中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法技术领域
本发明涉及生化技术领域，特别涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检
测试剂盒的制备方法。
背景技术
人类中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-
associatedlipocalin，NGAL)分子量约25kDa，共价结合于中性粒细胞明胶酶。NGAL生理状
态下是一种生长因子，主要参与了早期肾脏上皮的发生、生长。在正常组织包括肾脏，肺，胃
及结肠的上皮组织中表达量较低。肾脏缺血再灌注损伤后，近曲小管上皮大量表达NGAL，是
近来发现的早期诊断AKI的敏感的生物学标志物。尿NGAL是肾脏缺血再灌注损伤的一个敏
感的指标，同时其表达量与肾脏缺血时间相关。
急性肾功能损伤过程中NGAL水平偏高，预后将发展成为急性肾功能衰竭。NGAL水
平偏高通常出以下情况：心血管手术患者、病危人员、脓血性或出血性休克、肾移植、静脉X
射线造影剂的反应和肾毒性治疗反映。50％以上的病人都会出现一定程度的急性肾功能衰
竭，通常大病后期出现使得死亡率大大增加。
目前在临床上使用的NGAL检测方法有酶免疫法(ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、
乳胶增强透射免疫比浊法、普通透射比浊法等，但是ELISA和RIA检测法存在操作繁琐，标本
需要预处理，检测时间长的缺点；普通透射比浊法存在灵敏度不够的缺点；而乳胶增强透射
免疫比浊法通常存在试剂沉淀导致稳定性不好的缺点，从而导致检测灵敏度不够的问题。
综上所述，提供一种试剂稳定性好的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试
剂盒是我们目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的
制备方法，使得检测试剂的稳定性更好，从而增强了检测试剂的检测灵敏度。
为解决上述技术问题，本发明的实施方式提供了一种中性粒细胞明胶酶相关脂质
运载蛋白检测试剂盒的制备方法，该制备方法包含以下步骤：中空聚苯乙烯微球的活化：向
中空聚苯乙烯微球中加入第一缓冲液进行稀释后，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，搅拌、混合
均匀，在搅拌的过程中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，继续搅拌、
洗涤后，溶解到第一缓冲液中，即得活化的中空聚苯乙烯微球溶液；抗体的偶联：向活化的
中空聚苯乙烯微球溶液中加入中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体溶液，震荡反应
后，即得第一混合液；微球的封闭：向第一混合液中加入牛血清白蛋白，震荡反应，即得第二
混合液；洗涤、溶解：将第二混合液经过离心、超声洗涤后溶解到第二缓冲液中，即得中性粒
细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒。
本发明实施方式相对于现有技术而言，通过在中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋
白(NGAL)试剂中使用中空聚苯乙烯微球，即通过在纳米SiO2内核上合成聚苯乙烯微球，再
通过氢氟酸去除纳米SiO2内核，从而形成了中空的聚苯乙烯微球，降低了聚苯乙烯微球的
密度，从而能够使微球更好的悬浮在溶液中，提高了试剂的稳定性，从而增强了检测试剂的
检测灵敏度。有利于中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)试剂的大批量稳定生产，
具有重要的实际应用价值。
另外，中空聚苯乙烯微球制备方法包含以下步骤：将硫酸锰和三氯化铁混合加入
溶液中，搅拌均匀，加入氢氧化钠，调整温度反应1～2h得到铁酸锰；加入油酸，反应2～3h，
得到油酸修饰的铁酸锰；
取二氧化硅、十二烷基硫酸钠、苯乙烯、过硫酸钾溶于去离子水中，搅拌均匀；加入
油酸修饰的铁酸锰，调整温度，反应1～3h后加入丙稀酸，继续搅拌3～7h；然后加入氢氟酸，
