组脂蛋白（05MG/ML和2MG/ML），脑内A沉积和小胶质细胞激活情况明显少于生理盐水组，也明显少于2MG/KGM溶液组，空白重组脂蛋。
32、白的脑内A沉积和小胶质细胞激活情况也有所改善。结果表明，重组脂蛋白本身具有一定的AD疾病修饰作用，同时能有效提多酚类药物对AD的疾病修饰作用。0056实施例6载SIRNA/MICRORNA的重组脂蛋白鼻腔给药对AD模型动物的疾病修饰作用00571制备0058脂质（DOTAP/DOPE）（210MG）溶于一定比例氯仿溶液中，减压旋转蒸发除去有机溶剂，脂膜加含SIRNA/MICRORNA1500G的TRIS缓冲液水化，均质减小粒径。取1MLAPOE3/APOAI模拟肽（055MG/ML）10MIN内加入，超声50MIN，继续孵育24H，4C保存。00592载SIRNA/MICRORNA的重组脂蛋白。
33、鼻腔给药对AD模型动物的疾病修饰作用0060将7月龄AD模型小鼠APP/PS1转基因小鼠分为生理盐水组，空白重组脂蛋白组，载BACESIRNA/MICRORNA制剂组，BACESIRNA/MICRORNA溶液剂组。野生型B6小鼠作为正常对照，给予生理盐水。鼻腔给药4周。给药结束后，小鼠水合氯醛麻醉，生理盐水、4多聚甲醛依次心脏灌流。断头，取出完整大脑，4多聚甲醛溶液继续固定，浸蜡，包埋，切片，厚度说明书CN104138600A7/7页94M，避光保存。石蜡切片免疫组化染色，脑内A聚集体免疫组化（一抗6E10），小胶质细胞激活（一抗ANTICD45）。DAB染色，苏木素复染，中性树胶封片观察并计。
34、数不同处理组动物大脑皮层、海马的A沉积和小胶质细胞激活情况。结果显示，7月龄APP/PS1转基因小鼠连续4周鼻腔给予载SIRNA/MICRORNA的重组脂蛋白，脑内A沉积和小胶质细胞激活情况明显少于生理盐水组，也明显少于SIRNA/MICRORNA溶液组。0061以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。说明书CN104138600A1/3页10图1图2说明书附图CN104138600A102/3页11图3图4说明书附图CN104138600A113/3页12图5说明书附图CN104138600A12。