维持搅拌1～3h，即得中空聚苯乙烯微球，通过在纳米SiO2内核上合成聚苯乙烯微球，再通
过氢氟酸去除纳米SiO2内核，从而形成了中空的聚苯乙烯微球，降低了聚苯乙烯微球的密
度，从而能够使微球更好的悬浮在溶液中。
另外，中空聚苯乙烯微球制备方法包含以下步骤：将硫酸锰和三氯化铁混合加入
溶液中，搅拌均匀，加入氢氧化钠，调整温度反应1～2h得到铁酸锰；加入油酸，反应2～3h，
得到油酸修饰的铁酸锰；
取二氧化硅、十二烷基硫酸钠、苯乙烯、过硫酸钾溶于去离子水中，搅拌均匀；加入
油酸修饰的铁酸锰，调整温度，加入氢氟酸，维持搅拌1～3h，再加入丙稀酸，继续搅拌3～
7h；即得中空聚苯乙烯微球，通过在纳米SiO2内核上合成聚苯乙烯微球，再通过氢氟酸去除
纳米SiO2内核，从而形成了中空的聚苯乙烯微球，降低了聚苯乙烯微球的密度，从而能够使
微球更好的悬浮在溶液中。
另外，二氧化硅的质量浓度为0.25～0.1g/ml，二氧化硅的粒径为30～80nm。这样
可以使最终形成的空心微球的直径在30～80nm，中空聚苯乙烯微球的密度在1.01～1.03g/
cm3，从而能够保证微球能够更好的悬浮在水中，提高了试剂的稳定性。
另外，十二烷基硫酸钠的质量浓度为1～20mg/ml。这样使得合成的聚苯乙烯层厚
度在30～100nm内，从而保证试剂能够满足产品技术要求中线性和灵敏度的指标。
另外，苯乙烯与去离子水的体积比为1:5。这样可以保证苯乙烯的利用率最高，使
95％以上的苯乙烯转化为聚苯乙烯。
另外，中空聚苯乙烯微球包括空心聚苯乙烯微球、铁锰层以及油酸层，铁锰层通过
油酸层将铁锰层均匀的包被在空心聚苯乙烯微球的外侧，其中，空心聚苯乙烯微球的空心
部分直径为30nm～80nm，空心聚苯乙烯微球形成的聚苯乙烯层的厚度为30nm～100nm，铁锰
层的厚度为20nm～50nm，油酸层的厚度为2nm～10nm，通过合成出由油酸修饰的铁酸锰包覆
的中空聚苯乙烯微球，铁酸锰不仅具备与四氧化三铁一样很高的超顺磁性、便于分离的优
点，而且具有成本更低，所合成的包覆外层能够更好的控制形貌和尺寸的优点；并且所合成
的磁性中空聚苯乙烯微球能够更好的控制尺寸，使得中空聚苯乙烯微球更适用于体外诊断
试剂中。
另外，第一缓冲液为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，第一缓冲液的浓度为25～
100mM，pH为5.5～6.5。这是第一缓冲液优选的最佳离子强度和pH，使得抗体能够更多的包
覆到中空聚苯乙烯微球上，从而达到较高的检测效果。
另外，N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度为10～200mg/mL；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙
基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为5～80mg/mL。这样能够更好的活化微球，提高抗体交联到
中空聚苯乙烯微球上的效率。
另外，第二缓冲溶液为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，第二缓冲溶液的浓度为25～100mM。
使缓冲溶液具有合适的pH，使得中空聚苯乙烯微球能够稳定地溶解在缓冲液中。
附图说明
图1是根据本发明第一实施方式中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试
剂盒的制备流程图；
图2是根据本发明第五实施方式中的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试
剂盒的线性偏差检测曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实
施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，
为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基
于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。
本发明的第一实施方式涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂
盒的制备方法，该制备方法包含以下步骤：中空聚苯乙烯微球的活化：向中空聚苯乙烯微球
中加入第一缓冲液进行稀释后，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，搅拌、混合均匀，在搅拌的过
程中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，继续搅拌、洗涤后，溶解到第
一缓冲液中，即得活化的中空聚苯乙烯微球溶液；抗体的偶联：向活化的中空聚苯乙烯微球
溶液中加入中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体溶液，震荡反应后，即得第一混合液；
微球的封闭：向第一混合液中加入牛血清白蛋白，震荡反应，即得第二混合液；洗涤、溶解：
将第二混合液经过离心、超声洗涤后溶解到第二缓冲液中，即得中性粒细胞明胶酶相关脂
质运载蛋白检测试剂盒。
具体地，在本实施方式中，中空聚苯乙烯微球制备方法可以包含以下步骤：将硫酸
锰和三氯化铁混合加入溶液中，搅拌均匀，加入氢氧化钠，调整温度反应1～2h得到铁酸锰；
加入油酸，反应2～3h，得到油酸修饰的铁酸锰；取二氧化硅、十二烷基硫酸钠、苯乙烯、过硫
酸钾溶于去离子水中，搅拌均匀；加入油酸修饰的铁酸锰，调整温度，反应1～3h后加入丙稀
酸，继续搅拌3～7h；然后加入氢氟酸，维持搅拌1～3h，即得中空聚苯乙烯微球。但是，本实
施方式不应以此为限，下述方式也可以制备得到中空聚苯乙烯微球：将硫酸锰和三氯化铁
混合加入溶液中，搅拌均匀，加入氢氧化钠，调整温度反应1～2h得到铁酸锰；加入油酸，反
应2～3h，得到油酸修饰的铁酸锰；取二氧化硅、十二烷基硫酸钠、苯乙烯、过硫酸钾溶于去
离子水中，搅拌均匀；加入油酸修饰的铁酸锰，调整温度，加入氢氟酸，维持搅拌1～3h，再加
入丙稀酸，继续搅拌3～7h；即得中空聚苯乙烯微球。
进一步地，上述制备得到的中空聚苯乙烯微球的结构可以包括空心聚苯乙烯微
球、铁锰层以及油酸层，铁锰层通过油酸层将铁锰层均匀的包被在空心聚苯乙烯微球的外
侧，其中，空心聚苯乙烯微球的空心部分直径为30nm～80nm，空心聚苯乙烯微球形成的聚苯
乙烯层的厚度为30nm～100nm，铁锰层的厚度为20nm～50nm，油酸层的厚度为2nm～10nm。中
空聚苯乙烯微球也可以通过其他方式制备获取也可以直接从市面直接购买获得。本领域技
术人员可以根据需要灵活选择中空聚苯乙烯微球制备方法或者中空聚苯乙烯微球的具体
结构。
值得说明的是，在本实施方式中，第一缓冲液可以为2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，
第一缓冲液的浓度可以为25～100mM，pH可以为5.5～6.5。
N-羟基琥珀酰亚胺溶液的浓度可以为10～200mg/mL；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙
基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度可以为5～80mg/mL。
第二缓冲溶液可以为4-羟乙基哌嗪乙磺酸，第二缓冲溶液的浓度可以为25～
100mM。
通过上述内容，不难发现，在本实施方式中，具体制备中性粒细胞明胶酶相关脂质
运载蛋白检测试剂盒的方法如下：
⑴中空聚苯乙烯微球的制备：取1.69g硫酸锰和5.4g三氯化铁分别加入50ml溶液
中，取1.2g氢氧化钠配制成10ml溶液，加入到混合溶液中，调节反应温度至70℃，反应1h，得
到铁酸锰层厚度尺寸为36nm。加入2ml油酸，继续搅拌2h，得到油酸性铁酸锰尺寸为39nm，其
中油酸层厚度2nm。
取1g 30nm二氧化硅(SiO2)、40mg十二烷基硫酸钠、10ml苯乙烯、10mg过硫酸钾溶
于40ml去离子水中，搅拌均匀。得到聚苯乙烯层厚度为78nm的聚苯乙烯微球；加入1g上述油
溶性铁酸锰，设定反应体系温度60℃，反应2h后加入0.8ml丙稀酸，继续搅拌5h，得到磁性聚
苯乙烯微球。然后加入40％浓度的氢氟酸3ml，维持搅拌2h，即得中空聚苯乙烯微球。
值得注意的是，设定反应温度后，也可以将加入丙稀酸、氢氟酸的顺序调换下，即
先加入氢氟酸，维持搅拌3h，再加入丙稀酸，继续搅拌7h；也可以得到中空聚苯乙烯微球。
上述步骤合成得到了由油酸修饰的铁酸锰包覆的中空聚苯乙烯微球，铁酸锰不仅
具备与四氧化三铁一样很高的超顺磁性、便于分离的同时，而且具有成本更低，所合成的包
覆外层能够更好的控制形貌和尺寸的优点；并且所合成的磁性中空微球能够更好的控制尺
寸，适用于体外诊断试剂中。
⑵聚苯乙烯微球的活化：取0.2ml中空聚苯乙烯微球用2ml 25mM MES(pH6.5)缓冲
液稀释，加入40mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，混合均匀，然后搅拌中加入20mg 1-(3-二
甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，室温下搅拌反应，洗涤后溶解到2ml 25mM
MES(pH 6.5)缓冲液中。
⑶抗体的偶联：向第一步活化洗涤过的微球溶液中加入1mg自制中性细胞明胶酶
相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体溶液，在室温下震荡反应1h。
⑷微球的封闭：向混合液中加入20mg牛血清白蛋白，室温震荡封闭1h。
⑸洗涤、溶解：将反应结束的混合物在16000rpm下离心10min、超声5min洗涤2次，
最后溶解到50mM HEPES，0.5％BSA，0.05％NaN3缓冲液中。
在现有技术中，中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒的制备方法中也
会加入聚苯乙烯微球及其合成的高分子微球，该聚苯乙烯微球及其合成的高分子微球是指
通过一种聚合方法或将现有的聚合物经过物理或化学方法改性而得到的球形聚合物，粒径
一般在几纳米到几百微米之间不等。由于其密度接近于水，能够很好的悬浮在水中，因而通
常作为体外诊断试剂的原料。然而当聚苯乙烯微球的粒径不断增大时，其在溶液中受到的
重力也会不断的增大，经常会导致试剂的沉淀，进而影响试剂的稳定性以及检测的灵敏度。
为了解决这个问题，本发明中的实施方式通过在中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白
(NGAL)试剂中使用中空聚苯乙烯微球，即通过在纳米SiO2内核上合成聚苯乙烯微球，再通
过氢氟酸去除纳米SiO2内核，从而形成了中空的聚苯乙烯微球，降低了聚苯乙烯微球的密
度，从而能够使微球更好的悬浮在溶液中，提高了试剂的稳定性。从而大大促进了中性粒细
胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)试剂的大批量稳定生产，具有重要的实际应用价值。
本发明的第二实施方式涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂
盒的制备方法，该制备方法包含以下步骤：
⑴中空聚苯乙烯微球的制备：
取1.69g硫酸锰和5.4g三氯化铁分别加入50ml溶液中，取1.5g氢氧化钠配制成
10ml溶液，加入到混合溶液中，调节反应温度至70℃，反应2h，得到铁酸锰层厚度尺寸为
31nm。加入2ml油酸，继续搅拌3h，得到油酸性铁酸锰尺寸为35nm，其中油酸层厚度4nm。
取1g 62nm二氧化硅(SiO2)、60mg十二烷基硫酸钠、10ml苯乙烯、10mg过硫酸钾溶
于40ml去离子水中，搅拌均匀。得到聚苯乙烯层厚度为56nm的聚苯乙烯微球，设定反应体系
温度60℃，反应3h后加入0.8ml丙稀酸，继续搅拌7h，得到磁性聚苯乙烯微球。然后加入40％
浓度的氢氟酸3ml，维持搅拌3h，即得中空聚苯乙烯微球。
⑵聚苯乙烯微球的活化：取0.4ml中空聚苯乙烯微球用2ml 25mM MES(pH 6.5)缓
冲液稀释，加入40mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，混合均匀，然后搅拌中加入30mg 1-(3-
二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，室温下搅拌反应，洗涤后溶解到2ml
25mM MES(pH 6.5)缓冲液中。
⑶抗体的偶联：向第一步活化洗涤过的微球溶液中加入0.8mg自制中性粒细胞明
胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体溶液，在室温下震荡反应1h。
⑷微球的封闭：向混合液中加入20mg牛血清白蛋白，室温震荡封闭1h。
⑸洗涤、溶解：将反应结束的混合物在16000rpm下离心10min、超声5min洗涤2次，
最后溶解到50mM HEPES，0.5％BSA，0.05％NaN3缓冲液中。
本发明的第三实施方式涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂
盒的制备方法，该制备方法包含以下步骤：
⑴中空聚苯乙烯微球的制备：
取1.69g硫酸锰和5.4g三氯化铁分别加入50ml溶液中，取1.2g氢氧化钠配制成8ml
溶液，加入到混合溶液中，调节反应温度至70℃，反应1.5h，得到铁酸锰层厚度尺寸为42nm。
加入2ml油酸，继续搅拌2.5h，得到油酸性铁酸锰尺寸为48nm，其中油酸层厚度6nm。
取1g 35nm二氧化硅(SiO2)、40mg十二烷基硫酸钠、10ml苯乙烯、6mg过硫酸钾溶于
40ml去离子水中，搅拌均匀。得到聚苯乙烯层厚度为85nm的聚苯乙烯微球，设定反应体系温
度60℃，反应1h后加入0.8ml丙稀酸，继续搅拌3h，得到磁性聚苯乙烯微球。然后加入40％浓
度的氢氟酸3ml，维持搅拌1h，即得中空聚苯乙烯微球。
值得注意的是，设定反应温度后，也可以将加入丙稀酸、氢氟酸的顺序调换下，即
先加入氢氟酸，维持搅拌1h，再加入丙稀酸，继续搅拌3h；也可以得到中空聚苯乙烯微球。
⑵聚苯乙烯微球的活化：取0.2ml中空聚苯乙烯微球用2ml 25mM MES(pH 6.5)缓
冲液稀释，加入60mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，混合均匀，然后搅拌中加入20mg 1-(3-
二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，室温下搅拌反应，洗涤后溶解到2ml
25mM MES(pH 6.5)缓冲液中。
⑶抗体的偶联：向第一步活化洗涤过的微球溶液中加入1.5mg自制中性粒细胞明
胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体溶液，在室温下震荡反应1h。
⑷微球的封闭：向混合液中加入30mg牛血清白蛋白，室温震荡封闭1h。
⑸洗涤、溶解：将反应结束的混合物在16000rpm下离心10min、超声5min洗涤2次，
最后溶解到50mM HEPES，0.5％BSA，0.05％NaN3缓冲液中。
本发明的第四实施方式涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂
盒的制备方法，该制备方法包含以下步骤：
取1.69g硫酸锰和5.4g三氯化铁分别加入50ml溶液中，取1.2g氢氧化钠配制成8ml
溶液，加入到混合溶液中，调节反应温度至70℃，反应1h，得到铁酸锰层厚度尺寸为42nm。加
入2ml油酸，继续搅拌2h，得到油酸性铁酸锰尺寸为48nm，其中油酸层厚度6nm。
取1g 35nm二氧化硅(SiO2)、40mg十二烷基硫酸钠、10ml苯乙烯、8mg过硫酸钾溶于
40ml去离子水中，搅拌均匀。得到聚苯乙烯层厚度为82nm的聚苯乙烯微球，设定反应体系温
度60℃，反应2h后加入0.8ml丙稀酸，继续搅拌5h，得到磁性聚苯乙烯微球。然后加入40％浓
度的氢氟酸3ml，维持搅拌2h，即得中空聚苯乙烯微球。
值得注意的是，设定反应温度后，也可以将加入丙稀酸、氢氟酸的顺序调换下，即
先加入氢氟酸，维持搅拌2h，再加入丙稀酸，继续搅拌5h；也可以得到中空聚苯乙烯微球。
⑵聚苯乙烯微球的活化：取0.2ml中空聚苯乙烯微球用2ml 25mM MES(pH 6.5)缓
冲液稀释，加入20mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，混合均匀，然后搅拌中加入20mg 1-(3-
二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，室温下搅拌反应，洗涤后溶解到2ml
25mM MES(pH 6.5)缓冲液中。
⑶抗体的偶联：向第一步活化洗涤过的微球溶液中加入1.2mg自制中性粒细胞明
胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体溶液，在室温下震荡反应1h。
⑷微球的封闭：向混合液中加入30mg牛血清白蛋白，室温震荡封闭1h。
⑸洗涤、溶解：将反应结束的混合物在18000rpm下离心5min、超声8min洗涤2次，最
后溶解到50mM HEPES，0.5％BSA，0.05％NaN3缓冲液中。
本发明的第五实施方式涉及一种中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂
盒的制备方法，该制备方法包含以下步骤：
取1.69g硫酸锰和5.4g三氯化铁分别加入50ml溶液中，取1.2g氢氧化钠配制成8ml
溶液，加入到混合溶液中，调节反应温度至70℃，反应1h，得到铁酸锰层厚度尺寸为42nm。加
入2.5ml油酸，继续搅拌2h，得到油酸性铁酸锰尺寸为50nm，其中油酸层厚度6nm。
取1g 35nm二氧化硅(SiO2)、40mg十二烷基硫酸钠、10ml苯乙烯、8mg过硫酸钾溶于
40ml去离子水中，搅拌均匀。得到聚苯乙烯层厚度为82nm的聚苯乙烯微球，设定反应体系温
度60℃，反应2h后加入0.8ml丙稀酸，继续搅拌5h，得到磁性聚苯乙烯微球。然后加入40％浓
度的氢氟酸3ml，维持搅拌2h，即得中空聚苯乙烯微球。
值得注意的是，设定反应温度后，也可以将加入丙稀酸、氢氟酸的顺序调换下，即
先加入氢氟酸，维持搅拌2h，再加入丙稀酸，继续搅拌5h；也可以得到中空聚苯乙烯微球。
⑵聚苯乙烯微球的活化：取0.2ml中空聚苯乙烯微球用2ml 25mM MES(pH 6.5)缓
冲液稀释，加入30mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，混合均匀，然后搅拌中加入40mg 1-(3-
二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，室温下搅拌反应，洗涤后溶解到2ml
25mM MES(pH 6.5)缓冲液中。
⑶抗体的偶联：向第一步活化洗涤过的微球溶液中加入1.5mg自制中性粒细胞明
胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体溶液，在室温下震荡反应1h。
⑷微球的封闭：向混合液中加入40mg牛血清白蛋白，室温震荡封闭1h。
⑸洗涤、溶解：将反应结束的混合物在18000rpm下离心5min、超声8min洗涤2次，最
后溶解到100mM HEPES，1％BSA，0.05％NaN3缓冲液中。
在本实施方式中，为了证明加入中空聚苯乙烯微球的检测试剂的稳定性会更高
些，分别对两种试剂进行了实验，一种试剂是含中空聚苯乙烯微球的NGAL试剂，另外一种试
剂是含聚苯乙烯微球的NGAL试剂。
检测步骤为：
1、取稳定性评估批次中空聚苯乙烯微球包被的NGAL R2试剂和聚苯乙烯微球包被
的NGAL R2试剂放置于4℃冰箱中放置12个月后取出检测。
2、取相同配方的R1试剂分成两份分别作为R1试剂
3、检测参数：3/150/50；波长800/570；测光点18～34；
4、检测样本：
①使用线性高值稀释成线性样本检测1次
②检测500ug/L及1000ug/L样本各10次
③检测质控品1(220ug/L)及质控品2(720ug/L)各三次
实验结果如表1～3所示：
表1：
NGAL试剂4℃放置12个月检测线性梯度结果
为了能更直观的看到两种试剂之间的线性偏差，表1中对两种试剂检测的线性梯
度结果对应的曲线图2所示，
表2
NGAL试剂4℃放置12个月CV检测结果
表3
NGAL试剂4℃放置12个月准确度检测结果
实验结果分析：
⑴稳定性好：在试剂有效期内，测试线性样本(30-1000)μg/L范围内，线性绝对偏
差不超过±70μg/L；(1001-5000)μg/L范围内，线性相对偏差不超过±8％。
⑵在试剂有效期范围内，CV≤3％；准确度测定结果为与质控品靶值的相对偏差为
±6％以内。
本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本发明的具体实施例，
而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本发明的精神和范围。